1、1第第6 6章章 食用菌基因工程食用菌基因工程Section 6 Genetic engineering in edible fungi概念食用菌外源基因表达系统宿主的选择载体构建银耳芽孢外源基因表达系统双孢蘑菇外源基因表达系统-2 基因工程实际上就是基因重组，就是按照人类的需要把这种生物的“基因”与另外一种生物的“基因进行重新组合，“组装”成新的基因组合，创造出新的物质或生物（基因工程菌）。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因表达产生新的物质或新生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成
2、了生物工程。u 什么是基因工程？什么是基因工程？-3（1）目的基因；）目的基因；（2）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病）表达元件及表达载体（即将目的基因与质粒或病毒毒DNA连接成重组连接成重组 DNA）；）；（3）转化方法（把重组）转化方法（把重组DNA引入某种细胞）；引入某种细胞）；（4）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑）重组体的筛选（把目的基因能表达的受体细胞挑选出来）。选出来）。 u基因工程的主要要素基因工程的主要要素-4食用菌外源基因表达系统食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择一、宿主的选择-5u现有外源基因表达系统的缺陷现有外源基因表达系统的缺陷l大肠杆菌表达系统
3、大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，表达蛋白活性蛋白质翻译后修饰加工体系不完善，表达蛋白活性 低或没有活性低；低或没有活性低；细胞产生内毒素，影响表达蛋白的纯化；细胞产生内毒素，影响表达蛋白的纯化；细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒，包涵体细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒，包涵体要用变性剂溶解，再通过复性才能得到在缓冲液中溶要用变性剂溶解，再通过复性才能得到在缓冲液中溶解的蛋白解的蛋白-6l酵母表达系统酵母表达系统表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露表达产物过渡糖基化：酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基，常形成过长的侧链，如糖残基，常形成过长的侧链，如cel基因的表达；基
4、因的表达；表达产物缺乏糖基化：如人尿激酶基因（表达产物缺乏糖基化：如人尿激酶基因（uPA）有）有一一O-糖基化位点，酵母缺乏在该位点的糖基化；糖基化位点，酵母缺乏在该位点的糖基化；表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些 差异差异-7成本高、工艺复杂；我国成本高、工艺复杂；我国20多产家还处于转瓶生产多产家还处于转瓶生产（EPO和乙肝疫苗），年产量不足和乙肝疫苗），年产量不足100g/year；细胞凋亡难以克服（细胞凋亡难以克服（CHO细胞）细胞）l哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统l丝状真菌表达系统丝状真菌表达系统-8u食用菌作为外源基因
5、表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食，营养丰富，是健康食品和保健食品；食用菌美味可食，营养丰富，是健康食品和保健食品；-9培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层发酵培养，还可以利用农业下脚料进行工罐大规模深层发酵培养，还可以利用农业下脚料进行工厂化种植；厂化种植；u食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点-10食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基食用菌是高等真核生物，表达真核生物的基 因活性高；因活性高；食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于目的食用菌有良好的蛋白分泌能力，有利于
6、目的 蛋白的分离和纯化；蛋白的分离和纯化；遗传转化系统容易建立遗传转化系统容易建立u食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点-11银耳是一食药兼用菌银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖-12银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核，具有独特的繁殖特性银耳芽孢单核，具有独特的繁殖特性出芽繁殖，出芽繁殖，和酵母一样，生长速度快，容易培养和酵母一样，生长速度快，容易培养-13u银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点-14银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系银耳芽孢是高等真核生物，翻译后的蛋白质修饰系统
7、完善，表达高价值的真核生物基因的活性高统完善，表达高价值的真核生物基因的活性高银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢营养丰富，可食安全银耳芽孢营养丰富，可食安全-15二、载体构建二、载体构建(一）质粒载体的组成一）质粒载体的组成 克隆载体克隆载体：含抗性基因、自主复制序列（：含抗性基因、自主复制序列（ori）常用克隆质粒载体常用克隆质粒载体（1）pUC系列（含系列（含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site）（2）pBR322 (含含ampr、tetr、 Mutiple cloning site)（3）Bluescript
8、 M13系列（含系列（含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site）（4） 噬菌体载体噬菌体载体-16-17-18pGgpd3670bplaczlaczf1 oriAmp+Ggpd promoterSpeApaAatSphBstZSacNcoEcoREcoR NotBstZPstSalNdeBstZNotSacBstXNsiGgpd prom oter60bpSacNcopGg-gfp4632bpGgpd promoterGFPterminatorAmp+SacNcoSac是Spe、Sac双酶切 Nco、Sac双酶切adaptor1bpSpeEcoRPstNcoGgpd p
