1、第一章第一章 绪论绪论2012.09.12内容提要内容提要1. 1. 生物催化的学科基础生物催化的学科基础2. 2. 生物催化的基本概念生物催化的基本概念3. 3. 生物催化的技术特点生物催化的技术特点4. 4. 生物催化的由来和发展生物催化的由来和发展(1(1）资源危机：）资源危机：化石资源不可再生资源化石资源不可再生资源 (2(2）能源危机：）能源危机：化石燃料不可再生能源化石燃料不可再生能源 (3(3）环境危机：）环境危机：三废排放环三废排放环 境境 污污 染染 以化学催化为核心的以化学催化为核心的基础物质加工业面临潜在的危机基础物质加工业面临潜在的危机地球地球化学进化化学进化地球地球化
2、学循环化学循环人类人类物质文明物质文明基础物质加工业基础物质加工业效法自然效法自然, ,发展清洁高发展清洁高效的生物制造效的生物制造( (趋势）趋势）生物制造生物生物催化剂催化剂生物资源生物资源自然的生物催化和转化自然的生物催化和转化巨大巨大潜力潜力生物催化与生物转化是解决生物催化与生物转化是解决物质加工危机的有效途径之一物质加工危机的有效途径之一生物催化的定义生物催化的定义生物催化与转化是以生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行细胞或酶作为催化剂进行物质转化，大规模生产化物质转化，大规模生产化学品、医药、能源、材料学品、医药、能源、材料的技术科学。的技术科学。 它的特点是高效性、高选择性和
3、低污染。世界经它的特点是高效性、高选择性和低污染。世界经合组织合组织(OECD)指出：指出：“生物催化技术是工业可持续生物催化技术是工业可持续发展最有希望的技术发展最有希望的技术”。当前，如何利用微生物的丰富酶系和基因资源将地球表面富余的、可以再生的大量木质纤维素原料有效地转化为人类社会有用的生物质能源和生物基化学品及材料，便成为新一代工业生物技术研究的热门课题。 生物催化的学科基础生物催化的学科基础生物催化与化学催化生物催化与化学催化 生物催化与发酵技术生物催化与发酵技术生物催化与化学工程生物催化与化学工程生物催化是典型的交叉学科生物催化是典型的交叉学科化学化学生物学生物学化学工程化学工程生
4、物催化生物催化动力学动力学反应工程反应工程反应器设计反应器设计生物催化与化学催化生物催化与化学催化 生物催化与化学催化的作用原理一样生物催化与化学催化的作用原理一样酶几乎可以催化有机化学中的所有反应酶几乎可以催化有机化学中的所有反应酶创造了一个更温和更优越的反应条件酶创造了一个更温和更优越的反应条件反应反应E.C.编号编号酶酶Meerwein-Ponndorff-Verley还原还原1.1.1.1乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶Oppenauer1.1.1.1乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶Bayer-Villiger 氧化氧化1.14.13.22Bayer-Villiger单加氧酶单加氧酶醚键裂解醚键裂解1.14.
