1、Cdks与Cyclins的结合磷酸化与去磷酸化蛋白质降解基因表达调控CKI的结合空间分布细胞内外信号的协调 Cdk亚单位的抑制型磷酸化处于无活性的磷酸状态。当有丝分裂开始时，这些磷酸化的突然去除导致了所有M-Cdk的激活，触发了G2/M检验点的转换。 第一节 细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶 动物细胞包括至少九种Cdks，其中只有四种（Cdk1,2,4,6）直接参与了细胞周期调控 Cdk功能在进化中高度保守。如果把酵母的Cdk1基因替换为人的Cdk1，酵母细胞依然能正常增殖。 Cdks能磷酸化几百种不同的蛋白质。Cdk蛋白识别的特定序列的丝氨酸或苏氨酸残基。 Cdks典型的磷酸化序列是S/T*PXK
2、/R，其中S/T*是指磷酸化的丝氨酸或苏氨酸，X代表任意氨基酸，K/R代表碱性氨基酸赖氨酸（K）或精氨酸（R）。小的氨基端小叶大的羧基端小叶 一个大的可弯曲的环T-环或激活环从羧基端小叶伸出，可阻止蛋白底物结合到活性位点缝隙入口处。未激活状态下，Cdk活性位点的很多重要氨基酸侧链定位不正确，使得ATP的磷酸根定向不利于激酶反应。T-loopPASTAIRE螺旋 (也叫1螺旋)与细胞周期蛋白直接作用，结合时向内移动，引起与ATP磷酸根作用的残基重新定向。 细胞周期的设定。二、细胞周期蛋白的结构二、细胞周期蛋白的结构细胞周期调控系统的活性受到多种因素的调节使得Cdk2构象发生变化，最明显的变化发生
3、在T环（T-loop）处，Cyclin的结合也使L12小螺旋转化为链， 使后面的T环发生重构，不再堵塞蛋白底物的结合位点，而是在缝隙入口处几乎平坦排列。一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件底物的靶向性： Cdks：T-环与底物的SPXK的保守序列作用。 细胞周期蛋白：疏水斑与底物上的RXL基序作用1. Cks1：磷酸根结合袋的存在能使其靶向那些含有多个磷酸化位点的靶蛋白。一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件 决定Cdk的底物特异性。位于cyclin表面称为疏水斑的区域，与含有互补疏水序列称为RXL（或Cy）的基序的底物以中度亲和力结合。 cyclin结合的也可以将Cdk带到
4、其底物所在的空间部位。有些cyclin包含有序列信息，能够靶向自身和它们的Cdk同伴到特定的亚细胞部位。 一、与cyclin的结合是Cdk活化的基本条件活化磷酸化：不去磷酸化抑制磷酸化：去磷酸化二、 磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤(1) Cdk的活化磷酸化: Cdk活化激酶（CAK）催化、发生在邻近激酶活性位点的苏氨酸残基发生磷酸化。二、 磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤 磷酸化使T环变平，移向cyclinA，使Cdk和cyclin的相互作用更加稳定。 Thr160的磷酸化使T环能够有效地与含有SPXK保守序列的蛋白底物作用。二、磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤
5、(2) Cdk的抑制磷酸化 由于Cdks的活化性磷酸化不受去磷酸化的调控，两种抑制磷酸化就在调节Cdk活性中起着重要作用：一个是保守的酪氨酸残基（人Cdks 的Tyr15），这存在于所有的Cdks中。附近的苏氨酸残基（Thr14）的磷酸化进一步阻碍了Cdk的活化。 Thr14和Tyr15位于激酶的ATP结合位点的顶端，它们的磷酸化可能通过干扰ATP磷酸根的方向而抑制Cdk活性。这些抑制性磷酸化位点的去磷酸化对cyclin-Cdks的激活至关重要，是开关样激活的关键开关位点。二、 磷酸化与去磷酸化是控制Cdk活性的开关步骤 蛋白激酶Wee1：负责Tyr15的磷酸化 蛋白激酶Myt1：催化Thr1
