1、1、糖组学、糖组学(glycomics) 的背景及研究意义的背景及研究意义 20 20 世纪末世纪末, ,继基因组学、蛋白质组学之后继基因组学、蛋白质组学之后, ,糖组学也日益受糖组学也日益受到人们关注。顾名思义到人们关注。顾名思义, ,糖组学是对糖链组成及其功能研究糖组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科的一门新学科, ,是基因组学的后续和延伸是基因组学的后续和延伸, ,具体内容具体内容包括研究包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用作用, ,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物其主要研究对象为聚糖。丰富
2、多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞有机体的所有细胞, ,不仅体现细胞的类型和状态不仅体现细胞的类型和状态, ,也参与了许也参与了许多生物学行为多生物学行为, ,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、免疫反应等免疫反应等; ;聚糖还体现生物和分子的进化作用聚糖还体现生物和分子的进化作用, ,如糖酵解、如糖酵解、生物合成的保守性以及核糖的起源等。生物合成的保守性以及核糖的起源等。示例：示例： 糖链的生物学功能糖链的生物学功能（1）糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用糖链在糖蛋白新生肽链折叠和缔合中的作用 研究表明：糖蛋白研究表明：糖蛋白N-糖链在参与新
3、生肽的折叠，维持蛋白糖链在参与新生肽的折叠，维持蛋白质正确构象时起重要作用。质正确构象时起重要作用。红细胞血凝素，如红细胞血凝素，如N-糖链糖链缺乏缺乏,则不能折叠呈三聚体则不能折叠呈三聚体（2）糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性糖链影响糖蛋白的分泌和稳定性免疫球蛋白如缺乏免疫球蛋白如缺乏N-糖链则不糖链则不能分泌到胞外而留在内质网中能分泌到胞外而留在内质网中（3）糖链参与分子识别和细胞识别糖链参与分子识别和细胞识别 血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的血清中很多蛋白质式含有以唾液酸残基为末端的N-N-糖链糖蛋糖链糖蛋白，称唾液酸糖蛋白，如免疫球蛋白、蛋白质激素，载体蛋白等。白，称唾液酸糖蛋白
4、，如免疫球蛋白、蛋白质激素，载体蛋白等。如被唾液如被唾液酸酶降解酸酶降解与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体结合胞吞作用并降解胞吞作用并降解与血浆中老蛋白的清除有关与血浆中老蛋白的清除有关与精卵识别有关与精卵识别有关 受精是精子与卵子的受精是精子与卵子的融合。哺乳动物的卵子外融合。哺乳动物的卵子外面有一层透明的糖蛋白外面有一层透明的糖蛋白外衣，称透明带（衣，称透明带（zone zone pelluci da,ZPpelluci da,ZP) )。透明带。透明带由由ZP-1ZP-1、ZP-2ZP-2和和ZP-3ZP-3三种三种糖蛋白组成糖蛋白组成, ,受精中起主要
5、受精中起主要作用的是作用的是ZP-3,ZP-3,连接在连接在ZP-3ZP-3上的上的O -GalNAcO -GalNAc糖链能被精糖链能被精子表面上的凝集素受体识子表面上的凝集素受体识别别( (有物种特异性有物种特异性) )。O -O -GalNAcGalNAc糖链的非还原端是糖链的非还原端是一个一个一连接的半乳糖残一连接的半乳糖残基基, ,它可能在精卵识别中起它可能在精卵识别中起关键作用。关键作用。与细胞粘着有关与细胞粘着有关 细胞粘着细胞粘着(cell adhesion)(cell adhesion)是进化中随着多细胞生物出现的是进化中随着多细胞生物出现的必然现象。多细胞生物中细胞有相互识
6、别而聚集成细胞群的能必然现象。多细胞生物中细胞有相互识别而聚集成细胞群的能力力细胞粘着。细胞群或组织细胞粘着。细胞群或组织(tissue)(tissue)中细胞与细胞之间充满中细胞与细胞之间充满着由糖蛋白着由糖蛋白( (胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白胶原蛋白、纤连蛋白、层粘蛋白) )、蛋白聚糖、透明、蛋白聚糖、透明质酸等组成的胞外基质质酸等组成的胞外基质(extracellular(extracellular matrix,ECM) matrix,ECM)。在整个生。在整个生物体中物体中,ECM,ECM形成一个连续的主体网络结构形成一个连续的主体网络结构, ,所有的细胞都交织或所有的细胞都交织或
