1、一种新型超顺磁纳米一种新型超顺磁纳米MRI探针用于探针用于肝癌早期诊断的实验研究肝癌早期诊断的实验研究研究背景研究背景 分子影像学是一门新兴边缘学科，与传统影像学的不同在分子影像学是一门新兴边缘学科，与传统影像学的不同在于其能够定性与定量地将分子水平的改变在活体状态下通于其能够定性与定量地将分子水平的改变在活体状态下通过影像方法显示出来，在发生形态及解剖改变之前，在组过影像方法显示出来，在发生形态及解剖改变之前，在组织、细胞及亚细胞等不同层面对疾病进行早期诊断。织、细胞及亚细胞等不同层面对疾病进行早期诊断。 分子成像需要满足以下几点要求，一是需要高速及清晰成分子成像需要满足以下几点要求，一是需
2、要高速及清晰成像技术；二是需要一定亲和力和特异性的分子探针；三是像技术；二是需要一定亲和力和特异性的分子探针；三是所选择的分子探针有穿过生物屏障的能力，这就需要该探所选择的分子探针有穿过生物屏障的能力，这就需要该探针具有良好的生物相容性，从而达到进入靶细胞和靶器官针具有良好的生物相容性，从而达到进入靶细胞和靶器官的目的。的目的。研究背景研究背景含钆磁共振对比剂（简称钆剂，含钆磁共振对比剂（简称钆剂，Gadolinium based contrast agent，GBCA）能够提高磁共振诊断的准确率，）能够提高磁共振诊断的准确率，但在体内呈非特异性分布。但在体内呈非特异性分布。超顺磁性氧化铁（超
3、顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）能够增强质子弛豫率，使能够增强质子弛豫率，使T2时间缩短。肝脏网状内皮系时间缩短。肝脏网状内皮系统中的统中的Kupffer细胞能够摄取细胞能够摄取SPIO，使得正常肝组织，使得正常肝组织T2信信号降低，而肝脏恶性肿瘤缺乏号降低，而肝脏恶性肿瘤缺乏Kupffer细胞，因此在细胞，因此在SPIO作用下作用下T2信号无明显变化，从而使肿瘤与正常肝组织信信号无明显变化，从而使肿瘤与正常肝组织信号差别加大，即产生负性强化。号差别加大，即产生负性强化。研究背景研究背景聚乙烯乙二醇（聚乙烯乙二醇（poly-ethylene g
4、lycol，PEG）是一种常）是一种常用的表面修饰材料，具有很好的亲水性，同时没有免用的表面修饰材料，具有很好的亲水性，同时没有免疫原性，便宜易得，呈中性，无明显毒性，有良好的疫原性，便宜易得，呈中性，无明显毒性，有良好的生物相容性，溶于水和多种有机溶剂，能够通过端基生物相容性，溶于水和多种有机溶剂，能够通过端基反应以嵌段或接枝的方法连接到纳米颗粒上，使其具反应以嵌段或接枝的方法连接到纳米颗粒上，使其具有亲水性，增强其稳定性，延长在血液内的循环时间，有亲水性，增强其稳定性，延长在血液内的循环时间，减少纳米颗粒被巨噬细胞的吞噬。基于以上这些原因，减少纳米颗粒被巨噬细胞的吞噬。基于以上这些原因，本
5、研究中使用本研究中使用PEG作为表面修饰剂对作为表面修饰剂对SPIO进行表面修进行表面修饰。饰。研究背景研究背景基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶-2（Matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）在肝细胞癌中高表达，而在正常肝组织中表达较弱。在肝细胞癌中高表达，而在正常肝组织中表达较弱。氯离子通道蝎毒素（氯离子通道蝎毒素（Chlorotoxin,CTX）能够选择性和特异）能够选择性和特异性地与性地与MMP-2结合。结合。研究目的研究目的制备以制备以SPIO为核心，外包裹为核心，外包裹PEG和和CTX的的SPIO-PEG-CTX纳米颗粒，并检测其体内外磁共振成像规律纳米颗粒，并检