5、16.5甘油醚酶甘油醚酶歧化反应歧化反应1.15.1.1过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶转氨作用转氨作用 2.6.1.x氨基转移酶氨基转移酶水解作用水解作用3.1.-.-脂肪酶、酯酶脂肪酶、酯酶磷酸盐水解磷酸盐水解3.1.3.2/1酸酸/碱性磷酸酶碱性磷酸酶酯化反应酯化反应3.4.21.14枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶转酯反应转酯反应3.4.21.14枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶肟解反应肟解反应3.1.1.3脂肪酶脂肪酶酶几乎可以催化有机化学中的所有反应酶几乎可以催化有机化学中的所有反应CmHnN-源源 产物发酵产物发酵底物底物N-源源 生物转化生物转化底物底物产物前体发酵产物前体发酵底物底物酶催
6、化酶催化生物催化生物催化生物催化与发酵技术生物催化与发酵技术生物催化与发酵技术生物催化与发酵技术发酵：利用一些工业原料如含有糖、淀粉的糖蜜或玉米等发酵：利用一些工业原料如含有糖、淀粉的糖蜜或玉米等作为碳源，用活细胞发酵，可以生成更复杂的目标产物作为碳源，用活细胞发酵，可以生成更复杂的目标产物前体发酵：使用活细胞将特定的前体转化为目标产物前体发酵：使用活细胞将特定的前体转化为目标产物生物转化：用酶或静息细胞经过一些列步骤将前体转化成生物转化：用酶或静息细胞经过一些列步骤将前体转化成目标产物目标产物酶催化：通常用粗酶或部分纯化的酶将底物转化成目标产酶催化：通常用粗酶或部分纯化的酶将底物转化成目标产
7、物，纯酶很少使用，除非是生产高附加值的精细化学品物，纯酶很少使用，除非是生产高附加值的精细化学品生物催化与化学工程生物催化与化学工程化学工程注重反应及其过程性，研究传质、传热、传动现象酶反应工程的主要目标是在高化学选择性和高对映选择性条件下，实现高底物转化率的高时空产率酶催化反应中存在底物扩散、抑制、反应器设计等问题，其解决需要参考化学工程的理论SPKsKpSPE2.2.生物催化的基本概念生物催化的基本概念酶的分类及命名酶的分类及命名酶催化的机理酶催化的机理酶活力的测定要领酶活力的测定要领酶的种类及命名酶的种类及命名习惯命名法习惯命名法 酶的种类及命名酶的种类及命名国际系统命名法国际系统命名法
8、 该命名法规定，每种酶的名称应明确标明底物该命名法规定，每种酶的名称应明确标明底物及所催化反应的特征，即酶的名称应包含两部分：及所催化反应的特征，即酶的名称应包含两部分：前面为底物，后面为所催化反应的名称。前面为底物，后面为所催化反应的名称。 酶的种类及命名酶的种类及命名习惯用名 系统命名 催化的反应 乙醇脱氢酶 乙醇NAD+氧化还原酶 乙醇 NAD+ 乙醛 NADH + H+ 谷丙转氨酶 (GPT) 丙氨酸-酮戊二酸氨基转移酶 丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 过氧化物酶 H2O2邻甲氧基酚氧化酶 H2O2 邻甲氧基酚 H2O 四邻甲氧基酚 酶的种类及命名酶的种类及命名根据酶学委员会根据酶
9、学委员会1961年的第一个报告年的第一个报告, 所有的酶依据催所有的酶依据催化的反应分为化的反应分为6大类大类.根据分类根据分类, 每个酶都有一个编号每个酶都有一个编号(“E.C.”代表代表”酶学委员酶学委员会会, Enzyme Commission”)E.C. a. b. c. d酶的大类酶的大类酶的亚类酶的亚类酶的亚亚类酶的亚亚类酶的顺序号酶的顺序号第第1大类大类顺序号顺序号作用作用CHOH以以NAD+为受体为受体 举例举例: EC 1.1.1.1 乙醇脱氢酶醇脱氢酶 酶的种类及命名酶的种类及命名 国际酶学委员会国际酶学委员会(Enzyme Commission, EC)将所有的酶按将所有
10、的酶按它们所催化反应的性质分为六大类。它们所催化反应的性质分为六大类。酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心酶的活性中心: : 酶分子上能与底物特异地结合并酶分子上能与底物特异地结合并起催化作用的具有特定空间结构的区域起催化作用的具有特定空间结构的区域活性中心催化基团结合基团调控基团中心内必需基团中心外必需基团酶的活性中心酶的活性中心催化基团催化基团活性中心活性中心底物分子底物分子结合基团结合基团酶的活性中心酶的活性中心 结合基团结合基团(Binding group)酶分子中与底物结合，酶分子中与底物结合，使底物与酶的一定构象形使底物与酶的一定构象形成复合物的基团。成复合物的基团。酶的结合基团决
