1、1Challenge and Practice of Biological Therapy for Deafness耳聋生物学治疗的挑战与实践耳聋生物学治疗的挑战与实践2BIOLOGICAL THEREPYGENE THERAPYMOLECULAR THERAPYCELL THERAPY3NILL（噪声损伤）（噪声损伤）4周周4Toxic DrugsCBA5强噪声暴露后耳蜗毛细胞的变化强噪声暴露后耳蜗毛细胞的变化噪声损伤后，毛细胞纤毛及细胞核首先发生变化，随后胞体肿胀溶解噪声损伤后，毛细胞纤毛及细胞核首先发生变化，随后胞体肿胀溶解（郭维维等（郭维维等. 强噪声暴露后耳蜗毛细胞的变化强噪声暴露后
2、耳蜗毛细胞的变化.中华耳科学杂志中华耳科学杂志2009）6研究发现，培养的新生大鼠耳蜗毛细胞损伤后能够存活研究发现，培养的新生大鼠耳蜗毛细胞损伤后能够存活2周，尽管毛细胞机电转换的动力学特性依然周，尽管毛细胞机电转换的动力学特性依然保留，但纤毛损伤后不能自发再生。保留，但纤毛损伤后不能自发再生。纤毛损伤后哺乳动物耳蜗毛细胞及静纤毛的命运纤毛损伤后哺乳动物耳蜗毛细胞及静纤毛的命运（Jia Shuping, Yang SM, Guo Weiwei, He DZZ. Fate of Mammalian Cochlear Hair Cells and Stereocilia after Loss of
3、 the Stereocilia. J NEUROSCI 2009，IF=7.8）7我们根据听觉损伤后不同的病理状态，认为内耳基因治疗时间窗问题至关重要，提出听觉损伤后毛细胞再生和基因治疗的基本策略。8听觉损伤病理四段论听觉损伤病理四段论基因治疗时间窗基因治疗时间窗 杨仕明杨仕明.听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略.中华耳科学杂志中华耳科学杂志 2009听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略9第一阶段为毛细胞纤毛损伤阶段第一阶段为毛细胞纤毛损伤阶段，这个阶段毛细胞依然存活并且具有正常的电生理特性，但如果没有
4、干预其维持时间有限，可能最终进入下一段的病理状态。这个阶段这个阶段是基因治疗的最好时机是基因治疗的最好时机，通过完全修复或纤毛再生达到功能的完全或部分恢复。听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略10第二阶段为毛细胞明显损伤阶段第二阶段为毛细胞明显损伤阶段，但支持细胞和神经纤维以及螺旋神经节细胞损伤很轻，但如果没有干预可能又进入下一段病理状态。内耳毛细胞虽有损伤但没有坏死，支持细胞和神经纤维基本正常，细胞构架基本存在，所以有恢复形态和功能的机会，这个阶段导入Math1基因应该有效，是基因治疗的最关键时机是基因治疗的最关键时机。听觉损伤后毛细胞再生和聋
5、病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略11第三阶段毛细胞严重损伤第三阶段毛细胞严重损伤，但支持细胞尚存，是毛细胞再生的抢救阶段毛细胞再生的抢救阶段，而且还可以争取在Corti器细胞构架没有塌陷之前进行干细胞导入干细胞导入，所以这个阶段称之为细胞移植可能有效地实现听力恢复的抢救阶段实现听力恢复的抢救阶段。听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略12第四阶段为毛细胞和支持细胞严重损伤并且基本消失第四阶段为毛细胞和支持细胞严重损伤并且基本消失，神经纤维以及螺旋神经节细胞也可能严重损伤, Corti器完全失去构架，仅仅残留上皮层或瘢痕化
6、。基因导入完全基因导入完全无效，即使干细胞导入也会面临困难无效，即使干细胞导入也会面临困难，如何重塑Corti器细胞构架是巨大挑战。 听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略13听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后毛细胞再生和聋病基因治疗基本策略听觉损伤后耳蜗病理变化呈瀑布效应听觉损伤后耳蜗病理变化呈瀑布效应，不同程度的损伤和不同类型的损伤导致的病理形态状态可能不同，与听觉功能可能非同步表现，这对我们有重要提示，只有抓住时机进行干预才有可能实只有抓住时机进行干预才有可能实现毛细胞再生并且保存听力现毛细胞再生并且保存听力, 从而达到真正