7、浸泡在这一网状基质中浸泡在这一网状基质中, ,网络中细胞一细胞粘着网络中细胞一细胞粘着, ,细胞一细胞一ECMECM粘着粘着都是通过有关的膜内在蛋白质都是通过有关的膜内在蛋白质(integral membrane protein)(integral membrane protein)完完成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子成的。这些膜蛋白称细胞粘着分子(cell adhesion molecule, (cell adhesion molecule, CAM)CAM)或粘着蛋白或粘着蛋白, ,包括包括整联蛋白整联蛋白(integrin(integrin),),钙粘着蛋白钙粘着蛋白(cadher(cad
8、her -in)-in)免疫球蛋白超家族免疫球蛋白超家族(Ig superfamily(Ig superfamily),),血管地址素血管地址素(vescular addressin(vescular addressin) ) 选择蛋白选择蛋白(selectin(selectin) )等。等。CAM CAM 绝大多数绝大多数都是含都是含N N一糖链的糖蛋白一糖链的糖蛋白. .例如整联蛋白是由例如整联蛋白是由一和一和一亚基组成一亚基组成的异二聚体的异二聚体, ,两个亚基上有多个两个亚基上有多个N N一糖基化位点。去糖链的整联蛋一糖基化位点。去糖链的整联蛋白完全失去与纤连蛋白的粘着能力白完全失去与
9、纤连蛋白的粘着能力。 （4）糖链影响糖蛋白的生物学活性糖链影响糖蛋白的生物学活性糖链与酶活性糖链与酶活性 糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等糖链在酶的新生肽链折叠、转运和保护等方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关方面普遍起作用。但糖链与成熟酶活性的关系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响系因酶而异。有些酶除去糖链活性不受影响,如如UDP-葡糖醛酸酶葡糖醛酸酶、酵母羧肽酶等。有些酶、酵母羧肽酶等。有些酶的活力依赖其糖链的存在，的活力依赖其糖链的存在， 如如溶酶体溶酶体一葡一葡糖苷酶糖苷酶除去糖链后只有免疫活性而而完全没除去糖链后只有免疫活性而而完全没有酶活力。有酶活力。糖链与激素活性糖链与激
10、素活性 糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括糖蛋白激素主要有腺垂体促激素类包括FSH(促卵泡激促卵泡激素素),LH(促黄体生成激素促黄体生成激素)和和TSH(促甲状腺促甲状腺 激素激素)以及胎盘绒毛以及胎盘绒毛膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素膜促性腺激素和肾脏红细胞生成素(erytlmpoietin,EPO)等。等。 FSH、LH和和TSH均由均由亚基和亚基和亚基组成亚基组成,两个亚基都有两个亚基都有N一糖一糖链。糖链呈高度不均一性链。糖链呈高度不均一性,例如例如LH和和TSH中精链的外链末端有中精链的外链末端有些为些为SO4-4GalNAc 1，有些为，有些为Sia 2 3Gal 1,而而FSH
11、中中的糖链都是以的糖链都是以 Sia 2 3Gal 1为末端的。已经证明，带为末端的。已经证明，带有有SO4-4GalNAc 1末端结构的激素对受体的亲和力比带有末端结构的激素对受体的亲和力比带有Sia 2 3Gal 1末端的激素高，但在体内的半寿期前者比末端的激素高，但在体内的半寿期前者比后者短后者短,因为在肝脏网状细胞表面有特异结合因为在肝脏网状细胞表面有特异结合SO4-4GalNAc 1为末端的糖链的受体为末端的糖链的受体,而而Sia为末端的糖链则必须经唾液酸为末端的糖链则必须经唾液酸酶水解除去酶水解除去Sia从而暴露从而暴露Gal后才能被半乳糖结合受体识别并后才能被半乳糖结合受体识别并
12、清除。清除。 糖链与糖链与IgG 活性活性 每分子每分子IgGIgG 均含糖链约三条，几乎全部均含糖链约三条，几乎全部N N一糖链都是复杂型一糖链都是复杂型, ,非还原末端残基为非还原末端残基为SiaSia或或Gal(Gal(去去SiaSia),),少数为少数为GlcNAc(GlcNAc(去去Sia-Gal), Sia-Gal), IgGIgG的的N-N-糖链多达糖链多达3030余种余种, ,呈高呈高 度不均一性。如度不均一性。如IgGIgG的的N N一糖链缺一糖链缺失外链失外链Gal (Gal (这种糖链称这种糖链称G G0 0 糖链糖链）后）后, ,可成为一种自身抗原可成为一种自身抗原,