9、romoter60bpSacPstNcoSpeEcoRvector fragment3920bpAmp+GFPterminatorSacSacNcopBluescritGFP4221bpabgpd promoterGFPterminatorAmp+SacSacNcogpd promotor-19表达载体表达载体:组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。-20-21Eco RI 5 -G A A T T C- 3 3 -C T T A A G- 5Pst I5- C T G C A G -33- G A C G T C-5Hae III
10、5-G G C C -33-C C G G -5-22食用菌常用启动子：食用菌常用启动子：1 1）rasras （Le.ras.geneLe.ras.gene）启动子；）启动子；2）gpdgpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)启动子；启动子；3）sprspr1(serine proteinase gene )1(serine proteinase gene )启动子；启动子；4 4）trptrp1 1（tryptophan synthetase genet
11、ryptophan synthetase gene）启动子；）启动子；5）其他：）其他：cel1(cellulose-growth-specific gene )cel1(cellulose-growth-specific gene )启动子、启动子、cel3 cel3 启动子、启动子、cel4cel4启动子、启动子、pri(primase gene )pri(primase gene )启动子、启动子、gla1(glu-coamylase gene )gla1(glu-coamylase gene )启动子等。启动子等。-23 筛选标记筛选标记 （1 1）营养缺陷型标记）营养缺陷型标记 ：营
12、养缺陷互补标记基因有:A) ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化;B) pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化；C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化;D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。-24（2）抗生素抗性筛选标记）抗生素抗性筛选标记 ： 抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。主要有：卡那霉素抗性基因（kan+）;氨苄青霉素抗性基因（Amp+)潮霉素抗性基因（Hyg+）;腐草霉素抗性基因（Phl+）;博来霉素抗性基因（Ble+）。 在培养基中添加抗生素进行筛选。-25（3 3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记 ： A) 如Bia
13、laphos 抗性基因; B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;-26（4）代谢产物抗性筛选标记）代谢产物抗性筛选标记 如从鬼伞中分离得到的如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲基因。该基因是抗氟基吲哚（哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不敏感，而对敏感，而对5-FL十分敏感，当把十分敏感，当把trp3iar 转入草菇和平菇时，转入草菇和平菇时，这两种食用菌就能对这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的产生抗性，达到筛选的目的 。-27载体构建策略载体构建策略（）选择合适的表达载体（）选择合
14、适的表达载体:含启动子、筛选标记、终含启动子、筛选标记、终 止子止子（）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点（）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点举例说明举例说明食用菌启动子功能检测载体构建过程食用菌启动子功能检测载体构建过程 -28pLras3670bplaczlaczf1 oriAmp+ras promoterSpeApaAatSphBstZSacNcoEcoREcoRNotBstZPstSalNdeBstZNotSacBstXNsipBluescritGFP4221bpabgpd promotergfpterminatorAmp+SacSacNco1ras promoter60bppLr-
15、gfp4950bpras promotergfpterminatorAmp+SacNco1Sac Nco 、 Sac 双 酶 切 Nco 、 Sac 双 酶 切vector fragment 3920bpAmp+gfpterminatorSacSacNco1-29三、遗传转化方法三、遗传转化方法PEG法；法；电击法；电击法；基因枪法；基因枪法；限制酶介导法；限制酶介导法；农杆菌介导法；农杆菌介导法；-30PEG(polyethylene glycol )法最早是由法最早是由Davey等以矮牵牛悬等以矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无菌苗分离的原生等以烟
16、草无菌苗分离的原生质体为受体，在质体为受体，在PEG的协助下开创性地把裸露的的协助下开创性地把裸露的DNA直接转直接转化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移化植物原生质体而创立的，他们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。到受体细胞奠定了基础。主要原理：主要原理：PEG能使细胞膜之间或能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，与膜之间形成分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融合或外源DNA的进的进入。入。 主要应用：酵母
17、、蘑菇、平菇、草菇主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇 、鬼伞等、鬼伞等（一）（一）PEG法；法；-31 电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔电激穿孔”（ElectroporationElectroporation）形成可逆的瞬间通）形成可逆的瞬间通道，从而 促 进 外 源道，从而 促 进 外 源DNADNA 的摄取。该法自的摄取。该法自 19791979 年年ZimmerannZimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛应用于动物、植物的遗传转化研究上。应用于动物、植物的遗传转化研究上。1