7、意义从而达到真正意义上的聋病基因治疗上的聋病基因治疗。 杨仕明杨仕明.听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略听觉损伤后毛细胞再生与聋病基因治疗策略.中华耳科学杂志中华耳科学杂志 200914HEARING LOSS & HAIR CELLGene Therapy基因时代的到来，带来了基因治疗的期待。基因时代的到来，带来了基因治疗的期待。虽然内耳所独具的结构是基因治疗非常独特和重要的靶器官，但能否实现损伤后毛细胞的再生是耳聋基因治疗的前提条件。15耳聋基因治疗的挑战耳聋基因治疗的挑战Hair Cell Regeneration16Hair Cell Regeneration半个世纪以来，耳蜗毛细
8、胞再生问题一直倍受关注，因为既往半个世纪以来，耳蜗毛细胞再生问题一直倍受关注，因为既往研究认为哺乳动物内耳毛细胞损伤后将不能再生。内耳毛细胞研究认为哺乳动物内耳毛细胞损伤后将不能再生。内耳毛细胞再生成为一个梦想，为了这个梦想，国内外研究者们做了大量再生成为一个梦想，为了这个梦想，国内外研究者们做了大量的探索并且一步步取得重要突破。的探索并且一步步取得重要突破。 17第三阶段第三阶段(21世纪初世纪初):成年哺乳动物耳蜗毛细胞的再生成为可能成年哺乳动物耳蜗毛细胞的再生成为可能,并听力改善并听力改善Izumikawa M, et al. Auditory hair cell replacement
9、 and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med 2005; 11(3): 271-276 Hair Cell Regeneration18国内外研究者们做了大量的探索，国内外研究者们做了大量的探索，从非哺乳动物到哺乳动物毛细胞从非哺乳动物到哺乳动物毛细胞再生，从前庭毛细胞到耳蜗毛细再生，从前庭毛细胞到耳蜗毛细胞再生，从未成熟期到成年期毛胞再生，从未成熟期到成年期毛细胞再生，从离体培养毛细胞再细胞再生，从离体培养毛细胞再生到在体毛细胞再生，整整经历生到在体毛细胞再生，整整经历了近半个世纪，取得重大研究
10、突了近半个世纪，取得重大研究突破，毛细胞再生成为可能。破，毛细胞再生成为可能。Hair Cell Regeneration19再生有功能的毛细胞再生有功能的毛细胞?聋病基因治疗聋病基因治疗外源基因导入外源基因导入耳聋基因治疗的挑战耳聋基因治疗的挑战20听觉损伤致聋听觉损伤致聋噪声性聋噪声性聋药物性聋药物性聋老年性聋老年性聋载体构建载体构建重组腺病毒脂质体纳米在体内耳基因在体内耳基因转染技术转染技术经完整圆窗膜经耳蜗开窗经全身给药基因导入时机基因导入时机再生毛细胞维持再生毛细胞维持外源基因导入外源基因导入Math1（重点）（重点）Prestin/bFGF/ NT-3腺病毒腺病毒/脂质体脂质体/纳
11、纳米载体和外源基因米载体和外源基因导入内耳安全性和导入内耳安全性和有效性评价有效性评价外源基因诱导分化外源基因诱导分化再生毛细胞来源再生毛细胞来源在体研究离体培养新生毛细胞电生理研究新生毛细胞电生理研究离子通道电致运动毛细胞再生毛细胞再生听功能恢复听功能恢复听功能评价听功能评价ABR CAP CM DPOAE内耳形态学研究内耳形态学研究基底膜铺片 耳蜗切片扫描和透射电镜免疫组化鉴定再生毛细胞特性免疫组化鉴定再生毛细胞特性Hochest染色核；Phalloidin纤毛；prestin染色胞膜听觉通路再建立听觉通路再建立研究新生毛细胞与神经突触以及神经元如何实现联系总体技术路线总体技术路线 Ad-
12、21Math1Math1经耳蜗鼓阶开窗成功转导耳蜗内经耳蜗鼓阶开窗成功转导耳蜗内Ad-MATH1-EGFP美国基因公司高维强教授提供Ad-22NILL（噪声损伤）（噪声损伤）2 weeksHair cells Regeneration23Hearing Recover by MATH1 Transgene after NILL 24听觉神经生物学研究，光学方法同步记录听觉通路神经细胞群电生理活动听觉发育的分子机制研究，发现Smad4和Smad5基因敲除导致严重耳聋首次证明耳蜗毛细胞纤毛损伤后具有自我修复顶连接（TIP LINK）的能力科研方向与创新能力毛细胞再生研究取得重要进展，为耳聋基因治疗
13、奠定基础内耳基因导入治疗噪声性聋新突破学术成就25耳聋基因治疗的挑战耳聋基因治疗的挑战 NANO VECTOR 26Route of Delivery for Cochlear Gene Therapy27Delivery of polyplex to cochleain vivo Polyplex was delivered to cochlea by a micro-invasive surgery. Gelfoam soaked with polyplex was placed in the round window niche and directly contact round wi