13、,被免被免疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有疫系统识别而产生自身抗体。后者能与带有GoGo糖链的糖链的IgIg G G生成生成免免疫复合体疫复合体，沉积于关节腔内，沉积于关节腔内, ,引起炎症。这种免疫复合体是引起炎症。这种免疫复合体是由带由带GoGo糖链的糖链的IgGFcIgGFc段段( (作为抗原作为抗原) )和带末端和带末端SiaSia的的IgGIgG( (作为抗体作为抗体)Fab)Fab段结合而成段结合而成, ,实际上是实际上是IgGIgG的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑的自身聚合物。类风湿性关节炎、红斑狼疮狼疮等都是一种与等都是一种与IgGIgG的糖链结构改变有关的自身免疫病的
14、糖链结构改变有关的自身免疫病(autoimmune disease)(autoimmune disease)。类风湿关节炎类风湿关节炎 总总 之之 毫无疑问毫无疑问, ,如果试图深入了解生命的复杂规如果试图深入了解生命的复杂规律律, ,就必须有就必须有“基因组蛋白质组糖组基因组蛋白质组糖组”的整体观念的整体观念, ,这样才有可能揭示自身全部基这样才有可能揭示自身全部基因功能因功能, ,从而进一步深入研究疾病的发病机从而进一步深入研究疾病的发病机制制, ,有效控制疾病的发生、发展及预后有效控制疾病的发生、发展及预后, ,以以及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的
15、药物靶标。药物靶标。2、糖组学的研究策略糖组学的研究策略 糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。 目前糖组学关注的焦点是糖蛋白目前糖组学关注的焦点是糖蛋白, ,为了更好地与蛋白质组学相为了更好地与蛋白质组学相关联关联, ,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为: : (1) (1) 分析单物种生物所产生的所有聚糖分析单物种生物所产生的所有聚糖; ; (2) (2) 以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因; ; (3) (3) 结合有效的理化和生化性质结合有效的理化和生化性质, ,研
16、究糖蛋白糖链的性质。研究糖蛋白糖链的性质。 研究的重点在于研究的重点在于: : (1) (1) 编码糖蛋白的基因编码糖蛋白的基因; ; (2) (2) 实际糖基化的位点实际糖基化的位点; ; (3) (3) 聚糖结构聚糖结构; ; (4) (4) 糖基化的作用。糖基化的作用。 主要分为三大部分主要分为三大部分: : 结构糖组学、功能糖组学以及生物信息结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学学; ;其中结构糖组学主要包括其中结构糖组学主要包括“糖捕获糖捕获”技术、前沿亲和层析技术、前沿亲和层析技术等技术等, ,功能糖组学主要包括微阵列技术等。功能糖组学主要包括微阵列技术等。3、糖组学研究技术进展、糖
17、组学研究技术进展1 1）结构糖组学）结构糖组学 根据与糖链连接方式不同根据与糖链连接方式不同, ,蛋白质主要有蛋白质主要有N N连接连接和和O O连接连接两种糖基化形式两种糖基化形式: : 前者是糖链与蛋白前者是糖链与蛋白AsnAsnXXXXXXSer/ThrSer/Thr 序列子序列子(XXX (XXX 为除脯氨酸以为除脯氨酸以外的氨基酸外的氨基酸) ) 中中AsnAsn 残基上的残基上的 NH2 NH2 相连相连; ;后者后者则是糖链与蛋白则是糖链与蛋白Ser/ThrSer/Thr 残基上的残基上的OHOH 相连。相连。N N连接和连接和O O连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面连接糖蛋白主要定
18、位于细胞膜表面, ,也可以分泌型蛋白的形式存在。此外也可以分泌型蛋白的形式存在。此外, ,糖蛋白还糖蛋白还有有GPIGPI锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现的的O OGlcNAcGlcNAc（N-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖 ）修饰蛋白两）修饰蛋白两种存在形式。种存在形式。A、 N糖链糖链N-糖链的共同结构花式：核心五糖糖链的共同结构花式：核心五糖Glc-葡萄糖；葡萄糖；Gal-半乳糖；半乳糖；Man-甘露糖甘露糖 ；Fru-果糖果糖Rib-核糖；核糖；Fuc-岩藻糖；岩藻糖；Sia-唾液酸；唾液酸；GlcA-葡糖酸葡糖酸GlcUA-糖醛酸；糖醛酸；G
