1、结核实验室结核实验室快速诊断技术应用进展快速诊断技术应用进展新技术应用新技术应用结核病实验室免疫组结核组分子组培养药敏镜检结核病实验室工作分工结核病实验室工作分工麻烦麻烦生物安全培训生物安全培训 结核检测技术应用结核检测技术应用液体培养及药敏（金标准）液体培养及药敏（金标准）MGIT960MGIT960培养及药敏培养及药敏BACTEC MGIT 960 全自动分枝杆菌检测系统全自动分枝杆菌检测系统v国内对骨关节结核培养阳性率报道不一：14.5%、46.4%、30.1%、42%、83.87%不等v骨关节结核患者一般术前都经过抗结核药物治疗，A 群为生长旺盛菌群，但易被药物杀灭，而 B、C、D 群
2、多为休眠或静止状态，代谢缓慢。骨关节结核标本的培养在参照肺结核痰培养的基础上，应该适当延长培养时间，建议延长到 8 周左右v 死骨、肉芽、坏死椎间盘、干酪样坏死等病变组织的培养阳性率（45.45%）略低于脓液及脓血标本组（63.83%）。v 脊柱结核患者的培养阳性率（61.40%）略高于髋关节、膝关节、踝关节、肘关节、腕关节、骶髂关节等其他部位结核组（41.67%）。v 第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，非结核分枝杆菌（NTM）在分枝杆菌分离株中占 11.1%，牛分枝杆菌占全部分枝杆菌株的 2.5%。NTM 感染无论从临床表现、影像学表现，甚至病理学表现，都与结核杆菌感染极为相似，很难
3、鉴别，结果统计检测方法平均测定时间（天） 范围（天） P值L-J固体培养 27.5 10-50 0.05MGIT960培养 11.48 1-28结果统计时间例数现象：同一耐药患者在治疗的不同阶段，药敏试现象：同一耐药患者在治疗的不同阶段，药敏试验结果发生了改变？验结果发生了改变？1、检测方法本身的可靠性：药物的稳定性，浓度，菌株的生长状况。2、耐药发生了演变：原发耐药和继发耐药3、混合感染问题：感染了多种分枝杆菌v 人体对于结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞免疫。 T淋巴细胞和巨噬细胞的作用关系到感染的进程和演变。v 巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后，就会把它们消化成大小不一的片断。特异片断(抗原
4、肽)与巨噬细胞和其他抗原递呈细胞的主要组织相容性复合体相结合，表达于巨噬细胞表面，并递呈给T细胞。v 特异性CD4 T细胞能产生特征性淋巴因子，包括一种能够刺激T细胞增殖的IL-2和-干扰素。v IGRA就是检测被结核菌激活的记忆T细胞释放出-干扰素水平。2.2.2 2 TB-IGRA TB-IGRAAPCT cellIFNgIGRAIGRA应用应用2.3 HAIN技术得到全面认可技术得到全面认可HAIN技术效果评价中国疾控中心结核国家参比实验室实验数据分枝杆菌的分类：一、缓慢生长菌群1结核菌群：包括人型结核杆菌，牛型结核杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌。2I 群光产色菌。如：堪萨斯、海分枝杆
5、菌等。3群暗产色菌。如：瘰疠、戈氏分枝杆菌。4群不产色菌。如鸟型、胞内、溃疡分枝杆菌等。二、 迅速生长菌即群菌，包括偶发、龟、耻垢分枝杆菌等。三、需要特殊营养菌包括麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、副结核分枝杆菌。Runyon分类法中的 、群分枝杆菌又称为非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria ，NTM)经过了全球四年四年的观察，HAIN技术已经是非常成熟的技术并得到同行的认可与好评。vHain 技术可以在二个工作日检测RIF和INH的耐药v可以进一步分析可以进一步分析18种常见非结核分枝杆菌。种常见非结核分枝杆菌。v缺点：与960液体快速药敏相比，该方法药敏结果
6、具有假阴性可能，占10%左右。这是所有分子诊断技术的原理缺陷。2.4 RNA恒温恒温扩增技术扩增技术（TB-SAT） P 脱氧核糖脱氧核糖含氮碱基含氮碱基DNA的基本单位的基本单位-脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 P 核糖核糖含氮碱基含氮碱基RNA的基本单位的基本单位-核糖核苷酸核糖核苷酸 DNA和RNA的主要区别就在糖基。 DNA是双螺旋结构，RNA是单螺旋结构 DNA很稳定，RNA很不稳定。结核结核RNA在细胞中拷贝数很多在细胞中拷贝数很多使用使用rRNA为靶标，大大提高了取样效率和检测灵敏度。为靶标，大大提高了取样效率和检测灵敏度。一个或几个拷贝一个或几个拷贝DNA104核糖体核糖体RNA
7、 (rRNA)16S rRNA23S rRNADNA扩增技术（扩增技术（PCR）用于病原体）用于病原体检验的不足检验的不足 “死菌检测也阳性”，与临床相关性差 基因与表型不吻合 (耐药检测) 不能区分“潜伏感染”“活动性感性” 交叉污染问题（三个房间） 变温检测，对仪器要求高 反应抑制问题（Taq酶） RNA扩增技术检验的优势扩增技术检验的优势 灵敏度高：RNA 拷贝数 DNA拷贝数（104 16 ） 与临床相关性好，可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，RNA很快降解（=“培养”） 减少无效治疗，比如抗生素滥用减少无效治疗，比如抗生素滥用 可以诊断“活动性感染” 活动性感染：指示活动性感染：
8、指示RNA转录活跃转录活跃 潜伏感染：指示潜伏感染：指示RNA不转录不转录 不易污染：靶标和扩增产物都是RNARNA 用于用于TB的检测的检测多国诊疗指南多国诊疗指南 2009：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南 所有疑似TB的初诊病人，除了做涂片之外，都必须用TB-SAT检测至少一份样本。（RNA获得FDA 认证可检测涂阴、涂阳标本，DNA只获得FDA 认证可检测涂阳标本）Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Ampflication Test in the Diagnosis of Tuberculosis (2009) United States 目前，我实验室前期预实验275例，灵敏度达到93%，特异性达到85%.该方法只适合痰标本2.5结核抗体lgG、lgM2.6 Gene Xpertv缺点：1、价格昂贵、一个test成本在50欧元2、仅能检测利福平一个药物。 标本留取v结核培养：任何标本，不同标本培养阳性率不同v结核DNA(HAIN)：痰、灌洗液、穿刺液等v结核RNA：痰、灌洗液、穿刺液v干扰素：肝素钠全血4mlvXPERT：痰、灌洗液、穿刺液等v近期新增项目：肺炎支原体RNA、手足口病RNA、性病三项RNA.对血液标本建议干扰素检测