11、定酶反酶的结合基团决定酶反应的专一性应的专一性酶的活性中心酶的活性中心 催化基团催化基团(Catalytic group)酶分子中催化底物发生酶分子中催化底物发生化学反应并将其转变为产化学反应并将其转变为产物的基团。物的基团。催化基团决定酶所催化催化基团决定酶所催化反应的性质。反应的性质。酶的活性中心酶的活性中心 调控基团调控基团(Regulatory group)酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结合并引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或合并引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用的基团。抑制作用的基团。酶催化动画酶催化动画酶催化降低反应活
12、化能的机理酶催化降低反应活化能的机理酶催化降低反应活化能的机理动画酶催化降低反应活化能的机理动画酶催化降低反应活化能的机理酶催化降低反应活化能的机理 邻近效应邻近效应(proximity effect)与定向排列与定向排列(orientation arrange)： Proximity: 发生反应的两个分子与酶结合后处于邻发生反应的两个分子与酶结合后处于邻近接触状态，不需要经过随机碰撞而接近（相当于近接触状态，不需要经过随机碰撞而接近（相当于增加了局部反应物的浓度）；增加了局部反应物的浓度）； Orientation: 与酶结合后的反应物分子不仅互相靠与酶结合后的反应物分子不仅互相靠近，而且处
13、于发生反应的最优取向，不需要在碰撞近，而且处于发生反应的最优取向，不需要在碰撞中来调整反应分子间的取向中来调整反应分子间的取向 静电催化静电催化(Electrostatic catalysis) 底物与酶结合后活性中心通常没有水分子底物与酶结合后活性中心通常没有水分子(desolvation). 使活性中心局部介电常数变低，静电相互作用增强使活性中心局部介电常数变低，静电相互作用增强 使水分子不能与活性基团接触，保护活性基团，避免水与使水分子不能与活性基团接触，保护活性基团，避免水与活性基团反应产生副产物。活性基团反应产生副产物。 如果水是底物，酶有可以让水进入活性中心的方式，此时水分子如果水
14、是底物，酶有可以让水进入活性中心的方式，此时水分子可能存在于活性中的某个位置。可能存在于活性中的某个位置。 酶中的带电基团可以稳定反应中产生的带电荷的中酶中的带电基团可以稳定反应中产生的带电荷的中间产物，通常这些中间产物是不稳定的间产物，通常这些中间产物是不稳定的酶催化降低反应活化能的机理酶催化降低反应活化能的机理酶催化降低反应活化能的机理酶催化降低反应活化能的机理 使用结合能稳定过渡态，降低活化能使用结合能稳定过渡态，降低活化能 是酶催化过程中最重要的降低活化能的机理是酶催化过程中最重要的降低活化能的机理 酶和过渡态的结合比与底物或产物的结合紧密地多，酶和过渡态的结合比与底物或产物的结合紧密
15、地多，活化能降低，反应速率增大活化能降低，反应速率增大酶活力概念酶活力概念酶活力酶活力就是酶促反应的能力。酶活力大小就是指就是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。该酶活力低。 酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。它的催化能力进行定量。所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。定酶促反应的速度。如何测定