19、lcNAc N-乙酰葡萄糖胺；乙酰葡萄糖胺；GalNAc N-乙酰半乳糖胺；乙酰半乳糖胺；NeuNAc N-乙酰神经氨酸乙酰神经氨酸N-糖链的分类糖链的分类复杂型复杂型N-糖链的分支糖链的分支B、 O糖链糖链特点：与特点：与N-糖链相比结构简单，但连接形式多。糖链相比结构简单，但连接形式多。几种糖蛋白的寡糖链几种糖蛋白的寡糖链小小 结结 糖链结构信息包括糖链的糖链结构信息包括糖链的单糖组成、异头单糖组成、异头碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序列分析列分析等内容。糖蛋白糖链的结构分析包等内容。糖蛋白糖链的结构分析包括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结括糖蛋白
20、的提取分离、糖链释放和糖链结构鉴定等多个步骤。构鉴定等多个步骤。（1）糖蛋白的提取和分离纯化）糖蛋白的提取和分离纯化 糖蛋白多定位于细胞表面糖蛋白多定位于细胞表面, ,属于膜蛋白属于膜蛋白, ,水溶性不水溶性不好好, ,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜一。目前常采用先制备质膜, ,然后用然后用CHAPS CHAPS 等去等去污剂释放或污剂释放或Triton XTriton X114 114 相分离、有机溶剂萃相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用透透析、超滤、电泳和层
21、析等析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化方法来分离纯化, ,其中其中由由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析亲合层析(serial lectin(serial lectin affinity affinity chromatography, SLAC)chromatography, SLAC) 法是较好的方法。法是较好的方法。SLACSLAC 研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/ /糖链
22、。糖链。用于纯化糖蛋白用于纯化糖蛋白/ /糖链的植物凝集素主要有糖链的植物凝集素主要有刀豆凝集素刀豆凝集素(concanavalin(concanavalin A, Con A) A, Con A)、麦胚凝集素、麦胚凝集素(wheat germ (wheat germ agglutinin, WGA)agglutinin, WGA)、豌豆外源凝集素、豌豆外源凝集素(pea lectin(pea lectin) )、植物血、植物血凝素凝素(phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) (phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) 和网孢盘菌凝集和网孢盘菌凝集
23、素素( (Aleuria aurantiaAleuria aurantia lectin,AALlectin,AAL) )等。单一一种凝集素并等。单一一种凝集素并不能够富集细胞中所有的糖蛋白不能够富集细胞中所有的糖蛋白/ /糖链，因此科学家们在上糖链，因此科学家们在上世纪世纪8080年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱(serial (serial lectin affinitychromatographylectin affinitychromatography, SLAC), SLAC)的方法来分离同一的方法来分离同一细胞中的各种糖蛋白细胞中的各种糖
24、蛋白/ /糖链。这种方法是将不同的凝集素亲糖链。这种方法是将不同的凝集素亲和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可将不同的糖蛋白将不同的糖蛋白/ /糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白/ /糖糖链的回收效率和混合糖蛋白链的回收效率和混合糖蛋白/ /糖链的分离效果。糖链的分离效果。The lectins tested recognize the following residues: -D-galactosyl Ricinus communis agglutinin 120, (RCA-1) and