18、9911991年，年，Royer Royer JCJC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因URA1URA1导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得导入同源的杨树菇营养缺陷型突变菌株中，获得正常表达的杨树菇正常表达的杨树菇 ，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该，接着蘑菇、平菇、草菇等也用该法进行遗传转化，获得转化子。法进行遗传转化，获得转化子。 （二）电激法（二）电激法-32-33基因枪法又称微弹轰击法（基因枪法又称微弹轰击法（Microprojectile bombardment）,自自Klein TM等等1987年首次利用钨粒年首次利用钨粒对洋葱的
19、组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植对洋葱的组织进行轰击试验以来，已被广泛应用于植物的遗传转化。物的遗传转化。主要原理：将外源主要原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。面，然后在高气压下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源微粒上的外源DNA也随之被带入细胞并整合到植物染也随之被带入细胞并整合到植物染色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。色体上，得到表达，从而实现了基因的转化。应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。应用：丝状真菌、蘑菇、草菇。 （三）基因枪法（三）基因枪法-34-35 这是九十年代发展起来的一种能较大幅度
20、提高转化率这是九十年代发展起来的一种能较大幅度提高转化率的方法，其英文为的方法，其英文为Restriction Enzyme-Mediated DNA Restriction Enzyme-Mediated DNA IntegrationIntegration， 简称简称REMI REMI 。它是由。它是由Schiestl RH Schiestl RH 等于等于19911991年第一次在酿酒酵母菌（年第一次在酿酒酵母菌（S. cerevisiae S. cerevisiae ）上创立）上创立使用使用2929 ，19921992年年Kuspa AKuspa A等在网柄菌（等在网柄菌（Dictyo
21、stelium Dictyostelium discoideum discoideum ）上发展了该法）上发展了该法 。此法应用于旋孢菌。此法应用于旋孢菌（Cochliobolus heterosporusCochliobolus heterosporus ） 、白色念球菌、白色念球菌（Candida albicans Candida albicans ）和食用菌上的鬼伞（）和食用菌上的鬼伞（Coprinus Coprinus cinereus cinereus ）、香菇（）、香菇（L.edodesL.edodes）等的遗传转化均能有效）等的遗传转化均能有效地提高转化率。地提高转化率。 （四）
22、限制性酶介导的（四）限制性酶介导的DNA整合法整合法-36主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位主要原理：限制酶穿透细胞膜和核膜，在特异的酶切位点活体切断染色体点活体切断染色体DNADNA，产生的染色体，产生的染色体DNADNA末端就会在宿主末端就会在宿主细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒细胞酶系的作用下与限制酶切断的线性化的质粒DNADNA相连相连接。该法亦可作为接。该法亦可作为REMIREMI标签对功能基因进行分离。标签对功能基因进行分离。 -37根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
23、 ）是一种革）是一种革兰氏阴性的土壤杆菌，它侵染双子叶植物的受伤部位并兰氏阴性的土壤杆菌，它侵染双子叶植物的受伤部位并形成冠瘿瘤，在冠瘿瘤的形成中，农杆菌只留在植物细形成冠瘿瘤，在冠瘿瘤的形成中，农杆菌只留在植物细胞间隙中，其环状质粒胞间隙中，其环状质粒TiTi上的上的T-DNAT-DNA在细菌内被加工、在细菌内被加工、剪切、复制后转入植物细胞并随机插入到植物的基因组剪切、复制后转入植物细胞并随机插入到植物的基因组中。中。农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然有效的遗传农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然有效的遗传工程系统，已广泛应用于双子叶植物和单子叶植物的遗工程系统，已广泛应用于双子叶植物和单子
24、叶植物的遗传转化研究上。传转化研究上。（五）农杆菌介导法（五）农杆菌介导法 -38应用：应用：1998年年de Groot MJA等首先把农杆菌介导法应用等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化，他以真菌的分生孢子和菌丝为受体成于真菌的遗传转化，他以真菌的分生孢子和菌丝为受体成功地把功地把T-DNA转入曲霉（转入曲霉（A.awamori）、木霉）、木霉（Trichoderma harzianum）、链孢霉（）、链孢霉（Neurospora crassa ）、双孢蘑菇（）、双孢蘑菇（A.bisporus ）、草菇中。）、草菇中。 -39银耳芽孢共转化表达载体银耳芽孢共转化表达载体pGlg-gfp
25、 4493bp gpd-GlgfpTAmp+SacNcoSacSpe IEcoRIBsrGIKpnIpGlg-hph 4918bp gpd-GlhphTAmp+SacNcoSacSpe IEcoRIBsrGIKpnI实例：银耳芽孢表达系统实例：银耳芽孢表达系统-40银耳芽孢完整细胞的转化银耳芽孢完整细胞的转化电击转化电击转化醋酸锂介导的转化醋酸锂介导的转化PEG介导的转化介导的转化-41转化子筛选转化子筛选银耳芽孢Tr01对潮霉素的抗性试验拟转化子在含潮霉素的抗性平板上CK-42 潮霉素抗性基因PCR鉴定-43 -44野生型Tr01-45 gfpgfp绿色荧光蛋白基因在银耳芽孢中的高效表达绿色
26、荧光蛋白基因在银耳芽孢中的高效表达发出绿色荧光的银耳芽孢发出绿色荧光的银耳芽孢-46 多功能纤维素酶基因（多功能纤维素酶基因（mfcmfc）在银耳芽孢中的表达）在银耳芽孢中的表达滤纸酶活性滤纸酶活性24.61U/mL-47 多功能纤维素酶基因（多功能纤维素酶基因（mfc）在银耳芽孢中的表达）在银耳芽孢中的表达CMCCMC酶活性酶活性27.32U/mL-48 多功能纤维素酶基因（多功能纤维素酶基因（mfcmfc）在银耳芽孢中的表达）在银耳芽孢中的表达木聚糖酶活性木聚糖酶活性140.43U/mL-49 多功能纤维素酶的分离多功能纤维素酶的分离45.8KDa-50致致 谢谢-51瞧！瞧！我们的团队！我们的团队！-52-
