1、食品卫生微生物学检验（优选）食品卫生微生物学检验2、菌落总数测定 1、范围 本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。 本标准适用于各类食品中菌落总数的测定。 2、规范性引用文件。2、菌落总数测定 3术语和定义 菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等）所得1ml（g）检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧的菌落总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 cfu：colony-forminguni
2、ts菌落形成单位，一个细菌在平板计数琼脂培养基上生长形成肉眼可见的菌落。2、菌落总数测定4、设备和材料2、菌落总数测定8 菌落总数测定中的一些要求和规定菌落总数测定中的一些要求和规定（1）检验中所用器皿灭菌前彻底洗涤干净。（2）稀释液可用灭菌生理盐水、蒸馏水或磷酸盐缓冲稀释液。（3）样品处理A、液体样品要充分混匀。含二氧化碳的酒类和饮料，要打开待气体全部逸出后方可检验。酸性样品用1mol/LNaoH,碱性样品用1mol/LHcl调节PH7.0-7.2。B、固体样品，含盐分高的食品用无盐稀释液，鱼、肉类样品用菌质器研磨均匀（4）空白对照A、样品所用的稀释液，每批都要有空白对照。B、有颗粒的食品（
3、特别是10-1的稀释液）可同时作一块平皿4环境放置，计数时用作对照。C、做样品的同时净化室或净化台空气暴露时间作一块平皿对照。（5）培养温度、时间样品加入营养琼脂凝固后，一定要翻转平皿放36培养48小时，鱼、虾类水产品生活环境水温较低，多采用30培养72小时。（6）菌落计数选取30-300之间作为测定标准，1个稀释度取2个平板取平均数，如果平板上出现链状菌落，一条链为一个菌落，来源不同的几条链每条为一菌落。如乳酸杆菌和酵母菌应排除不计。(7)稀释度的选择a选取30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告b2个稀释度都在30-300之间的视二者之比报告，比值2报告其中较小的数，比值2报告其平均数。
4、c所有的稀释度平均数都30，按稀释度最低的报告。d所有的稀释度均无细菌生长，结果1，乘以稀释倍数报告。e如果几个稀释度都多不可计，按稀释度最高的乘以稀释倍数报告。(8)菌落数的报告（见表）大肠菌群 大肠菌群测定GB/T4789.3-2003 1范围 2规范性引用文件 3术语与定义 4设备和材料 5培养基和试剂 6检验程序 7操作步骤 8大肠菌群测定中的一些要求和规定大肠菌群 1、范围本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。本标准适用于各类食品中大肠菌群的测定。 2、规范性引用文件 3、术语与定义下列术语和定义适用于本标准大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该
5、菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示大肠菌群测定 7操作步骤 （1）样品稀释 （2）乳糖发酵试验 （3）分离培养 （4）证实试验 （5）结果报告大肠菌群测定 8大肠菌群测定中的一些要求和规定 （1）检验步骤 （2）抑菌剂 （3）挑选菌落 （4）产气量 （5）MPN检索表大肠菌群菌落色泽与检出率的关系培养基黑紫色有金属光泽无金属光泽粉红色粉色EMB平板 30/30(100)133/153(86.9) 53/95(55.8)37/69(53.6)粪大肠菌群测定定
6、义：系指一群在44.5条件下能发酵乳糖，产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。粪大肠菌群测定操作程序：乳糖胆盐发酵管产气转种EC肉汤44.5242h产气管划线转种EMB平皿361824h有典型菌落者，证实为粪大肠菌群阳性。大肠杆菌 大肠杆菌测定 1初发酵 2复发酵 3平板分离 4营养琼脂斜面 5生化实验 6结果报告大肠杆菌革兰氏阴性短杆菌，大小0.513微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。染色法、培养基和试剂 细菌的染色 常用染料人工合成含苯的化合物，带有
7、染色基团及助色基团。染色基团可使细菌着色，助色基团增加两者之间的亲和力决定染料的酸碱性。碱性染料：结晶紫、美兰、碱性复红。酸性染料：伊红、刚果红。中性染料：姬母萨、瑞氏。常用染色方法 简单染色常用染色方法 复合染色特殊染色革兰氏染色法：革兰氏染色法： 革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生医生Hans Christian Gram于于1884年创立的染色方年创立的染色方法，它包括初染、媒染、脱色、法，它包括初染、媒染、脱色、复染较复杂的鉴复染较复杂的鉴别染色别染色。 基本步骤：基本步骤： 涂片固定涂片固定 结晶紫初染结晶紫初染1min 碘液媒染