25、peanut agglutinin, (PNA); -D-galactosyl Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA); -D-mannosyl-D- glucosyl concanavalin A (ConA) and Lens culinaris agglutinin (LcH); N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acid Limax flavus agglutinin (LFA) andLimulus polyphemus agglutinin (LPA); N-acetyl-glucosaminyl and
26、 sialyl wheat germ agglutinin (WGA); N-acetyl-D-galactosaminyl Helix pomatia agglutinin (HPA) and Dolichos biflorus agglutinin (DBA) and -L-fucosyl Ulex europeus agglutinin (UEA-1).（2）糖链的释放糖链的释放 纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放。糖链释放一般纯化后的糖蛋白样品即可进行糖链释放。糖链释放一般有化学释放和酶释放两种方法。有化学释放和酶释放两种方法。 化学法主要有化学法主要有肼解法和肼解法和消除法消除法,
27、,前者可释放糖蛋白的前者可释放糖蛋白的N N糖链和糖链和O O糖链糖链, ,目前已实现仪器自动化。但因该法反目前已实现仪器自动化。但因该法反应条件剧烈应条件剧烈, ,肼解后需对糖链进行乙酰化复原处理肼解后需对糖链进行乙酰化复原处理, ,而且而且蛋白部分已经破坏蛋白部分已经破坏, ,无法进行有关糖基化位点的研究。无法进行有关糖基化位点的研究。 酶法释放糖蛋白糖链因方法简单酶法释放糖蛋白糖链因方法简单, ,条件温和条件温和, ,能够提供有能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的或或构型等信构型等信息息, ,目前应用较广。较常用的释放目前应用较广。较常用的释放N
28、 N糖链的特异蛋白酶糖链的特异蛋白酶有有N N糖肽酶糖肽酶F(PNGaseF(PNGase F) F) 和和N N糖肽酶糖肽酶A(PNGaseA(PNGase A) A) , ,二二者具有很好的互补性者具有很好的互补性, ,常联合使用。而常联合使用。而PNGasePNGase F F 因广谱因广谱性好性好, ,也常单独使用。对于特异释放糖蛋白也常单独使用。对于特异释放糖蛋白O O糖链的酶糖链的酶, ,目前发现的较少目前发现的较少, ,且广谱性不强。且广谱性不强。（3）糖链的分离纯化糖链的分离纯化A、层析法、层析法 柱层析柱层析是分离纯化糖蛋白糖链的常规方法是分离纯化糖蛋白糖链的常规方法, ,由
29、分离机制不由分离机制不同可以有同可以有离子交换、分子筛、正相和反相离子交换、分子筛、正相和反相等不同形式。等不同形式。一般常压和低中压柱层析所需样品量较大一般常压和低中压柱层析所需样品量较大, ,而高效液相层而高效液相层析析( (HPLCHPLC) ) 因上样量少、灵因上样量少、灵 敏度高、重现性好、更加快敏度高、重现性好、更加快速和自动化速和自动化, ,是目前微量糖链分析的首选。不同结构的糖是目前微量糖链分析的首选。不同结构的糖链在不同链在不同HPLCHPLC上的层析行为是不同的。上的层析行为是不同的。 为了更充分、更准确地分离分析糖链混合物为了更充分、更准确地分离分析糖链混合物, ,可将几
30、种不可将几种不同类型的同类型的HPLC HPLC 组合成多维组合成多维HPLC (MDHPLC (MDHPLC) ,HPLC) ,如离子交如离子交换换HPLCHPLC、正相、正相HPLCHPLC、反相、反相HPLC HPLC 组合就构成了组合就构成了3D3DHPLCHPLC。为达到最大分离效率为达到最大分离效率, ,各维之间的分离模式应是各自独立各维之间的分离模式应是各自独立的的, ,而且高维的分离速度应快于低维的分离速度而且高维的分离速度应快于低维的分离速度, ,以避免以避免已分开组分的重新混合。已分开组分的重新混合。 前沿亲合层析前沿亲合层析(FAC)(FAC) 是近年来新兴的利用亲合层析
