1、医院检验科医院检验科 1结核疫情及诊断进展结核疫情及诊断进展 2l黛玉脸色苍白， 瘦骨嶙峋，经不断咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场哀怨凄绝的爱情故事。 3我国结核病疫情我国结核病疫情 全球结核病第二高负担国家，全球结核病第二高负担国家，结核病疫情表现有结核病疫情表现有“六六多多” 。一、感染人数多5.5亿人感染过结核菌，约占全国人口 的45，高于全球平均水平。二、患病人数多活动性肺结核、传染性肺结核患病率 分别为367/10万和122/10万，三、新发患者多全国每年新发活动性肺结核患者145 万， 其中传染性 肺结核患者65万。 四、死亡人数多全国每年约有13万人死于结核病。五、农村患者多全
2、国约有80的结核病人集中在农村， 主要在经济不发达的中西部地 区。六、耐药患者多全国结核病耐药率高达28。 45l结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源的主要途径和手段，也是结核病确诊和制订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。l由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。6l病原学诊断病原学诊断l辅助诊断辅助诊断 7一、涂片抗酸染色镜检法，二、液基夹层杯结核杆菌检验三、荧光染色法四、培养法 五、六、快速培养检测法，七、色谱法 八、分子生物学法 8l国内大
3、多采用厚涂片，比薄涂片法可提高阳性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存较久，可备复查；l因费时、繁琐，综合医疗单位常因重视不够，致涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳率可达到30%。l国外痰涂片阳性率可达30%40%，反复多次查，可增加到65%75%；91011l病变是封闭或开放；l病变性质和其中能够排出的菌量和排出时间间歇；l结核分枝杆菌形态多样性；12 将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混悬液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心悬液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心机离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯
4、机离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯中直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。中直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。13优点：优点：1、操作方便，易于掌握。、操作方便，易于掌握。2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高：高： 该方法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。4、安全性有所提高：、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。 采用结核专用消化液，可有效
5、杀灭结核分支杆菌，更好的提高了操作的安全性。 14l是涂片法中阳性率较高，较快速的方法，是涂片法中阳性率较高，较快速的方法，l集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达酸杆菌阳性率可达50%，l荧光法的缺点：荧光法的缺点： 假阳性率较高，假阳性率较高， 保存时间短，不到保存时间短，不到4个月个月15l一般都用改良罗氏固体培养基一般都用改良罗氏固体培养基l接种后第接种后第3第第7天观察，以后每周观察一天观察，以后每周观察一次菌落生长情况，第次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报周若仍无生长，报告为阴性。告为阴性。l优点：准确，优点：准确，l缺点
6、：诊断周期长，最快也需要缺点：诊断周期长，最快也需要6周。周。l有一定的污染率有一定的污染率1617l个别细菌营养要求的特异性； l细菌和细菌营养代谢异质性； l细菌培养前处理对细菌活性影响； 18l绝对浓度法检测分枝杆菌药敏实验是采用含药罗氏培养基进行的。常用药物终浓度（g/ml）l _表 1 绝对浓度法含药培养基中的药物终浓度_ l 药 物 浓 度（g/ml） l 低浓度 高浓度 l异烟肼 1g/ml 10g/mll利福平 1g/ml 10g/mll链霉素10g/ml 100g/mll乙胺丁醇 5g/ml 50g/ml l对氨基水杨酸 1g/ml 10g/ml l氨硫脲 10g/ml 10
7、0g/ml l乙硫异烟胺 25g/ml 100g/ml l卡那霉素 10g/ml 100g/mll卷曲霉素 10g/ml 100g/mll 紫霉素 10g/ml 100g/ml l氧氟沙星 5g/ml 50g/mll左氧氟沙星 5g/ml 50g/mll环丙沙星 5g/ml 50g/mll司帕沙星 5g/ml 50g/mll力克肺疾 1g/ml 10g/mll丁胺卡那 10g/ml 100g/mll 19l 1菌悬液的制备l 2.接种及培养l3.结果判定与报告 l敏感（一）： 含药培养基上无菌落生长。l 报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时，报告菌落个数。l耐药（1+）： 含药培养基
8、上菌落数约占斜面面积1/4；l耐药（2+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2；l耐药（3+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4；l耐药 (4+)： 含药培养基上菌落呈菌苔样生长。20212223241. BD BACTEC MGIT 960培养系统培养系统2. BacT ALERT 3D培养系统培养系统25 基本原理基本原理l 培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判定结果。l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 l缺点：污染率略高于L