6、测其体内外磁共振成像规律 SPIO-PEG-CTX纳米颗粒的制备及表征纳米颗粒的制备及表征SPIO制备的基本原理制备的基本原理共沉淀法制备共沉淀法制备SPIO纳米颗粒的化学反应式如下：纳米颗粒的化学反应式如下：Fe2+Fe3+8OH-Fe(OH)2/Fe(OH)3Fe(OH)2/Fe(OH)3+2Fe(OH)3Fe3O4+FeOOH+5H2O2FeOOH+Fe(OH)2Fe3O4+H2OSPIO制备装置示意图制备装置示意图SPIO表面修饰的基本原理表面修饰的基本原理使用配体交换方法对使用配体交换方法对SPIO纳米粒子进行表面修饰，使其与纳米粒子进行表面修饰，使其与PEG及及CTX结合，得到结合
7、，得到SPIO-PEG-CTX纳米颗粒。纳米颗粒。SPIO-PEG-CTX纳米颗粒的制备步骤SPIO-PEG-CTX纳米颗粒的表征纳米颗粒的表征粒径检测粒径检测(左图为左图为SPIO，右图为，右图为SPIO-PEG-CTX)：粒径分：粒径分布在布在2035 nm之间，较均一。之间，较均一。SPIO-PEG-CTX纳米颗粒的表征纳米颗粒的表征红外光谱显示其羧基改性成功，红外光谱显示其羧基改性成功，3000 cm-1的宽峰，以及的宽峰，以及1700cm-1的双峰表示羧基修饰成功。的双峰表示羧基修饰成功。 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32%T 500
8、 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 cm-1SPIO-PEG-CTX纳米颗粒的表征纳米颗粒的表征通过核磁共振仪检测通过核磁共振仪检测了化学合成过程中的了化学合成过程中的关键化合物结构。关键化合物结构。A：端羧基聚乙二醇；：端羧基聚乙二醇；B：端三氟乙醇修饰聚乙端三氟乙醇修饰聚乙二醇；二醇；C：碘乙酸活化：碘乙酸活化酯；酯；D：SATA；E：APS-PEGSPIO-PEG-CTX纳米颗粒的体外磁共振成像纳米颗粒的体外磁共振成像及体外细胞实验及体外细胞实验磁共振扫描序列磁共振扫描序列荷兰荷兰Philips Achieva 3.0T X series超导磁共振成像
9、系统，超导磁共振成像系统，16通道通道SENSE XL Torso线圈。线圈。横断位快速自旋回波横断位快速自旋回波T2加权序列，加权序列，TE 70ms,TR 1565 ms， NSA=3，翻转角：，翻转角：90度，矩阵：度，矩阵：252193，层厚，层厚4mm,间距间距0.4mm，视野：，视野：2424 cm。横断位快速自旋回波横断位快速自旋回波T1加权序列，加权序列，TE 2.3ms,TR 10 ms， NSA=3，翻转角：，翻转角：15度，矩阵：度，矩阵：252193，层厚，层厚3mm,间距间距0.3mm，视野：，视野：2424 cm。不同浓度不同浓度SPIO与与SPIO-PEG-CTX
10、对照对照SPIO-PEG-CTX的体外磁共振成像的体外磁共振成像在磁共振工作站测量不同浓度溶液的在磁共振工作站测量不同浓度溶液的T1值和值和T2值，取信号值，取信号均匀的层面作为感兴趣区，均匀的层面作为感兴趣区，ROI为为5x5mm2，由三位影像诊，由三位影像诊断医师分别独立测量，取平均值。断医师分别独立测量，取平均值。将测得的将测得的T1及及T2值与值与SPIO和和SPIO-PEG-CTX溶液的浓度进行溶液的浓度进行数据分析，用拟合的方法绘制出曲线，以显示溶液浓度与数据分析，用拟合的方法绘制出曲线，以显示溶液浓度与T1及及T2值的关系。值的关系。体外磁共振成像结果体外磁共振成像结果 SPIO