31、技术是近年来新兴的利用亲合层析技术定量分析两生物分子间结合程度的研究工具定量分析两生物分子间结合程度的研究工具, ,具有简单、具有简单、经济、准确和可操作性强等优点。在糖蛋白糖链结构研经济、准确和可操作性强等优点。在糖蛋白糖链结构研究中究中,FAC ,FAC 常应用凝集素微柱来分离纯化和富集浓缩特定常应用凝集素微柱来分离纯化和富集浓缩特定糖蛋白糖蛋白, ,而多元凝集素微柱的组合可以实现糖链的结构解而多元凝集素微柱的组合可以实现糖链的结构解析。析。 HirabayashiHirabayashi 等将等将13 13 种半乳凝素制成种半乳凝素制成 FAC FAC 微柱微柱, ,观察了观察了它们与它们
32、与41 41 种种2 2AP AP 标记糖链间的特异结合情况。结果表标记糖链间的特异结合情况。结果表明半乳凝素可结合明半乳凝素可结合N N乙酰乳糖胺的乙酰乳糖胺的3 3 个羟基个羟基, ,而不结合而不结合糖脂糖链和复杂型糖脂糖链和复杂型N N糖链等结构。糖链等结构。FAC FAC 微柱与电喷雾质微柱与电喷雾质谱联用谱联用( FAC( FACMS) MS) 可对糖链混合物进行有效的分离分析可对糖链混合物进行有效的分离分析, , 功能强大。功能强大。B、电泳法、电泳法 硫酸化、唾液酸化的糖链可用电泳法分离硫酸化、唾液酸化的糖链可用电泳法分离纯化。中性糖链通过与硼酸作用形成带电纯化。中性糖链通过与硼
33、酸作用形成带电的复合物的复合物, ,也可用电泳分离。电泳技术不仅也可用电泳分离。电泳技术不仅可以对糖蛋白糖链进行一定的分离纯化可以对糖蛋白糖链进行一定的分离纯化, ,还还可以给出其相关的结构信息。荧光辅助糖可以给出其相关的结构信息。荧光辅助糖电泳电泳(FACE) (FACE) 、毛细管电泳、毛细管电泳(CE) (CE) 等是糖链等是糖链分离纯化、结构解析的常用工具。分离纯化、结构解析的常用工具。（4）糖链结构的解析 分析糖复合物中的糖链结构是糖组学研究分析糖复合物中的糖链结构是糖组学研究的核心内容之一，如何能快速准确测定糖的核心内容之一，如何能快速准确测定糖链的结构成为糖生物学家最为关心的问题
34、。链的结构成为糖生物学家最为关心的问题。 目前主要有目前主要有3 3种方法：种方法： 基于基于DNADNA测序仪的荧光糖电泳测序仪的荧光糖电泳 用于糖链结构解析的质谱分析法用于糖链结构解析的质谱分析法 核磁共振技术核磁共振技术A、基于基于DNADNA测序仪的荧光糖电泳测序仪的荧光糖电泳 荧光分子标记的单糖或多糖分子可以在荧光分子标记的单糖或多糖分子可以在20%20%40% 40% 聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶中得到分离，同时检测荧光并与标准品进行比较即可得到相应胶中得到分离，同时检测荧光并与标准品进行比较即可得到相应的糖分子信息。但是由于普通的电泳胶的大小限制，无法得到彻的糖分子信息。但是由于普
35、通的电泳胶的大小限制，无法得到彻底的分析结果。底的分析结果。 基于以上的优缺点，基于以上的优缺点，CallewaertCallewaert 等开发了一种基于等开发了一种基于DNADNA测序仪的测序仪的荧光糖电泳荧光糖电泳(DNA sequencer-assisted,fluorophore-(DNA sequencer-assisted,fluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresisassistedcarbohydrateelectrophoresis, DSAFACE), DSAFACE)用于测定用于测定N- N- 糖链的结构。糖链的结构。 基
36、本程序是，先用酶切割糖链，然后用荧光物标记糖链，再用高基本程序是，先用酶切割糖链，然后用荧光物标记糖链，再用高分辨率的分辨率的ABI-377A ABI-377A 型型DNA DNA 测序仪进行电泳，最后用测序仪进行电泳，最后用GenescanGenescan 软软件对结果进行分析。件对结果进行分析。 实验结果表明，用内切酶消化后再进行电泳，可检测到质谱无法实验结果表明，用内切酶消化后再进行电泳，可检测到质谱无法达到的飞摩尔水平的聚糖或皮摩尔水平的糖蛋白上的糖链，其中达到的飞摩尔水平的聚糖或皮摩尔水平的糖蛋白上的糖链，其中飞摩尔水平的壳四糖检测信号的信噪比超过飞摩尔水平的壳四糖检测信号的信噪比超
37、过4 4 。而且在结构分析。而且在结构分析方面得到的信息与用基质辅助激光解析离子化飞行质谱所得到的方面得到的信息与用基质辅助激光解析离子化飞行质谱所得到的结构信息完全一致结构信息完全一致B B、用于糖链结构解析的质谱分析法、用于糖链结构解析的质谱分析法 到目前为止，质谱仍是糖生物学家应用最为广泛的测定到目前为止，质谱仍是糖生物学家应用最为广泛的测定糖链结构的工具。糖链结构的工具。快原子轰击质谱快原子轰击质谱(fast atom (fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)bombardment mass spectrometry, FAB-