9、-J法，产品依赖进口，价格较贵26l原理：该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感应器，当培养瓶中有细菌生长，C02产生、pH下降时，颜色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 l缺点：污染率略高于L-J法， 产品依赖进口，价格较贵。27l分为气相色谱(GC)、气液相色谱、高效液相色谱(HPLC)等lGC等能检测分枝杆菌代谢过程中的挥发性物质如脂肪酸所产生的CO2含量，出现不同的色谱峰，从而可鉴定结核杆
10、菌和大部分NTM菌种，且可测药敏。l优点：简单、快速、定量、重复性好，GC与质谱(MS)联用更好；l缺点：仪器昂贵，维护不易，无法普及。 28 利用分子生物学检测方法来检测结核杆菌特异性基因片断，从而为结核病的快速诊断提供依据。l1、聚合酶链反应(PCR)：l2、核酸探针(DNA-probe)l3、染色体核酸指纹法：l4、16s23srDNA(rRNA)序列法l5、耐药基因的检则：l6、其它分子生物学方法29lPCR能快速扩增结核分枝杆菌DNA，lPCR检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关键问题。键问题。l对于存在的问题对策如下：对于存在的问题对策如下：
11、l扩增产物特异性鉴定探针杂交l高质量试剂（建立国家级检定考评）l规范化操作（培训操作人员）l质量控制 （标准实验室）30lDNA探针是一小段带标记而能识别特异性核苷酸序列的单链分子。l有多种方法，l如限制性内切酶图谱(REA)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析等，lRFLP用于菌株菌种鉴定和流行病学调查研究。31l用于分枝杆菌的菌种鉴定，差不多所有种的分枝杆菌都可鉴定出来。l已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对利福平)，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等
12、。323334 病毒病毒核酸衣壳只能只能在活的在活的易感易感細細胞胞內生長內生長溶原性感染和溶菌性感染溶原性感染和溶菌性感染35M.tuberculosis cell特异性噬菌体识别MTB,并与之结合36噬菌体DNA进入MTB细胞,并在其内扩增;同时生产蛋白外壳,开始产生新的病毒颗粒DNA37添加特异性杀病毒剂去除所有MTB胞外的噬菌体,胞内噬菌体不受损伤。38终止杀病毒反应，添加非致病性，快生长分枝杆菌（敏感细胞）39结核分枝杆菌破裂，释放噬菌体。40MTB细胞周围的敏感细胞，并在其胞内增殖41经过多个“感染增殖细胞消融”循环，在琼脂培养基中的菌苔上形成肉眼可见，清晰的噬菌斑4243结核分枝
13、杆菌杀病毒剂杀灭未感染MTB的噬菌体敏感细胞敏感细胞敏感细胞敏感细胞MTB裂解, 释放出来的噬菌体感染敏感细胞噬菌体感染结核分枝杆菌产生噬菌斑 先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感细胞菌苔上无噬菌斑出现。44质控 阳性对照 20个噬菌斑 阴性对照 10个噬菌斑结果判断标准标本 阳性结果 20个噬菌斑
14、阴性结果 19个噬菌斑阴性：无噬菌斑阳性：可数噬菌斑阳性：噬菌斑部分融合阳性：噬菌斑完全融合45适用范围可检测痰液、胸水、腹水、脑脊液、尿、骨髓等多种标本用于结核病的实验诊断抗痨治疗效果的评价尤其是初诊病人的鉴别诊断用于结核菌耐药性的快速检测用于HIV高危人群的鉴别诊断 46药敏试验药敏试验47 M. tb bacillus Sensor cellSensor cellSensor cellSensor cellSensor cell指示细胞指示细胞指示细胞指示细胞指示细胞l 室温室温5 5分分钟钟37 137 1小小时时18-2418-24小时小时加入杀毒剂加入杀毒剂加入培养基和指示细胞加入
15、培养基和指示细胞药物细菌药物细菌24-48小时小时加入噬菌体加入噬菌体MTBMTB48 无 RIF 含RIF49 无 RIF含 RIF505152 （偶然、胞内、金色、丁酸、耻垢、草分枝）偶然、胞内、金色、丁酸、耻垢、草分枝）53一、免疫学诊断方法二、血清学诊断三、酶学诊断54lPPD皮试，用于鉴别诊断有参考意义。皮试，用于鉴别诊断有参考意义。lT细胞亚群和一些细胞因子：细胞亚群和一些细胞因子：CD3、CD4/CD8、IL-2(R)、干扰素、肿瘤坏死、干扰素、肿瘤坏死因子等检查，以了解细胞免疫状态，或作因子等检查，以了解细胞免疫状态，或作为考核指标前后对比。为考核指标前后对比。55(1)结明试
16、验(MycoDot)，分枝杆菌细胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，为一种抗原，能诱发宿主产生相应抗体，激发迟发超敏反应，不提供保护性免疫。LAM-IgG有试剂盒供应，操作方便，敏感性70%左右，特异性90%左右，适用于菌阴肺结核病和肺外结核病；菌阴肺结核病如果证明试验阳性，示有活动性，可给予化疗。本法20分钟可出结果。(2)金免疫斑点渗滤试验(DIGFA，金标法)，用H37Rv PPD-IgG作为抗原，产生与LAM-IgG同样结果，国产、价格较廉。(3)38 KD蛋白质抗原，是主要免疫原，用以区别结核感染还是NTM感染，正在研究中。 56测定方法：测定方法：l酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试
17、验（ELISA）l免疫渗滤试验（免疫渗滤试验（DIGFA）l免疫层析试验（免疫层析试验（DICA）57581）辅助诊断结核病）辅助诊断结核病2）作鉴别诊断）作鉴别诊断3）用于疗效观察）用于疗效观察4）在结核病流行病学调查中的应用）在结核病流行病学调查中的应用5）作为器官移植并发结核感染的监测指标）作为器官移植并发结核感染的监测指标 59 简便、快速简便、快速 3-15分钟分钟 灵敏灵敏 阳性率阳性率60-95% 特异特异 特异性特异性80-95% 应用面广应用面广 各部位结核各部位结核60l有一定的假阳性和假阴性有一定的假阳性和假阴性l结果判断带有主观性结果判断带有主观性l缺乏有效的质控手段缺乏有效的质控手段 存在的问题存在的问题:616263