11、溶液的浓度与其磁共振信溶液的浓度与其磁共振信号值呈线性关系，即号值呈线性关系，即T2值随着值随着其浓度的增加而降低，其浓度的增加而降低，T1值随值随着浓度的增加而增加着浓度的增加而增加。体外磁共振成像结果 SPIO-PEG-SPIO-PEG-CTXCTX溶液的浓溶液的浓度与其磁共振度与其磁共振信号值呈线性信号值呈线性关系，即关系，即T2T2值值随着其浓度的随着其浓度的增加而减低，增加而减低，T1T1值随着浓度值随着浓度的增加而增加。的增加而增加。SPIO及及SPIO-PEG-CTX细胞毒性实验细胞毒性实验 MTTMTT法又被称为法又被称为MTTMTT比色法，常用来检测细胞生长情况和比色法，常用
12、来检测细胞生长情况和存活状态。存活状态。MTTMTT指的是指的是3-3-（4 4，5-5-二甲基噻唑二甲基噻唑-2-2）-2-2，5-5-二二苯基四氮唑溴盐，常用的苯基四氮唑溴盐，常用的MTTMTT商品名为噻唑蓝。商品名为噻唑蓝。MTTMTT法的理法的理论基础是，琥珀酸脱氢酶在活细胞线粒体中的可以将外源论基础是，琥珀酸脱氢酶在活细胞线粒体中的可以将外源性的性的MTTMTT还原为不溶于水的甲臜，甲臜为蓝紫色结晶，产还原为不溶于水的甲臜，甲臜为蓝紫色结晶，产生后沉积在细胞内，而二甲基亚砜能够溶解细胞中的甲瓒，生后沉积在细胞内，而二甲基亚砜能够溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在用酶联免疫检测仪在4
13、90nm490nm波长处测定光吸收值，因为死波长处测定光吸收值，因为死细胞没有这种功能，因此可以用测定的光吸收值间接反映细胞没有这种功能，因此可以用测定的光吸收值间接反映活细胞的数量，活细胞的数量，MTTMTT结晶的形成量与细胞数呈正比。结晶的形成量与细胞数呈正比。细胞实验结果细胞实验结果正常兔肝细胞（正常兔肝细胞（A、B）、人肝细胞癌细胞株）、人肝细胞癌细胞株HepG2（C、D）显微镜图）显微镜图细胞实验结果分别将分别将CTX、SPIO及及SPIO-PEG-CTX溶液加入到细胞，溶液加入到细胞，于第于第1天、第天、第2天及第天及第3天行天行MTT检测，绘制成检测，绘制成MTT图，图，从第一天
14、到第三天，加入从第一天到第三天，加入三种溶液之后细胞的光吸三种溶液之后细胞的光吸收值是逐渐增大的，说明收值是逐渐增大的，说明存活的细胞数量是逐渐增存活的细胞数量是逐渐增多的，说明对细胞无毒性。多的，说明对细胞无毒性。SPIO-PEG-CTX纳米颗粒体内磁共振成像纳米颗粒体内磁共振成像建立兔建立兔VX2瘤肝癌模型瘤肝癌模型建立兔VX2瘤肝癌模型SPIO-PEG-CTX纳米颗粒体内磁共振成像纳米颗粒体内磁共振成像实验方法：实验方法： 选取选取12只只VX2瘤肝癌模型兔，随机分成两组：瘤肝癌模型兔，随机分成两组：CTX组（组（8只）只）和和SPIO组（组（4只），两组分别以只），两组分别以SPIO-