6、4和Tyr15的磷酸化 抑制性位点的去磷酸化由Cdc25家族的磷酸酶来执行。 抑制性位点的去磷酸化由Cdc25磷酸酶家族执行，Cdc25家族在脊椎动物中有三个成员（Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C）。两种酶都受到它们有丝分裂底物M期cyclin-Cdk复合物的调节：由M-Cdk导致的磷酸化抑制Wee1而激活Cdc25。因此，在有丝分裂开始阶段，M-Cdk激活了它自身的激活因子，抑制了自身的抑制因子，形成了正反馈环来产生开关样的Cdk激活。尽管CKI的蛋白氨基酸序列的相似性很小，它们却拥有一些共同的重要功能特性。 第一，CKI主要是S-和M-Cdk复合物的重要抑制因子，在细胞中高水平表达
7、以确保在G1期中不存在任何S-或M-Cdk活性。 第二，CKI不能抑制G1/S-Cdks，因此，它们不能阻断这些激酶在起始检查点的激活。 最后，这些抑制因子最后要被Cdks磷酸化后降解。在G1期的晚期，上升的G1/S-Cdk活性能降解这些抑制因子以允许S-Cdk在S期开始阶段被激活。三、 CKI对G1期Cdk活性的抑制 三、CKI对G1期Cdk活性的抑制三、CKI对G1期Cdk活性的抑制三、CKI对G1期Cdk活性的抑制三、CKI对G1期Cdk活性的抑制 远祖真核细胞的细胞周期可能只由一个cyclin-Cdk振荡器操纵，但现代的真核生物拥有多个不同的cyclin-Cdk复合物，它们以固定的顺序
8、被激活和失活。这种顺序的形成取决于不同cyclin的基因转录在不同细胞周期阶段顺序激活。 芽殖酵母大约800个基因或裂殖酵母蛋白编码基因的约15%，在细胞周期中显示出明显的表达变化四、cyclin的水平震荡由基因表达调控 在G1期的晚期通过起始点时表达，约300个成员。包括G1/S细胞周期蛋白、S期细胞周期蛋白，以及编码染色体复制和其他S期事件所必需酶的基因。 G2/M期转换和有丝分裂时表达，约120种，包括了编码M期细胞周期蛋白的基因。 有丝分裂后半段和G1期表达，大约含110种基因，包括编码Cdk抑制因子的基因。四、cyclin的水平震荡由基因表达调控G1是细胞周期中承前启后的重要时期，一
9、方面细胞要清除上一个周期的各类调节因子的残存，为下一次DNA复制做好准备；另一方面，为了维持细胞体积的恒定，细胞生长的调节机制必须让细胞在这个时期大量合成细胞内容物，争取在下次分裂前细胞的体积能够加倍。当增大细胞的体积到一定的阈值时，就传递某种信号给细胞周期调控系统，不可逆地启动下一个新细胞周期的进程。例2：G1期Cdk的活性调控方式例2：G1期Cdk的活性调控方式 动物细胞Start检验点之前，G1/S基因的表达被抑制型E2F的结合而抑制。所以Start检验点G1/S基因表达的升高依赖于抑制型E2F从G1/S基因的启动子上去除，并被置换成激活型的E2Fs。这个过程依赖于pRB蛋白质的失活。
10、例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达 细胞跨过Start检验点，激发G1/S基因表达的关键是pRB的磷酸化。pRB蛋白是细胞周期的主要刹车机制，通过结合转录因子E2F，抑制了E2F的转录激活功能。例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达 周期蛋白 D-Cdk复合物只催化了部分pRB的磷酸化和E2F的激活。E2F的完全激活只有在G1期的末段G1/S-Cdk：周期蛋白 E-Cdk2的活性升高并完成pRB蛋白的磷酸化作用后。 正反馈例2：G1期Cdk的活性调控方式：基因表达一个细胞周期事件向下一个细胞周期的转换是单向的并且是不可逆的，这个不可逆性可以通过Cdk激活的不可逆性来部分实现，更重要