38、MS)、电喷雾质电喷雾质谱谱(electrospray(electrospray mass spectrometry, ES-MS) mass spectrometry, ES-MS)、基质辅基质辅助激光解析离子化飞行质谱助激光解析离子化飞行质谱(matrix-assisted laser (matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight mass desorptionionization time-of-flight mass spectrometry,MALDIspectrometry,MALDI-TOF-MS)-TOF-
39、MS)是目前在糖链结构测定方是目前在糖链结构测定方面应用广泛的面应用广泛的3 3 种质谱，它们可以直接对样品进行离子种质谱，它们可以直接对样品进行离子化和解析作用以获得信息，而且可以对完整的糖复合物化和解析作用以获得信息，而且可以对完整的糖复合物或者是片段化的样品进行分析。或者是片段化的样品进行分析。 质谱法测定糖链的另一个优点是可以与蛋白质分离设备，质谱法测定糖链的另一个优点是可以与蛋白质分离设备，如如H P L C H P L C 、C E C E 等进行联用，在等进行联用，在H P L CH P L C和和CECE上分离的上分离的糖蛋白或寡糖可以直接进入质谱进行结构分析，这样就糖蛋白或寡
40、糖可以直接进入质谱进行结构分析，这样就避免了在样品进行转运过程中的污染和损失，提高了分避免了在样品进行转运过程中的污染和损失，提高了分析效率和准确度析效率和准确度C、核磁共振技术（核磁共振技术（NMR） 目前目前,NMR ,NMR 技术已成为糖链立体化学结构分析最技术已成为糖链立体化学结构分析最重要的方法之一重要的方法之一, ,可确定糖链的构型、连接位置、可确定糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性。分支和微观多样性。 Shaw Shaw 等利用二维等利用二维1H NMR1H NMR技术对维持花生过氧化技术对维持花生过氧化物酶稳定的物酶稳定的3 3 个糖链进行了结构分析。个糖链进行了结构分析。
41、 KogelbergKogelberg 等利用等利用ESIESIMS MS 和和1H NMR1H NMR技术发现了技术发现了人乳中新的糖链结构。人乳中新的糖链结构。 但但NMR NMR 测定糖的讯号峰重叠严重测定糖的讯号峰重叠严重, ,解析较难解析较难, ,灵敏灵敏度不高度不高, ,而且多维而且多维NMR NMR 需要毫克级样品需要毫克级样品, ,这对多数这对多数糖复合物中的微量糖链是很难达到的。糖复合物中的微量糖链是很难达到的。2）功能糖组学研究技术 随着糖组学研究的深入，基于芯片的原理随着糖组学研究的深入，基于芯片的原理人们发明了用于糖组研究的各类糖芯片。人们发明了用于糖组研究的各类糖芯片
42、。自自Wang Wang 等首次报道用糖芯片进行研究以来，等首次报道用糖芯片进行研究以来，这种方法得到了广泛的应用。由于其具有这种方法得到了广泛的应用。由于其具有信息量大、可进行自动化操作等特点，就信息量大、可进行自动化操作等特点，就如基因芯片对于基因研究和蛋白质芯片对如基因芯片对于基因研究和蛋白质芯片对于蛋白质组研究一样，糖芯片在糖组学的于蛋白质组研究一样，糖芯片在糖组学的研究中同样也将扮演重要的角色。研究中同样也将扮演重要的角色。（1）研究凝集素）研究凝集素-糖相互作用的芯片糖相互作用的芯片 根据凝集素和寡糖之间的特异性相互作用，将寡根据凝集素和寡糖之间的特异性相互作用，将寡糖或糖基复合物
43、固定于芯片上，再用荧光素标记糖或糖基复合物固定于芯片上，再用荧光素标记的凝集素进行杂交，检测阳性信号分析与已知凝的凝集素进行杂交，检测阳性信号分析与已知凝集素相互作用的寡糖结构。这种方法的最大优点集素相互作用的寡糖结构。这种方法的最大优点是可以同时检测多个样本，具有批量化、标准化是可以同时检测多个样本，具有批量化、标准化和自动化的特点。和自动化的特点。 NimrichterNimrichter等采用含有等采用含有200200个点的糖芯片研究鸡个点的糖芯片研究鸡肝细胞对糖的吸附情况。研究表明表面含有肝细胞对糖的吸附情况。研究表明表面含有C C 型型凝集素的鸡肝细胞可以特异结合到以各种链接方凝集素