16、酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？如何测定酶活力？酶活力测定的要领酶活力测定的要领l底物浓度底物浓度: 在酶活性测定时，要求S达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。S范围一般选择在1020Km为宜，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差在可接受范围。l 酶浓度酶浓度: 在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有SE时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。l反应条件反应条件: 酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等，只有在最适条件下测定才能真实反映酶
17、活力大小。 l反应时间反应时间: 通常要求底物浓度足够大，测定底物浓度的变化在起始浓度的5以内的速率，这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能比较可靠地反映酶的含量。l辅助因子辅助因子：某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子，这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。 l激活剂激活剂：有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。l抑制剂抑制剂：抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。 3. 3. 生物催化的技术特点生物催化的技术特点生物催化的性能生物催化的性能生物催化的优点生物催
18、化的优点生物催化的缺点生物催化的缺点生物催化的用途生物催化的用途催化剂的性能指标催化剂的性能指标活活性性选选择择性性稳稳定定性性生物催化剂生物催化剂 活性活性总酶活总酶活: 国际酶活单位(IU)或酶活单位(U) 1 Unit 1 IU 1 U 1 molmin-1比活比活: 单位质量催化剂的活力,评价催化剂性能的基本指标 1Umg蛋白质-1 = 1mol(minmg蛋白质)-1 *一个好的生物催化剂, 比活至少为1U mg蛋白质-1 , 当用于工业规模时, 它的比活必须更高, 甚至接近100 U mg蛋白质-1 活性活性体积活力体积活力: 单位体积催化剂的活力 1 Uml-1 = 1mol(m
19、inml)-1转换频率转换频率: 每秒每个活性位点能发生的催化事件, 比比活更好,与酶量无关, 对于遵循米氏方程的酶反应, tof = 1/kcat 转化频率(tof) =催化事件的数目时间活性为点的数目Tof = turnover frequency选择性选择性目标产物分子光学纯的重要性以及生物催化剂对实现这一目标的目标产物分子光学纯的重要性以及生物催化剂对实现这一目标的独特优越性独特优越性, 对映选择性是生物催化剂选择性研究中最重要的一种对映选择性是生物催化剂选择性研究中最重要的一种对映选择率对映选择率(E值值): 能衡量在一定转化程度下的对映选择性能衡量在一定转化程度下的对映选择性 00
20、MM/ln/ln)/)/(BBAAkkkkEBcatAcatChen C.S. JACS, 1982, 104, 7294-7299对映体过量值对映体过量值(e.e.): 产物分离后整体选择性的大小产物分离后整体选择性的大小%100)BA()BA(.ee稳定性稳定性酶的稳定性：酶的稳定性：通常指温度稳定性,用变性温度Tm表征，在特定温度、pH和添加剂条件下的储藏稳定性可用以及衰减模型表示：)exp(EE0tkdt操作稳定性操作稳定性/工艺稳定性：工艺稳定性：可用酶消耗数酶消耗数(enzyme consumption number, e.c.n)，即用生产一定量的产物所需的酶量表示：产物的千克数
21、酶的克数生成的产物量消耗的酶量. nce当生物催化剂的纯度已知时，可用整体转换数整体转换数(total turnover number, TTN), 即有生成的产物量和消耗的生物催化剂量表示：*对于合成工艺TTN应超过10000，对于大规模的加工工艺，TTN最好大于1000000)mol()mol(TTN催化剂消耗的量产物生成的量生物催化的优点生物催化的优点 无可比拟的选择性无可比拟的选择性l 当酶用于增强反应的化学选择性或区域选择性时，酶的最大优势就是能辨别对映异构的底物。R型和S型异构体之间的Gibbs自由焓差异GRS只有13 kJ/mol。在酶的作用下，对映选择性通常可以高于99% e.
