1、“绿色健康，绿色健康，“酶酶”力无限力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域 一、什么是固定化酶？一、什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体固定化技术固定化技术水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）n固定化酶固定化酶：是被固定在某一有限空间内不再能自是被固定在某一有限空间内不再能自 由流动而仍有催化活性的酶。由流动而仍有催化活性的酶。n物理吸附法n 使用对酶蛋白有高度吸附能力的硅胶、活性炭，氧化铝、高岭土、石英沙、火棉胶、多孔玻璃等在一定条件下与水溶酶作用制
2、得。n 这些具有吸附能力的物质就叫做载体。优点：操作简单，反应条件温和，酶活力损失少，载体可反复使用。缺点：易引起蛋白质表面变性，且由于结合力 弱，当反应液的pH值、离子强度、温度、底物浓度等发生变化时，会导致酶易从载体上部分或全部脱落。n离子结合法n利用含有离子交换基团的固相载体（如具有交换基团的葡聚糖凝胶或纤维素）与酶蛋白分子的带电基团互相吸引（靠离子链）而形成络合物。优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。共价结合法共价结合法 酶蛋白的酶蛋白的非必需基团通过共价键和载
3、体形成非必需基团通过共价键和载体形成不可逆不可逆的连接。一般在温和条件下能参与偶联的蛋白质基的连接。一般在温和条件下能参与偶联的蛋白质基团包括：游离羧基（包括肽链团包括：游离羧基（包括肽链C-C-末端的末端的-羧基等）、羧基等）、游离氨基（如肽链游离氨基（如肽链N-N-末端的末端的-氨基）等。氨基）等。双功能试剂：双功能试剂：常用的是常用的是戊二醛戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H使用戊二醛的酶固定化的交联方式： 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合结合酶分子；酶分子；(a(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性
4、的固定化酶；）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b b）酶分子被）酶分子被结合结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。 微胶囊包埋法微胶囊包埋法将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为1100um1100um。例如，天门冬酰胺酶（。例如，天门冬酰胺酶（asparaginaseasparaginase) )就是就是用这种方法作成微胶囊。用这种方法作成微胶囊。首先被采用的胶格包埋法是首先被采用的胶格包埋法
5、是： 固定化胰蛋白酶固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 淀粉酶淀粉酶Enzyme+N, N-甲叉双甲叉双丙稀酰胺丙稀酰胺, 丙稀酰胺丙稀酰胺引发剂引发剂inactiationn优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化，可适用与多种不溶酶的制备。n缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只适用与小分子底物。 （1) 1) 直接固定法直接固定法 （无载体法）（无载体法） 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。法（如
6、柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 （2)2)载体结合法：载体结合法：将细胞悬液直接与水不溶性的载体将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的方法。原理同吸附法。相结合的方法。原理同吸附法。 （3)3)包埋法：包埋法：将细胞定位于凝胶网格内的技术。将细胞定位于凝胶网格内的技术。应用最多应用最多的方法。操作方法与包埋酶法相同。的方法。操作方法与包埋酶法相同。 （4 4）交联法：用多功能试剂对细胞进行交联的固定化）交联法：用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。方法。较少使用较少使用（所用试剂对细胞毒性较大）（所用试剂对细
7、胞毒性较大）3. 3. 固定化方法固定化方法 四、固定化酶和固定化细胞的性状和性质四、固定化酶和固定化细胞的性状和性质1 1、形状、形状（1 1）颗粒状固定化酶颗粒状固定化酶：包括酶珠、酶块酶片和酶粉。：包括酶珠、酶块酶片和酶粉。特点：制备方法简单，比表面积大，转化效率高，特点：制备方法简单，比表面积大，转化效率高，适适用于各种类型的反应器。用于各种类型的反应器。（2 2）纤维状固定化酶：特点：）纤维状固定化酶：特点：比表面大，转化效率高，比表面大，转化效率高，但但只适用于填充床反应器只适用于填充床反应器。（3 3）膜状固定化酶膜状固定化酶：特点：表面积大，渗透阻力小，：特点：表面积大，渗透阻
8、力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充式反应器。可用于酶电极，破碎后也可用于填充式反应器。（4 4）管状固定化酶）管状固定化酶：特点：机械强度大，切短后特点：机械强度大，切短后可用可用于填充床式反应器，也可组装成列管式反应器。于填充床式反应器，也可组装成列管式反应器。 （1 1）酶的活性）酶的活性 ： 通常通常低于低于天然酶（有例外）。天然酶（有例外）。 如：氨基酰化酶，如：氨基酰化酶， 7070，1515分钟，酶失去活性。分钟，酶失去活性。 而固定化后，而固定化后， 7070，1515分钟，有分钟，有80%80%活性。活性。 （2 2）酶的稳定性）酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋
9、白酶的酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抵抗力增加。抗力增加。 可能的原因：可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分可防止酶分子伸展变形；子伸展变形；抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 （3 3）酶的最适温度）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）升（有例外）。 （4 4）酶的最适）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适p