14、ndow membrane.28季胺化壳聚糖季胺化壳聚糖-环糊精（环糊精（CM-CDCM-CD）载基因）载基因（Math1Math1）纳米粒基因传递系统的构建）纳米粒基因传递系统的构建Ren LL, et al. Math1 gene transfer based on the delivery system of quaternized chitosan/ Na- carboxymethyl- cyclodextrin nanoparticles. J Nanosci Nanotec 2010.10(11): 7262-7265（国家发明专利 申请号200910237305.3）29季胺化壳
15、聚糖季胺化壳聚糖-环糊精（环糊精（CM-CDCM-CD）载基因）载基因（Math1Math1）纳米粒基因传递系统的构建）纳米粒基因传递系统的构建Ren LL, et al. Math1 gene transfer based on the delivery system of quaternized chitosan/ Na- carboxymethyl- cyclodextrin nanoparticles. J Nanosci Nanotec 2010.10(11): 7262-7265（国家发明专利 申请号200910237305.3）30Wu N, Ren LL, Zhao LD, G
16、uo WW, Liu HZ, Yang SM*. Gene delivery to sensory cells in the adult murine cochlea by activated polyamidoamine dendrimers/ cyclodextrin nanoparticles with low toxicity and high efficacy. Nano Lett 2011(submitted).）（国家发明专利 申请号201110005066.6）PAMAM树状大分子-环糊精（CMAP）载基因（Math1）纳米粒基因传递系统的构建31PAMAM树状大分子-环糊精（
17、CMAP）载基因（Math1）纳米粒基因传递系统的构建Wu N, Ren LL, Zhao LD, Guo WW, Liu HZ, Yang SM*. Gene delivery to sensory cells in the adult murine cochlea by activated polyamidoamine dendrimers/ cyclodextrin nanoparticles with low toxicity and high efficacy. Nano Lett 2011(submitted).）（国家发明专利 申请号201110005066.6）32耳聋基因治疗
18、的局限性耳聋基因治疗的局限性分子治疗？分子治疗？内耳基因治疗与小分子治疗内耳基因治疗与小分子治疗相结合的新策略相结合的新策略 3334Yang SM, et al, Effects of DAPT and Atoh1 Overexpression on Hair Cell Production and Hair Bundle Orientation in Cultured Organ of Corti from Neonatal Rats. Plos One 2011, accepted35Yang SM, et al, Effects of DAPT and Atoh1 Overexpres
19、sion on Hair Cell Production and Hair Bundle Orientation in Cultured Organ of Corti from Neonatal Rats. Plos One 2011, accepted36Math1基因联合小分子DAPTYang SM, et al, Effects of DAPT and Atoh1 Overexpression on Hair Cell Production and Hair Bundle Orientation in Cultured Organ of Corti from Neonatal Rats.
