1、细胞分离和细胞培养(1) (1) 制备单一细胞悬液制备单一细胞悬液 组织组织 EDTA EDTA 细胞间连接细胞间连接 消化消化 胰酶胰酶 细胞外基质细胞外基质 多细胞悬液多细胞悬液(2) 分离不同类型细胞A. A. 离心离心 （centrifugationcentrifugation） 大小大小 密度密度 形状形状 小小 轻轻 不规则不规则 大大 重重 圆形圆形B. 细胞的黏附性C. C. 亲和性表面亲和性表面 轻微震荡轻微震荡 消化基质消化基质D. 流式细胞仪(flowcytometer,FCM) 荧光激活细胞分选仪（FACS） 原理：原理： 用带有荧光的特异抗体标记待分用带有荧光的特异抗
2、体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中选离的细胞，然后在流式细胞仪中选出标记细胞。出标记细胞。应用：应用：细胞分选细胞分选: : 1cell in 1000 1cell in 1000 5000 cells/sec 5000 cells/secE. 激光捕捉显微切割技术(Laser capture microdissection,LCM)原理：原理：应用：从组织切片中获取单一细胞应用：从组织切片中获取单一细胞从活体组织分离出特定细胞从活体组织分离出特定细胞,在一定在一定的条件下进行培养的条件下进行培养,使之能够继续生使之能够继续生存、生长以至增殖的一种方法。存、生长以至增殖的一种方法。 in
3、vivo：用动物做实验用动物做实验 in vitro：用培养细胞做实验用培养细胞做实验 (1) 细胞培养的条件(2)细胞培养的不同阶段 细胞系（细胞系（Cell lineCell line）筛选筛选细胞株（细胞株（cell straincell strain）原代培养原代培养传代培养传代培养细胞系细胞系(cell line) (cell line) 原代培养细胞成功传代即为细胞系。原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株（细胞株（cell straincell strain） ：从培养细胞中筛选出的具有特定性：从培养细胞中筛选出的具有特定性 质或标志的细胞群。质或标志的细胞群。功能：功能：培养细
4、胞的特点：培养细胞的特点：（）变异细胞（）变异细胞 可无限增殖、传代可无限增殖、传代 细胞系细胞系（NIH3T3: NIH3T3: 细胞系的来源：细胞系的来源： （）由癌细胞建立的（）由癌细胞建立的“癌细胞系癌细胞系” 特点特点:可在培养皿中以极高的密度增殖，可在培养皿中以极高的密度增殖， 没有扩展的余地时没有扩展的余地时,可向空间生长。可向空间生长。 （）正常细胞经诱导建立的（）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系转化细胞系” 肿瘤病毒肿瘤病毒 放射线放射线 化学致癌物化学致癌物 用癌基因转染正常细胞用癌基因转染正常细胞(3)细胞克隆（Cell cloning）克隆（克隆（cloneclone）
5、：指由同一个祖先细胞通过）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。 群体培养（群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶 中，让细胞贴壁生长，汇合中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层；后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（克隆培养（clonal culture）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁）：培养高度稀释的细胞悬液，细胞贴壁 生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。生长，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。定义在自然或人工条件下，使