10、H pH 向碱性偏移。向碱性偏移。 带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。 （5 5）酶的动力学特征）酶的动力学特征 KmKm是表示酶和底物的亲和力大小的客观指标是表示酶和底物的亲和力大小的客观指标 酶经固定化后，酶经固定化后，KmKm一般都增大。一般都增大。最大反应速度最大反应速度VmVm与天然酶接近。与天然酶接近。 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。酶分子，导致酶的专一性发生改变。（6 6）酶的作用专一性）酶的作用专一性 与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。与固定化酶相比，固
11、定化细胞的情况比较复杂。 （1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。3 3、固定化细胞的性质、固定化细胞的性质 (1)(1)酶酶( (细胞细胞) )的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。有两种方法：固定化酶。有两种方法：分批测量和连续分批测量和连续测量。测量。 五、固定化酶（细胞）的评价指标五、固定化酶（细胞）的评价指标 (2)(2)偶联率及相对活力偶联率及
12、相对活力 偶联率偶联率=(=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/)/加入蛋白加入蛋白活力活力100%100%活力回收活力回收= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ /加入酶的总活力加入酶的总活力100%100%相对活力相对活力= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ (/ (加入酶的总活力加入酶的总活力- -上清上清液中未偶联酶活力液中未偶联酶活力) )100%100% (3)(3)半衰期半衰期 在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶( (细胞细胞) )的活力下降为的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以最初活力一半所经历的连续工作时间，以t t1/2
13、1/2表示。表示。 是衡量稳定性的一项重要指标。是衡量稳定性的一项重要指标。酶和固定化酶在体外进行催化反应时，都必需在一定的反应容器中进行，以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所合适的场所和最佳的反应条件最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处
14、理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量n生物反应器设计的主要目标： 使产品的质量最高，生产成本最低使产品的质量最高，生产成本最低。n评价生物反应器的主要标准： 反应器生产能力的大小和产品质量的高低反应器生产能力的大小和产品质量的高低。(4) (4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。能力下降。(1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度（或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。才能得到较大的产品转化
15、率。(2) (2) 能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。能用电脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。(3) (3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反应器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反应器
16、具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。反应器类型适用的操作方式适用的酶 特点鼓泡式反应器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难 喷射式反应器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应(1)间歇式酶反应器n又称为批量反应器（Batch Reactor BSTRBSTR）、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物
17、一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。 n优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。n缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。(2) 连续式酶反应器n又称为连续搅拌釜式反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTRCSTR）、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。n优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相
18、同，并与输出成分一致。n缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。底物溶液进口 反应液出口 (3) 填充床反应器n填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。n优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。n缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。
19、(4) 流化床反应器n流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。n特点是：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其流动方式使反应液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之间。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。(5) 鼓泡式反应器(6) 膜反应器MRMR连续搅拌罐连续搅拌罐超滤膜反应器超滤膜反应器 简称CSTR-UFR。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。n影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：下几个方面考虑： 酶的形式(游离/固定化.) 固定化酶的形状 底物的物理性质 酶反应动力学性质 酶的稳定性 操作要求 反应器制造、控制成本