11、的保证是cyclin的降解。有丝分裂cyclin降解保证了有丝分裂的退出，也使Cdk活性在G1期维持低的状态。周期蛋白，CKI和其他细胞周期调控因子通过泛素化途径被定向降解。泛素化经过一系列反应中完成泛素激活，泛素偶联和泛素蛋白连接作用，泛素化的蛋白质最后被称为蛋白酶体（proteasome）的巨大蛋白酶复合体识别并降解。 五、蛋白质降解控制了细胞周期的单向性 泛素-蛋白连接酶通常在泛素化机制中是最重要的调节靶蛋白，一方面是因为它们在泛素化过程中是靶蛋白特异性的主要决定因素，另一方面是因为它们是催化该过程的限速步骤。 G1/S转换:关键的泛素-蛋白连接酶是称为SCF的一种酶，它的命名来源于其三
12、个中心成分Skp1,cullin和F-盒。 中后期转换:关键的泛素-蛋白连接酶为后期促进因子（APC）或cyclosome。5. 蛋白质降解控制了细胞周期的单向性 有丝分裂后半段事件主要受到两种机制的调控：APC介导的蛋白质降解作用和Cdk1磷酸化底物的去磷酸化作用。 APC控制了细胞周期调控检查点的启动：中期后期转换检查点。当细胞进入中期时，姐妹染色单体的分离被强大的抑制系统阻止。而当姐妹染色单体一旦完成双指向整列，这些“刹车系统”就被泛素蛋白连接酶APCCdc20酶解去除。APCCdc20将蛋白质泛素化修饰，使之被定向酶解，进而发动不可逆转的后期进程，并退出有丝分裂。 APCCdc20触发
13、了两个关键调控蛋白的泛素化和酶解： 第一，securin的酶解释放出蛋白酶分离酶（separase），切割黏连蛋白的Scc1亚基，打破姐妹染色单体之间的黏合； 第二，有丝分裂cyclin的酶解导致很多Cdk靶蛋白的去磷酸化，这为有丝分裂后半段事件的发生所必需。 不同的激活因子决定APC的底物特异性 APC的激活因子有两种：Cdc20和Cdh1。有丝分裂的前半段和后半段的开始时，Cdh1被Cdk磷酸化，与APC的结合被抑制。此时APC结合Cdc20，其底物主要为S，M期cyclin和securin。有丝分裂中期Cdk的失活使APC与Cdh1去磷酸化，从而导致APC与Cdc20结合下降而与Cdh1
14、亲和力增加，形成的APCCdh1的其中一个靶蛋白又是Cdc20，这样就彻底关闭APCCdc20的功能。同时APCCdh1决定了其他不被APCCdc20识别蛋白质的酶解，如有丝分裂蛋白激酶Plk和Aurora A。所以Plk和Aurora A的降解的时间要晚于cyclinB-Cdk1，这对有丝分裂的退出至关重要。2抑制因子决定了APC激活的时间 一个叫Emi1的蛋白质在G2期和有丝分裂的前半段与Cdc20结合，并可能阻碍其与APC的相互作用而抑制了APC的活化。 在前期的末段，Emi1可以同时被Plk和cyclinB-Cdk1复合物磷酸化，为泛素蛋白连接酶SCFb-TrCP1所识别，导致Emi1
15、在前中期被酶解，释放出Cdc20，形成有活性的APCCdc20。Emi1水平在G1期结束时再次升高，抑制了APCCdh1的活性。3. Cdk1的磷酸化控制了APCCdc20的激活 APCCdc20激活的最为重要和普遍的机制是有丝分裂Cdk对APC核心亚基的磷酸化，而磷酸化则启动了其与活化亚基Cdc20的结合。 APC的磷酸化最早发生在前期末段的细胞核，在周期蛋白B1-Cdk1复合物刚刚被激活并转移入核之后和核膜破裂之前的一段时间。体外实验证实，Cdk1依赖的APC的磷酸化提高了其与Cdc20的亲和性，而突变APC的一系列Cdk1磷酸化位点则降低其与Cdc20的结合能力，从而延迟了APC的激活。