8、碘液媒染1min95%乙醇脱色乙醇脱色0.5min 沙黄复染沙黄复染1min 结果结果: 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌紫色；紫色； 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌红色。红色。影响革兰氏染色因素 操作技术因素 染液的因素 细菌自身因素 革兰氏染色的结果，可受许多因素影响，造成错误的染色反映，导致错误的鉴定结果。(1)操作技术因素 涂片不要过厚，应保持细菌分散均匀，固定时应避免菌体过分受热，脱色时间应反复实践积累经验，根据标本性质而灵活掌握。一般以流下的脱色剂不带有颜色即可。(2)染液的因素 所用染液均应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸，而失去媒染的作用，故应保存于棕色磨口滴
9、瓶中，若发现碘色已淡则应弃取。脱色酒精浓度95%为好，如果浓度不够或涂片上积水过多均可影响脱色不好。(3)细菌本身因素 注意菌龄，一般以18-24h培养效果较好，如细菌过于衰老或死亡，G+菌结果可呈G-菌反应。影响革兰氏染色因素培养基根据各种微生物生长的需要，用人工的方法将多种营养物质配合制成的一种混合营养料。配制培养基的原则 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，合成
10、培养基，麦芽汁培养基等。营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（CN）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。例如在微生物的谷氨酸发酵中，培养基的CN为4：l时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当CN为3：1时，菌体繁殖受到抑制，而谷氨酸大量增加。控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适p
11、H各不相同，细菌与放线菌生长的pH在77.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要加酸或加碱。培养基的种类 按培养基的物理状态分类 按培养基的功能分类 按培养基的组成成分分类培养基的物理状态液体培养基：液体培养基不含任何凝固剂，它常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.7的
12、琼脂构成的培养基。常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。固体培养基：在液体培养基中加入1.5-2.0%的凝固剂制成的呈固体状态的培养基。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。科研与生产中常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶三种，除在液体培养基中加入凝固剂之外，一些由天然的固体基质制成的培养基也属于固体培养基培养基的用途及功能1、基础培养基:含有细菌生长的基本营养成分，碳源、氮源及生长素，最常用的是肉浸液。2、营养培养基：营养培养基是指在基础培养基里加过葡萄糖、血液和生长因子等一些特殊成分，常用是血琼脂平板。3、鉴别培养基：培养基中加入特定的作用底物指示剂，利
13、用细菌分解糖类和蛋白质的能力及代谢产物的不同来鉴别细菌。4、选择培养基：培养基中加入某种化学物质及抗生素，抑制一些细菌生长，有助于需要的细菌种类的生长。5、特殊培养基：包括厌氧菌培养和细菌L型培养，加入合适的营养成分及还原剂等。13. 行动是治愈恐惧的良药，而犹豫、拖延将不断滋养恐惧。1. 最短的距离是从手到嘴，最长的距离是从说到做。10、为明天做准备的最好方法就是集中你所有智慧，所有的热忱，把今天的工作做得尽善尽美，这就是你能应付未来的唯一方法。6. 再长的路，一步步也能走完，再短的路，不迈开双脚也无法到达。24、一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。14. 投资知识是明智的，投
14、资网络中的知识就更加明智。3. 相见时难别亦难，东风无力百花残!6. 人的痛苦只能在生活和劳动中慢慢消磨掉，但朋友，没有什么灵丹妙药比得上劳动更能医治人的精神创伤。10、权威是你把权给别人的时候，你才能有真正的权利，你懂得倾听懂得尊重，承担责任的时候，别人一定会听你，你才会有权威。10. 滴水能穿石，只因为它永远打击同一点。8. 温暖是飘飘洒洒的春雨;温暖是写在脸上的笑影;温暖是义无反顾的响应;温暖是一丝不苟的配合。6. 成功的人是跟别人学习经验，失败的人只跟自己学习经验。15、夫妇一条心，泥土变黄金。13. 宁愿辛苦一阵子，不要辛苦一辈子。19. 目标的坚定是性格中最必要的力量源泉之一，也是成功的利器之一。没有它，天才也会在矛盾无定的迷径中徒劳无功。5. 人一般的时候眼睛是黑的，心是红的。可当眼睛的红的时候心就黑了。15. 苦忆旧伤泪自落，欣望梦愿笑开颜。12. 梦中冥冥有乐趣，觉后空空无大千。