6、二个或二个以在自然或人工条件下，使二个或二个以上细胞合并形成一个细胞的过程。上细胞合并形成一个细胞的过程。 生物学方法：仙台病毒生物学方法：仙台病毒 化学方法：化学方法：PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) ) 物理方法：电脉冲打孔仪物理方法：电脉冲打孔仪促融方法促融方法应用细胞周期相关因子的发现细胞周期相关因子的发现B.膜蛋白流动性三、细胞组分的分级分离 方法：方法：用途用途: :原理：制备梯度离心介质原理：制备梯度离心介质, ,分离物按各自的沉降分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。系数以不同的速度沉降而达到分离。梯度梯度特点特点: :梯度平缓梯度平缓，密度较密度较低低( 5%-
7、20%)( 5%-20%)，介，介质的质的 最大密度应小于被分离生物颗粒的最最大密度应小于被分离生物颗粒的最小小 密度。密度。分离效率分离效率: : 取决于沉降系数间的差异。取决于沉降系数间的差异。用途：分离用途：分离 原理：原理：制备梯度离心介质，制备梯度离心介质，样品各成分在梯度介质中样品各成分在梯度介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。将不同密度的成分分离。特点：介质密度高，陡度大特点：介质密度高，陡度大( (20%-70%20%-70%）介质最低
8、密介质最低密 度大于被分离组分的最大密度。度大于被分离组分的最大密度。分离效率分离效率: : 取决于浮力密度间的差异。取决于浮力密度间的差异。由分级分离得到的具有生物功能由分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物。的细胞抽提物。 举例：举例： 1. 1. 线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体 2. 2. 内质网内质网 3.3.蛋白质合成体系蛋白质合成体系(1)(1)分配层析分配层析 纸层析纸层析 薄层层析薄层层析柱层析 分离蛋白质亲和层析 疏水性层析 4.电泳 分析蛋白质、核酸 (2) SDS-PAGE 根据蛋白质分子量、亚单位组成 Western Western 印迹技术印迹技术 将经聚丙稀酰胺凝胶分
9、离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜, ,然后将膜与特异性抗体作用然后将膜与特异性抗体作用, ,膜上特定蛋白条带将与抗体膜上特定蛋白条带将与抗体结合结合, ,并进一步与酶标记二抗反应并进一步与酶标记二抗反应, ,最终以发色底物显色而最终以发色底物显色而被检测被检测. . 基本步骤基本步骤: (1)SDS-PAGE: (1)SDS-PAGE (2) (2)转膜转膜 (3)(3)抗体反应抗体反应 一抗孵育一抗孵育 标记二抗孵育标记二抗孵育 (4)(4)显色显色原理：原理：等电聚焦等电聚焦: : 等电点等电点 SDS-PAGE: SDS-PAGE: 分子量分子
10、量5.质谱技术（2002年诺贝尔化学奖获得者）年诺贝尔化学奖获得者）具体操作过具体操作过 程程： 将胰岛将胰岛细胞与细胞与3H-亮氨酸亮氨酸共同孵育共同孵育5分钟，分钟， 用未标记的亮氨酸冲洗。用未标记的亮氨酸冲洗。 在暗处把感光乳胶覆盖在在暗处把感光乳胶覆盖在切片上存放数日。切片上存放数日。 放射性同位素衰变使乳胶放射性同位素衰变使乳胶感光，经过显影和定影，感光，经过显影和定影，根据感光乳胶黑色银颗粒根据感光乳胶黑色银颗粒所在位置即可知道细胞中所在位置即可知道细胞中放射物质的分布情况放射物质的分布情况。： 大肠杆菌DNA结构的证明B.举例：举例：DNA和RNA在细胞内合成过程用用3 3H-H
11、-胸苷、胸苷、3 3H-H-尿苷渗入细胞尿苷渗入细胞 DNADNA在细胞核中合成在细胞核中合成 RNARNA在细胞核中合成在细胞核中合成 并保留在核内并保留在核内 很快累积于细胞质中很快累积于细胞质中2. 抗体示踪技术C. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体酶酶酶酶酶底物底物显色显色1.聚合酶链式反应克隆DNA片断 (polymerase chain reaction，PCR) （1 1）反应体系：模板链）反应体系：模板链 DNA DNA 聚合酶聚合酶 dNTPdNTP 引物引物 （primerprimer） （2 2）反应步骤：）反应步骤： 变性变性 95 95 退火退火 45456565 延伸延伸 72 72 2.2.核酸电泳核酸电泳3.核酸分子杂交精确检测特定核苷酸序列probe probe. 原位杂交技术（in situ hybridization）3.基因转移技术蛋白质大量表达