22、e.。l 在高级医药中间体合成中，酶的高对映选择性显得越发重要, 因为管理机构要求对杂质含量超过1%的不纯物质分别进行毒性实验。反应条件很温和反应条件很温和酶的作用条件很温和，它能在常温、中性pH和水相中起作用，今天这些已被认为是优点，而不再是缺点。工业发展的目标，例如“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”，对世界大部分地区的工业提出了新的要求。若无耐受这种条件的生物催化剂，这一目标很难实现。酶催化的反应日益增多酶催化的反应日益增多l生物催化剂能作用的反应日益增多。这反映在工业规模级生物催化剂应用不断增加上。而且，生物催化剂越来越多地与化学催化剂相结合，或在细胞中的反应网络中得到应用。
23、生物催化的缺点生物催化的缺点在必需的反应介质中，生物催化剂不够稳定 可通过蛋白质工程和酶工程手段提高稳定性欲将可得的底物转化成目标产物时，能适合所需反应的生物催化剂不多，随着生命科学的发展，目前生物催化剂的数量已有明显增长开发新型和改良生物催化剂的周期太长，随着对生物工程和生物催化研究的深入，这一周期必将缩短生物催化在工业上的应用生物催化在工业上的应用, , 掀起生物技术的第三次浪潮！掀起生物技术的第三次浪潮！微生物学微生物学分子生物学分子生物学酶学酶学生物化学生物化学有机化学有机化学过程化学过程化学动力学动力学反应工程反应工程反应器设计反应器设计化学品造纸和纸浆植物保护动物饲料食品,营养药
24、物工业生物技术工业生物技术生物催化生物催化医用诊断分析采矿生物产业被列为国家七大战略性新兴产业之一生物产业被列为国家七大战略性新兴产业之一4.4. 生物催化的由来和发展生物催化的由来和发展生物催化发展简史生物催化发展简史生物催化应用现状生物催化应用现状生物催化主要障碍生物催化主要障碍 生物催化发展机遇生物催化发展机遇生物酶催化反应的发展历史生物酶催化反应的发展历史1906年，瓦尔堡（Warburg）采用肝脏提取物水解消旋体亮氨酸丙酯制备L-亮氨酸。1926年，萨姆纳（Sumner）从刀豆中分离纯化得到脲酶晶体。1952年，彼得逊（Peterson）发现黑根酶能使孕酮转化为-羟基孕酮，产物产率高
25、，光学纯度好，从而解决了，甾体类药物合成中的重大难题。1867年，库内（Kuhne）提出酶（enzyme），用以表述催化活性。1897年，布赫奈纳（Buchner）等发现酵母的活细胞提取也具有发酵作用，可以使葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，为近代酶学研究奠定了基础。1916年，纳尔逊（Nelson）和格里芬（Griffin）发现蔗糖酶结合在骨炭粉末上仍有酶活性。巴斯德（Pasteur）是手性化合物研究的先驱者，1848年，他从外消旋酒石酸钠铵盐晶体的混合物中分离出（+）和（-）酒石酸钠铵盐两种晶体。1894年，菲舍尔（Fischer）提出了“锁钥学说”，用来解释酶作用的立体专一性。1908年，罗森
26、贝格（Rosenberg）用杏仁（D-醇氰酶）作催化剂合成具有光学活性的氰醇。这些创造性的工作促进了生物酶催化不对称合成的研究与发展。1936年，西姆（Sym）发现胰脂肪酶在有机溶剂苯存在下仍能改进酶催化的酯合成。1960年，诺华（NOVO）公司通过对地衣形芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）深层培养发酵大规模制备了蛋白酶，从此开始了酶的商业化生产。1984年，Klibanov所开创的非水介质中酶反应的研究，极大地推动了酶在有机合成中的应用。20世纪 80年代初，Cech和Altman分别发现了具有催化功能的 RNA（Ribozyme）从而打破了酶全部都是蛋白质的传统观念,
27、开辟了酶学研究的新领域。经过近半个世纪的研究，生物催化的不对称合成已经成功地用于光学活性氨基酸、有机经过近半个世纪的研究，生物催化的不对称合成已经成功地用于光学活性氨基酸、有机酸、多肽、甾体转化、抗生素修饰和手性原料等的制备，成为一种标准的有机合成方法酸、多肽、甾体转化、抗生素修饰和手性原料等的制备，成为一种标准的有机合成方法。生物催化应用现状生物催化应用现状2002年年, Staathof的报告涵盖的报告涵盖134种工业级生物转化，其规模在种工业级生物转化，其规模在100kg以上以上 (Curr. Opon. Biotechnol., 2002, 13, 548-556)手性药物迫切要求促进