20、 Plos One 2011, accepted37Yang SM, et al, Effects of DAPT and Atoh1 Overexpression on Hair Cell Production and Hair Bundle Orientation in Cultured Organ of Corti from Neonatal Rats. Plos One 2011, accepted38耳聋生物治疗的挑战耳聋生物治疗的挑战STEM Cell Replace39Stem Cell for Inner EarStem Cell for Inner Ear（20072007）
21、 Huawei Li, et al. Pluripotent stem cells from adults mouse inner ear. Nature Medicine 2003.40骨髓间充质干细胞诱导成为毛细胞样细胞骨髓间充质干细胞诱导成为毛细胞样细胞骨髓间充质干细胞成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞先诱导成为神经前体细胞，进一步诱导成为表达Myosin VIIa的毛细胞样细胞Qin H, Yang SM*, et al. The differentiation of mesenchymal stem cells into inner ear hair cell-like cells in
22、 vitro. Acta Oto-Laryngologica, 2011; 00: 00000041Stem Cell Implant in Inner Ear Stem Cell Implant in Inner Ear 42胚胎干细胞内耳移植李利等，经鼓阶内耳胚胎干细胞移植的探索研究，中华耳科学杂志李利等，经鼓阶内耳胚胎干细胞移植的探索研究，中华耳科学杂志2009； Zhao LD, Yang SM*, et al, Migration and differentiation of mouse embryonic stem cells in mature rat cochlea. Neur
23、oscience Letters 2011, revised）43GFP-ESC transplanted into drug-damaged earsGFP-ESC transplanted into drug-damaged ears1week 446 weeks Stem Cell Implant in Inner Ear Stem Cell Implant in Inner Ear 45Stem Cell Implant in Inner Ear Stem Cell Implant in Inner Ear 46中国人民解放军总医院 （杨仕明 翟所强 杨伟炎）上海交通大学 （殷善开 高
24、维强 曾凡一）复旦大学 （李华伟）山东大学 （高建刚 徐志刚）中国农业大学 （李宁）第四军医大学 （邱建华）2个国家重点实验室2个国家重点学科3个省部级重点实验室1个全军重点实验室听觉干细胞定向分化及聋病干细胞治疗的基础研究 47 听觉干细胞研究为耳聋治疗带来新曙光 干细胞治疗理想模型和转化医学的典范如何诱导有功能的毛细胞再生？如何重建正常形态的耳蜗结构？定向分化听觉干细胞耳聋患者iPS内耳细胞结构修复听觉传导功能恢复毛细胞再生耳聋个体化治疗定位于内耳柯蒂氏器定向迁移48如何分离和鉴定听觉干细胞并诱导其定向分化？如何建立耳聋患者iPS细胞系并进行基因缺陷纠正？如何进行内耳干细胞移植并重建耳蜗结
25、构和功能？阐明听觉干细胞定向分化信号调控机制，进一步揭示耳聋发病机理寻找实现耳聋干细胞个体化治疗关键规律遗传性耳聋患者iPS细胞系建立及基因突变纠正听觉干细胞分离及诱导分化耳蜗结构功能修复干细胞内耳移植49Hair Cell RegenerationInner Ear Cell Replace耳聋生物治疗的未来耳聋生物治疗的未来聋病生物治疗临床应用聋病生物治疗临床应用安全安全有效有效502006 2006 国家自然科学基金海外青年学者合作基金（国家自然科学基金海外青年学者合作基金（30628030)30628030)： 毛细胞机毛细胞机电转换机制的研究电转换机制的研究2007 2007 国家自
26、然科学基金重点项目（国家自然科学基金重点项目（3073004030730040）：）： 听觉损伤后内耳毛细胞再生的基础研究听觉损伤后内耳毛细胞再生的基础研究2007 2007 国家高技术研究发展计划（国家高技术研究发展计划（863863计划）专题项目（计划）专题项目（2007AA02Z1502007AA02Z150）：）： 内耳毛细胞再生研究和感音神经性聋基因治疗内耳毛细胞再生研究和感音神经性聋基因治疗2005 2005 国家自然科学基金面上项目国家自然科学基金面上项目(30571017)(30571017)： SMAD5 SMAD5基因缺陷致聋的机制研究基因缺陷致聋的机制研究 北京市自然科学
27、基金面上项目：北京市自然科学基金面上项目： 转化生长因子转化生长因子-/smad4-/smad4基因敲除致聋机制研究基因敲除致聋机制研究本研究得到国家本研究得到国家863项目、国家自然科学基金重点项目以及国家自然科学基金项目、国家自然科学基金重点项目以及国家自然科学基金面上项目和海外青年学者合作基金等面上项目和海外青年学者合作基金等13项基金项基金10年来一贯的支持和资助。年来一贯的支持和资助。 2008 2008 国家自然科学基金面上项目（国家自然科学基金面上项目（3087139830871398）：）： SMAD4SMAD4条件基因敲除致聋机制及条件基因敲除致聋机制及SMAD4SMAD4基因在听觉发育调控中的作用研究基因在听觉发育调控中的作用研究51THANKS