16、4APCCdc20活性也可能为其在细胞内的定位所调控 前中期细胞APCCdc20只对S期周期蛋白A发挥泛素化和酶解作用的一个可能的解释是，周期蛋白A的酶解由特殊的APCCdc20亚群负责，这些APCCdc20被限制在特定的部位，不能为纺锤体检查点蛋白质接触抑制。 在果蝇早期胚胎，当合胞体细胞核快速通过有丝分裂时，大部分有丝分裂周期蛋白B保持稳定。然而，定位在有丝分裂纺锤体的少部分周期蛋白B在每次有丝分裂时都被特异地酶解，这样大概可以允许局部的Cdk1被失活，从而启动有丝分裂后半段的事件。 局部的周期蛋白的酶解被认为是APCCdc20在纺锤体微管集中分布的结果。APCCdc20在细胞内的定位分布
17、使其更易于与一些底物相互作用，而阻止或延迟与其他底物的结合。 周期蛋白B1-Cdk1进入细胞核内：在前期的末段瞬间进入，大部分。 周期蛋白 B1-Cdk1停留在细胞质：少部分，促进其他有丝分裂的过程，如中心体的分开和高尔基体的重构。6. 空间分布提供了Cdk另外一种形式的调控机制 与大部分蛋白一样，周期蛋白 B1-Cdk1的核质比率受到蛋白核输入与核输出相对比例的控制。在有丝分裂前，周期蛋白 B1-Cdk1输入的比率很低而输出比率较高，因而产生净的细胞质定位。然而在前期的末段，输入比率增加而输出比率降低，使周期蛋白 B1-Cdk1在细胞核内聚集。 Cdk1和Plk磷酸化周期蛋白 B1和Cdc2
18、5C。这就遮蔽了两个蛋白上的核输出信号，减少了它们核输出的比率 6. 空间分布提供了Cdk另外一种形式的调控机制 Cdc25C的定位依赖于核输入与输出的相对比率。Cdc25C由不同的机制进行输入和输出，但两者都受到磷酸化的调节。 与很多能在核质穿梭的蛋白一样，Cdc25C含有能与核输入运载体作用的核定位信号，以及能与Crm1输出因子作用的核输出信号，这些信号定位在蛋白氨基端区域的不同部位。 Cdc25C在靠近核定位信号的Ser216（人）或Ser287（非洲爪蟾）被磷酸化，为称为14-3-3的小磷酸化丝氨酸结合蛋白提供了结合位点，这就遮蔽了核定位信号，因而减少了Cdc25c的核输入（不影响核输
19、出信号） 6. 空间分布提供了Cdk另外一种形式的调控机制 磷酸化这一位点的两个激酶，Chk1和Chk2，在DNA损伤后激活。它们对Ser216/287的磷酸化可能为DNA损伤而抑制有丝分裂的进入提供了理论基础。 Cdc25C的核输出信号位于靠近有丝分裂期启动Cdc25C激活的多个磷酸化位点处。这一区域的磷酸化可能受Plk和Cdk1作用不仅刺激了Cdc25C活性，也遮蔽了核输出信号，从而减少了核输出比率。Plk因此似乎也能同时促进Cdc25C及其靶标周期蛋白B1-Cdk1在细胞核内积累和激活。6. 空间分布提供了Cdk另外一种形式的调控机制6. 空间分布提供了Cdk另外一种形式的调控机制 二、
20、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性二、有效的双开关需要双稳定性加入正反馈，转化为一个双稳态的，开关样的系统 添加酶Wee1和Cdc25 如条件合适，含负反馈的系统可产生重复的震荡。 例如我们的系统包含一个磷酸酶，它能缓慢地将抑制因子和激酶去磷酸化，使它们失活。当激酶活性非常高时，磷酸酶受到抑制，大量的抑制因子发生磷酸化：负反馈 然而当负反馈抑制激酶时，激酶活性的降低使得磷酸酶可以将激酶和抑制因子都发生去磷酸化，系统从而回到激酶和抑制因子未被磷酸化，无活性的基础状态。
