1、高效液相色谱法测定饮料中山高效液相色谱法测定饮料中山梨酸、苯甲酸和糖精钠梨酸、苯甲酸和糖精钠 1.掌握高效液相色谱法测定饮料中糖精 钠、苯甲酸和山梨酸的原理和方法 2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法 3.了解高效液相色谱仪的仪器结构 目的与要求 方法原理方法原理 在适宜的条件下,高效液相色谱可同时分离饮料中的糖精钠、苯甲酸、山梨酸。样品 超声除去二氧化碳和乙醇,调pH至近中性,过滤后进高效液相色谱仪 ,经反相C18 液相色谱分离后,紫外检测器230nm波长处检测。 以色谱峰的保留时间定性,利用色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行 定量 1.仪器仪器: 高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器
2、; 超声波清洗仪; 50ml容量瓶;50ml烧杯;50l微量进样器 仪器与试剂仪器与试剂 糖精钠标准储备溶液 (10.0mg/ml): 准确称取于120烘干4h后的糖精钠(C6H4CONNaSO22H2O)0.5000g,加水溶解 后定容至50ml 苯甲酸标准储备溶液 (5.0mg/ml): 准确称取0.2500g,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解, 定容至50ml 山梨酸标准储备溶液 (5.0mg/ml): 准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶 解,定容至50ml 标准混合使用液 (含糖精钠1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):准确吸取各
3、标准储备溶液 5.0ml,加水定容至 50ml 2.试剂: 稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液:20g/L;甲醇(色谱纯) 2.2.配制标准系列配制标准系列: : 取9只50ml容量瓶分别编上号码,按下表配制标准系列。 编号 0 1 2 3 4 5 标混液(ml) 0.00 1.25 2.5 5 10 20 蒸馏水(ml) 50.0 48.75 47.5 45 40 30 标混号 苯甲酸 (mg/mL) A苯甲酸 山梨酸 (mg/mL) A山梨酸 糖精钠 (mg/mL) A糖精钠 0 0 0 0 0 0 0 1 0.0125 438087 0.0125 734303 0.025 549756 2
4、0.025 853079 0.025 1473579 0.05 1127033 3 0.05 1672944 0.05 2907282 0.1 2246299 4 0.1 3392191 0.1 5909618 0.2 4599025 5 0.2 6741197 0.2 11767460 0.4 9167288 混合标样中各物质的浓度混合标样中各物质的浓度 样品 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 标准曲线方程 Y=3 107X-55.2 Y=6 107X-37513 Y=2 107X-53409 r 1 1 1 线性范围(mg/mL) 00.2 00.2 00.4 1.样品处理样品处理:吸取10.002
5、0.00ml汽水,放入50ml烧 杯中, 超声除去二氧化碳,用稀氨水调pH7.0,加水定 容至50ml,用滤膜(0.45m)过滤,备用。 操作步骤 1.插好电极,打开电源开关,按模式键切换到pH测量状态 2.用两点法进行校正(b=2)(pH 4.01,6.86,9.18) 3.按模式进入b=2 4.将电极浸入标准缓冲液中 (pH=6.86),按“校正”,当到达 终点时显示屏上显示相应校正结果 ;将电极放入第二种 标准缓冲液(pH=4.01或9.18),按“校正”,当到达 终点时 显示屏上显示相应校正结果 ;按“读数”,保存校正结果 并退回到正常的测量状态 5.将电极插入到被测液中 ,调节pH到
6、所需值 pH计的使用计的使用 (1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤 其是使用无机盐配制的缓冲液。 前处理前处理 滤膜类型：滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙6666滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 同样适用于水溶性样品和有机溶剂 3.测定 色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm 取样品处理液和标
7、准系列溶液各10l注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中被测物质的含量,按下式计算: V?0 xVCC?式中: Cx为样品中被测物的含量,g/kg C 为在标准曲线上查得的相对应的糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml V0 为样品定容体积,ml V 为取样体积,ml 思考题 1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳? 2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸 的测定有何影响？ 注意事项注意事项 1.流动相使用前必须经过脱气。如果流动相
8、中含有气体,在较高的柱压下会产生气泡,使流动相流动受阻,对分离样品产生不利影响 2.应通过预实验调整和最后确定流动相实际配比,以使各分析组分的分离效果最佳 3.被测溶液pH值对测定和色谱柱使用寿命均有 影响,以中性为宜 4.苯甲酸、糖精钠的灵敏波长为230nm,山梨酸灵 敏波长为254nm,在此波长测定时苯甲酸和糖精钠 的灵敏度较低,因此采用230nm为测定波长 (2)脱气：脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 A.示差折射率检测器 *使折射率变化 B.U
9、V检测器（200nm以下） *溶解氧气有吸收 C. 荧光检测器 *溶解氧气有消光作用 1. 吸气器法（流动相抽滤） *可以抑制制做流动相时产生的气泡 *只是暂时的脱气法 *不能解决因溶解气体造成的问题 2. 超声脱气法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法 溶剂前处理-脱气 使用超声波震荡器，一般超声震荡 15 分钟左右 注意流动相在超声震荡脱气过程中，温度会升 高，应待其降至室温后再上机使用。 由于液体对气体的溶解作用，时间长后气体会 再溶入流动相中，应引起注意。 溶剂前处理-脱气 溶剂前处理溶剂前处理-脱气脱气 使用氟树脂膜的减压脱气法 氟树脂膜 真空室 真空泵 流动相 往送液泵 缓冲液的使用
10、?使用前必须过滤 ?使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞 : 用含5%甲醇的水溶液冲洗 30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min ?用纯水冲洗泵头清洗管路 ?易受到细菌和霉菌的影响 不能直接用有机溶剂 冲洗缓冲盐溶液 缓冲液 流动相的更换 不互溶的流动相不能直接更换 缓冲盐不能直接用有机溶剂更换 水 正己烷 异丙醇 缓冲盐 有机溶剂 水 液相色谱简易流程图 输液泵 进样进样器 色谱谱柱 柱温箱 检测检测器 溶剂 数据处理 废液废液 液相系统维护流程图 吸滤头 单向阀单向阀 柱塞密封圈 线路过滤器 手动进样器 检测器 色谱柱 泵工作示意图 凸轮 柱塞杆 柱塞密封圈 单向阀
11、泵头 流动相入口 流动相出口 LC-20AT 串联式柱塞往复泵 LC-20AD 并联式微体积柱塞往复泵 柱塞泵的基本结构 LC-10ATvp LC-10ADvp 单向阀 单向阀 单向阀 1_at.flv 1_ad.flv 单向阀 单向阀结构 球座 吸液冲程 排液冲程 出口单向阀 进口单向阀 泵头 抛光面 宝石球 流动相 单向阀工作原理 单向阀结构 请不要分解阀心A和阀心B 重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定 注意： 线路过滤器 故障：堵塞 现象：系统压力偏高 措施：异丙醇（或5稀硝酸）， 超声波清洗 判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力0.5MPa，则堵塞。
12、排液阀 压力传感器 线路过滤器 流动相 线路过滤器 部件号： 228-32744 Minutes0246810121416182022mAU020406080100120140空白样品色谱图空白样品色谱图 混合标准品色谱图混合标准品色谱图 样品号 1 2 3 样品 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 迁移时间 8.771 12.137 19.269 Minutes024681012141618202224mAU-100102030405060708090845803 8.7711458846 12.1371095977 19.269样品号 1 2 3 样品 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 迁移时间 8.755 峰面积 1135140 Minutes0246810121416182022mAU-100102030405060708090119249 1.5441135140 8.755