28、了生物催化的发展手性药物迫切要求促进了生物催化的发展 20世纪90年代，手性药物的研发已成为世界新药发展的战略方向与热点领域 不对称催化反应研究的成功为手性药物工业注入了强大的活力，2001年的诺贝尔化学奖就授予了三位从事不对称催化反应的科学家 生物酶催化是获取光学纯手性药物的关键技术Ryoji Noyori “We chemists are proud of our ability to create high values from almost nothing on the basis of accumulated scientific knowledge” Ryoji Noyori 0
29、2004006008001000120014001600199319951997199920012003全球销售额 (亿美元)单一对映体药物全球销售持续快速增长单一对映体药物全球销售持续快速增长 生物催化对手性产业的贡献率生物催化对手性产业的贡献率年份传统技术(手性源和分离)化学催化生物催化生物催化200255%35%10%200549%36%15%200941%36%22%(Chemical & Engineering News, 2006)美国的目标是：到2020年，要通过生物催化技术，降低化学加工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗各30%，减少污染物的排放和污染扩散30%。日本政府也从2
30、001年起，制定实施了“创造基于生物机能的循环产业体系”的计划，开发用于化学物质生产的细胞体系。生物催化主要障碍生物催化主要障碍过去过去20年中，对生物催化剂的疑问不绝于耳年中，对生物催化剂的疑问不绝于耳：酶的底物专一性太强；酶的底物专一性太强；可用的酶太少；可用的酶太少；存在的酶的数量太少；存在的酶的数量太少；生物催化剂的稳定性受限制；生物催化剂的稳定性受限制；酶反应的时空收率低；酶反应的时空收率低；酶需要复杂的辅底物，如辅因子。酶需要复杂的辅底物，如辅因子。生物催化发展机遇生物催化发展机遇 生物催化的最新技术进展生物催化的最新技术进展 新生物催化剂的发现与改造新生物催化剂的发现与改造 高通
31、量筛选和平行实验技术使得寻找一种能完成特定反应高通量筛选和平行实验技术使得寻找一种能完成特定反应的生物催化剂变得更加容易的生物催化剂变得更加容易定向进化与基因重组技术在新生物催化剂的筛选中担当了定向进化与基因重组技术在新生物催化剂的筛选中担当了重要的角色重要的角色生物催化反应工程生物催化反应工程 主底物主底物辅底物辅底物酶催化剂酶催化剂反应介质反应介质主产品主产品副产物副产物生物催化反应体系生物催化反应体系选择率选择率生产率生产率底 物 工 程底 物 工 程 催 化 剂 工 程催 化 剂 工 程介 质 工 程介 质 工 程生物催化与化学催化的结合生物催化与化学催化的结合 Dowpharma公司
32、生物催化负责人Karen Holt-Tiffin说：“由于顾客通常只要求我们提供一种特定的中间体，而并不关心我们是如何得到它的，因此，我们能够客观地确定一种特定分子的最佳合成路线是采用单一技术还是采用多种技术的结合”。 她指出：按照这些路线，关于生物催化的许多困惑，例如生产率有限、高成本、酶不稳定以及无法获得等, 在大多数的情况下都将不复存在。最大的障碍仍旧是怎样改变有机化学家的思维模式，以使他们在使用酶的时候不再顾虑重重，而在实际工作中将酶催化作为一种可供选择的方法进行尝试。生物催化产业孵化中心生物催化产业孵化中心 英国在曼彻斯特大学成立了生物催化、生物转化和生物催化制造的先进中心(简称CoEBio3)，并在约克郡和苏格兰设立分部。此中心已经吸引很多企业的注意，如AstraZeneca, BASF, Dowpharma, Excelsyn, GlaxoSmithKline, Lonza等大公司，以及小型酶技术经营者如 Ingenza, Novacta Biosystems, 和附属于 Codexis的Jlich Chiral Solutions。 中心与工业生产密切联系，我们可以从基因做到千克级产品，或者从基础研究做到实际生产。
