1、蛋白质工程 蛋白质分子设计程序：各种蛋白质结构预测和分子设计程序 按照蛋白质分子设计的层次分为序列分析、二级结构预测、同源蛋白质结构预测、蛋白质突变体结构预测、蛋白质的性能预测和蛋白质分子设计六个部分 计算机模拟计算机模拟 基因构建基因构建突变蛋白质产品突变蛋白质产品功能分析功能分析天然蛋白质天然蛋白质蛋白质晶体学蛋白质晶体学新蛋白质新蛋白质蛋白质三维结构蛋白质三维结构结构与功能关系结构与功能关系蛋白质突变体设计及结构预测蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究几何优化及蛋白质动力学研究结构分析与原先的结构比较结构分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变蛋白质合成定位突变分离、纯化及
2、表征分离、纯化及表征蛋白质结构预测蛋白质结构预测从数从数据库据库输入输入蛋白质分子设计大致蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面涉及的几个重要方面 蛋白质来源：真菌、细胞、动物蛋白质和植物蛋白质 筛选以及纯化蛋白质需要测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等蛋白质三维结构的判断蛋白质三维结构的判断 目前PDB(Protein Data Bank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。1、对于已知三维结构的蛋白质：根据PDB中三维结构对蛋白质进行设计2、对于位置三维结构的蛋白质：如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体
3、学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型 计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的 专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易 二、蛋白质设计原理二、蛋白质设计原理 内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成 所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。所有内部的氢键都是最大满足的(主
4、链及侧链) 疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面 在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何，符合正确的键长、键角及整体的几何 对于金属蛋白，大部分配基含有多于一个 与金属作用或形成氢键的基团。其余形成围绕金属中心的氢键网络，这涉及与蛋白质主链、侧链或水分子的相互作用 最优的氨基酸侧链几何排列 结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志蛋白质设计的目标及解决办法设计目标解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积，增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换
5、为Gln、Val、Ile或Leu，把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换，内离子对的置换专一性的改变，增加逆转数(turnover number)，改变酸碱度三、蛋白质设计中的结构三、蛋白质设计中的结构功能关系研究功能关系研究 定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用定位突变在蛋白质结构与功能关系研究中的作用 突变蛋白质构象的探测突变蛋白质构象的探测定位突变种类定位突变种类 插入一个或多个氨基酸残基 删除一个或多个氨基酸残基 替换或取代一个或多个氨基酸残基 最大量的定位突
6、变是在体外利用重 组DNA技术或PCR方法突变蛋白质结构的评估突变蛋白质结构的评估 溶解性 热力学分析 射线晶体学及谱 园二色散方法 单克隆抗体探测构象变化1根据已知结构信息确定功能残基2突变实验方法鉴定功能残基 随机突变和删除分析及连接片断扫描突变3利用蛋白质同源性鉴定功能残基结构与功能的容忍度结构与功能的容忍度 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度 Fersht等替换了Barnase的所有内核残基。结果表明23的突变体保留了酶的活性 Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠 这些结果说明不同
7、的氨基序列具有相近的设计的结构 特征： 全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程，合成具有特异结构与功能的新蛋白质。根据所希望的结构及功能设计蛋白 质或多肽的氨基酸序列蛋白质的全新设计蛋白质的全新设计 蛋白质结构的从头设计 蛋白质功能的从头设计 取得的进展：血红素结合蛋白、 氧化还原活性蛋白质、 DNA结合蛋白 基于蛋白质的高分子材料二级结构模块单元的自组装：二级结构模块单元的自组装：优点：设计或合成都比较简单缺点：蛋白质的稳定性（熵较大，依赖浓度） 结构的简单重复螺旋设计螺旋设计使用的策略（使用的策略（p67）：）：1）使用大的形成螺旋倾向性的残基，如亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸等2）使用合适的集团去除端
8、基电荷，防止与螺旋偶极不合适的电荷相互作用3）使用极化或荷电氨基酸引入稳定的氢键或在螺旋中相隔一圈残基间的离子相互作用4）使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的范德华相互作用5）使用芳香-荷电-疏的相互作用蛋白质从头设计的手段蛋白质从头设计的手段配体诱导组装 配位结合位点设计在结构中有几个相互作用片断的界面处。如果这个位点对配体有很高的亲和力，则结合配体的合适的自由能将充分克服熵消耗并且驱动肽自组装通过共价交叉连接实现肽的自组装通过共价交叉连接实现肽的自组装在合成模板上肽的组装在合成模板上肽的组装线性多肽折叠为球状结构线性多肽折叠为球状结构基于组合库的全新蛋白质设计基于组合库的全新蛋白质设计P-N
9、-P-N-P-NP-N-P-P-N-N-P-P-NPNPPPNNP非极性残基由DNA密码子NTN编码 N：任何碱基极性残基由DNA密码子VAN编码 V：C、A、G的混合 二、蛋白质功能的全新设计二、蛋白质功能的全新设计 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化 为达到这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质蛋白质的功能设计蛋白质的功能设计通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能键合及催化的从头设计在全新蛋白质中引入结合位点催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计第三节第三节 计算蛋白质设计计算蛋白质设计 蛋白质设计是一个理论与实验之间的循环。这个循环已经在蛋白质的合理设计中得到了许多重要进展 计算蛋白质设计包括能量表达、能量优化、侧链构象的离散化、残基分类(内核、表面、边界)、功能位点设计、专一性、稳定性及序列空间的稳健性预测等方面内容