44、的鸡肝细胞可以特异结合到以各种链接方式固定的式固定的N- N- 乙酰葡萄糖胺残基的非还原性末端，乙酰葡萄糖胺残基的非还原性末端，而不能与半乳糖或而不能与半乳糖或N- N- 乙酰半乳糖胺的非还原性乙酰半乳糖胺的非还原性末端结合。末端结合。（2）杂交糖类）杂交糖类/糖蛋白芯片糖蛋白芯片 RatnerRatner等开发出一种杂交糖类等开发出一种杂交糖类/ /糖蛋白芯片，可以快速测糖蛋白芯片，可以快速测定在结合过程中，蛋白质定在结合过程中，蛋白质- - 蛋白质相互作用和糖类蛋白质相互作用和糖类- - 蛋蛋白质相互作用的主反应一方。通过将糖蛋白和它表面的白质相互作用的主反应一方。通过将糖蛋白和它表面的寡
45、糖都点到点阵上，就可以迅速证实结合的决定簇。寡糖都点到点阵上，就可以迅速证实结合的决定簇。 将将GAPS II GAPS II 型玻片用两种化学物质进行表面修饰，在一型玻片用两种化学物质进行表面修饰，在一侧用马来酰亚胺修饰，另一侧用侧用马来酰亚胺修饰，另一侧用N-N-羟基丁二酰亚胺羟基丁二酰亚胺(N-(N-hydroxysuccinimide,NHShydroxysuccinimide,NHS) )活化的酯进行修饰。然后分别活化的酯进行修饰。然后分别将糖和糖蛋白点在同一张芯片的马来酰亚胺侧和将糖和糖蛋白点在同一张芯片的马来酰亚胺侧和N H S N H S 活化的酯一侧，用一种糖结合蛋白杂交来确
46、定蛋白肽是活化的酯一侧，用一种糖结合蛋白杂交来确定蛋白肽是否是结合时所必需的成分。否是结合时所必需的成分。 Adams Adams 等应用这种技术证实了在等应用这种技术证实了在HIVHIV表面的糖蛋白表面的糖蛋白gp120gp120与人类蛋白相互作用过程中，与人类蛋白相互作用过程中，gp120 gp120 的糖链起到了至关的糖链起到了至关重要的作用。重要的作用。（3）用于研究蛋白质）用于研究蛋白质-糖相互作用的表面质子共糖相互作用的表面质子共振技术振技术 为了监测凝集素和固定化糖在玻片表面的相互作用，糖为了监测凝集素和固定化糖在玻片表面的相互作用，糖生物学家于上世纪生物学家于上世纪9090年代
47、将表面质子共振年代将表面质子共振(surface (surface plasmonplasmon resonance, SPR) resonance, SPR)光谱应用于分析。光谱应用于分析。 该技术是利用了物理光学的原理，在研究两分子相互作该技术是利用了物理光学的原理，在研究两分子相互作用时，将一种分子固定在传感片表面，而含有另一种分用时，将一种分子固定在传感片表面，而含有另一种分子的溶液流过其表面，两种分子的结合会使传感片表面子的溶液流过其表面，两种分子的结合会使传感片表面的折射率改变，因此检测两分子间的相互作用。这种技的折射率改变，因此检测两分子间的相互作用。这种技术不仅可以时时监测两种
48、分子的结合情况，还可以测量术不仅可以时时监测两种分子的结合情况，还可以测量结合亲和力的强弱。结合亲和力的强弱。 SmithSmith等将等将SPR SPR 技术用于分析刀豆凝集素技术用于分析刀豆凝集素Con A Con A 与甘露糖与甘露糖和木菠萝凝集素和木菠萝凝集素jacalinjacalin与半乳糖的相互作用。与半乳糖的相互作用。 SPR SPR 在糖芯片中的应用为糖组学研究提供了一种有力的在糖芯片中的应用为糖组学研究提供了一种有力的研究工具。人们可以用它快速测定糖与凝集素或蛋白质研究工具。人们可以用它快速测定糖与凝集素或蛋白质之间的特异性作用，还可以对它们之间相互作用的增强之间的特异性作
49、用，还可以对它们之间相互作用的增强剂或抑制剂进行高通量筛选分析剂或抑制剂进行高通量筛选分析。3）生物信息学 糖蛋白糖链研究的信息处理、归纳分析以及糖链结构检糖蛋白糖链研究的信息处理、归纳分析以及糖链结构检索都要借助生物信息学来进行。目前这方面的数据库和索都要借助生物信息学来进行。目前这方面的数据库和网络信息很多网络信息很多, ,其中其中CFGCFG、KEGGKEGG和和CCSD CCSD 等就是糖蛋白糖链等就是糖蛋白糖链结构研究的很好资源。结构研究的很好资源。 比如利用比如利用CFGCFG可以查找糖链亚结构、分子量和组成等许多可以查找糖链亚结构、分子量和组成等许多参数参数; ;而而CCSD C
50、CSD 收集的众多糖链结构数据为糖谱的构建和收集的众多糖链结构数据为糖谱的构建和糖链结构查新提供了很好的保障。糖链结构查新提供了很好的保障。 目前目前, ,借助生物信息学构建的标准糖谱已成为样品糖链结借助生物信息学构建的标准糖谱已成为样品糖链结构鉴定的主要工具构鉴定的主要工具, ,但其强大功能的发挥还有赖于相关应但其强大功能的发挥还有赖于相关应用软件、数据库资源和计算机网络的发展和完善。用软件、数据库资源和计算机网络的发展和完善。 可以说可以说, ,生物信息学是糖组学糖蛋白糖链结构分析技术平生物信息学是糖组学糖蛋白糖链结构分析技术平台不可缺少的一项台不可缺少的一项, ,是国际合作和资源共享的结