15、PEG-CTX和和SPIO做磁共做磁共振对比剂，浓度为振对比剂，浓度为25g/ml，剂量约，剂量约5ml。以水合氯醛经耳。以水合氯醛经耳缘静脉麻醉后行磁共振扫描。缘静脉麻醉后行磁共振扫描。SPIO-PEG-CTX纳米颗粒体内磁共振成像纳米颗粒体内磁共振成像使用荷兰使用荷兰Philips Achieva 3.0T X series超导磁共振成像系统，超导磁共振成像系统，16通道通道SENSE XL Torso线圈。线圈。横断位快速自旋回波横断位快速自旋回波T2加权脂肪抑制序列，加权脂肪抑制序列，TE 70ms,TR 1565 ms， NSA=3，翻转角：，翻转角：90度，矩阵：度，矩阵：2521
16、93，层厚，层厚4mm,间间距距0.4mm，视野：，视野：2424 cm，常规加脂肪抑制。，常规加脂肪抑制。横断位快速自旋回波横断位快速自旋回波T1加权序列，加权序列，TE 2.3ms,TR 10 ms，NSA=3，翻转角：翻转角：15度，矩阵：度，矩阵：252193，层厚，层厚3mm,间距间距0.3mm，视，视野：野：2424 cm。横断位快速自旋回波横断位快速自旋回波T2加权脂肪抑制序列，加权脂肪抑制序列，TE 70ms,TR 1565 ms， NSA=3，翻转角：，翻转角：90度，矩阵：度，矩阵：252193，层厚，层厚4mm,间间距距0.4mm，视野：，视野：2424 cm，常规加脂肪
17、抑制，注射对比剂，常规加脂肪抑制，注射对比剂后后30分钟扫描。分钟扫描。磁共振图像处理磁共振图像处理将两组将两组VX2瘤兔增强前后的肝癌和正常肝脏的瘤兔增强前后的肝癌和正常肝脏的T2值作为测值作为测量对象，增强前后选择同样的位置作为感兴趣区，量对象，增强前后选择同样的位置作为感兴趣区，ROI为为4x4mm2，避开胆管、血管及坏死区域，所有磁共振图像，避开胆管、血管及坏死区域，所有磁共振图像均由三位影像诊断医师独立检测阅片，取平均值。均由三位影像诊断医师独立检测阅片，取平均值。CTX组体内磁共振成像结果组体内磁共振成像结果从上表结果可以看出，以从上表结果可以看出，以SPIO-PEG-CTX作为对
18、比剂，肝癌病作为对比剂，肝癌病灶灶T2值显著降低，而周围正常肝组织的信号无明显变化，表值显著降低，而周围正常肝组织的信号无明显变化，表明明SPIO-PEG-CTX对肝癌有一定的靶向性，呈对肝癌有一定的靶向性，呈T2负性强化。负性强化。CTX组体内磁共振成像结果组体内磁共振成像结果箭头所指为箭头所指为VX2肝癌，肝癌，T1WI序列呈低信号，序列呈低信号，T2WI序列呈高信号，序列呈高信号，以以SPIO-PEG-CTX为对为对比剂增强扫描后比剂增强扫描后T2WI序列病灶信号序列病灶信号减低，周围正常肝减低，周围正常肝组织信号变化不明组织信号变化不明显。显。SPIO组体内磁共振成像结果组体内磁共振成
19、像结果从上表结果可以看出，以从上表结果可以看出，以SPIO作为对比剂，肝癌病灶和周围作为对比剂，肝癌病灶和周围正常肝组织的正常肝组织的T2值均显著降低，说明值均显著降低，说明SPIO强化无选择性。强化无选择性。SPIO组体内磁共振成像结果箭头所指为箭头所指为VX2肝肝癌，癌，T1WI序列呈序列呈低信号，低信号，T2WI序序列呈高信号，以列呈高信号，以SPIO为对比剂增强为对比剂增强扫描后扫描后T2WI序列序列病灶及周围正常病灶及周围正常肝组织信号均稍肝组织信号均稍减低。减低。结论结论在一定条件下可以通过实验室方法制备在一定条件下可以通过实验室方法制备SPIO-PEG-CTX纳米纳米颗粒，该纳米颗粒可以作为磁共振成像颗粒，该纳米颗粒可以作为磁共振成像T2阴性对比剂。阴性对比剂。SPIO-PEG-CTX纳米颗粒对肝癌有一定的靶向性，能够为肝纳米颗粒对肝癌有一定的靶向性，能够为肝癌早期诊断的进一步研究提供基础。癌早期诊断的进一步研究提供基础。谢谢
