1、 中国药典中国药典2005版微生物限度版微生物限度 检查法检查法 中国药典中国药典2005版微生物限度检查法在检版微生物限度检查法在检查项目、格式、语言表述等方面都有较多的查项目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。增定和修订。 增订中主要的有四项：一是三菌数测定的增订中主要的有四项：一是三菌数测定的方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。前言前言 微生物限度检查微生物限度检查在环境的洁净度在环境的洁净度10000级级和和局部局部100级的单向流空气区域内进行，其全过级的单向流空气区域
2、内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家家医药工业洁净室医药工业洁净室(区区)悬浮粒子、浮游菌悬浮粒子、浮游菌和和沉降菌测试方法沉降菌测试方法现行标准进行洁净度验证。现行标准进行洁净度验证。隔离系统隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。境的洁净度须符合无菌检查的要求。 培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录法（见附录 XVII ）的要求采用）的要求采用验证
3、合格的灭菌程验证合格的灭菌程序灭菌。序灭菌。 培养温度培养温度 细菌和控制菌的培养温度未改动。霉细菌和控制菌的培养温度未改动。霉菌和酵母菌的培养温度菌和酵母菌的培养温度2025 改为改为 2328。灭菌和培养温度灭菌和培养温度 一般随机抽样不少于检验用量（一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）个以上最小包装）的的3倍量倍量。检验量检验量 指供试品一次检验的用量。一般为指供试品一次检验的用量。一般为10g或或10ml；化学药膜剂为；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品）。检查沙门菌的供试品其检验量增
4、加其检验量增加10g或或10ml。检验量检验量供试液的制备供试液的制备 用用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。供试液制备妥后不得超过用。供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养就加入检验用培养基。基。 非水溶性供试品非水溶性供试品 供试品供试品5g，司盘，司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯梨酯80供试品供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯无菌十四烷酸异丙酯和无和无菌
5、玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加分振摇，使供试品溶解。然后加45100ml pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃分钟，萃取，待油水分层后，水层过滤，贴膜培养。取，待油水分层后，水层过滤，贴膜培养。7类供试品供试液的制备，其中增订：类供试品供试液的制备，其中增订：非水溶性膜剂供试品非水溶性膜剂供试品 化学药膜剂化学药膜剂取取100cm2，剪碎，剪碎，加加100ml pH7.0氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取作供试液。一部中药
6、膜剂取50 cm2，剪碎，适量的，剪碎，适量的pH7.0氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（蛋白胨缓冲溶液（50或或100ml）浸泡，）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP 2000版规定版规定:中药膜剂取中药膜剂取3050cm2 ，剪碎，加水，剪碎，加水100ml）。）。肠溶及结肠溶制剂肠溶及结肠溶制剂 供试品供试品10g，加，加100ml pH6.8无无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）缓冲液（结肠制剂）,于于45水浴振摇水浴振摇，使溶解，使溶解。 气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品
7、取规定量供试品，置冷冻室取规定量供试品，置冷冻室冷冻冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温并轻轻转动容器，使无菌钢锥钻一小孔，放置室温并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯量无菌聚山梨酯-80液），使均匀，取相当于液），使均匀，取相当于10g或或10ml的供试品，再稀释成的供试品，再稀释成1 10的供试液。的供试液。 具抑菌活性的供试品具抑菌活性的供试品
8、当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有：活性消除后，方能依法检查。常用的方法有： 培养基稀释法培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级同稀释级2ml供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操作，培养、计数。每作，培养、计数。每1ml供试液所注各平皿生长的菌供试液所注各平皿生长
9、的菌数之和即为数之和即为1ml的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍数的值按菌数报告规则报告菌数。数的值按菌数报告规则报告菌数。 控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 离心沉淀集菌法离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，取规定量的供试液，3000转转/分离心分离心20min（供（供试液如有沉淀，先以试液如有沉淀，先以500转转/分离心分离心5min，取全部上，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。加稀释剂至原规定量。 薄膜过滤法薄膜过滤法 采用开放式薄膜过
10、滤器。采用开放式薄膜过滤器。 中和法中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。中。 对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检 测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的 验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。 若供试品的组分或原检验条件发生改变可
11、能影响检若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检 验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试 液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法 及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行 验证。验证。 细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数 增订增订 计数方法的验证计数方法的验证 菌株菌株 大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄、金黄色葡萄球菌球菌CMCC（B）26003、 枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌
12、白色念株菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉黑曲霉菌菌CMCC(F)98003 。 菌液制备菌液制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成无菌氯化钠溶液稀释成1ml含含50100cfu的菌液。的菌液。 验证用菌株及菌液的制备验证用菌株及菌液的制备 试验组试验组 取规定量最低稀释级的供试液规定量最低稀释级的供试液1ml，和，
13、和50100cfu试验菌，每试验菌，每株菌做株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。，过滤，培养，计数。 菌液组菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。测定加入的试验菌液的菌数。 供试品对照组供试品对照组 取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。的菌数。 稀释剂对照组稀释剂对照组 取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml 供试液含供试液含501
14、00cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 验证试验应独立平行进行验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。次，分别计算各次试验菌的回收率。 验证方法验证方法 试验组的菌回收率试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数（试验组平均菌落数供试品供试品对照组平均菌落数）对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数菌液组平均菌落数 100% 稀释剂对照组的菌回收率稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平（稀释剂对照组的平均菌落数均菌落数/菌液组的平均菌落数）菌液组的平均菌落数）100% 结果判断结果判断 在三次平行试验中，稀释
15、剂对照组的菌在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。 验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵
16、母菌计数验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。同时进行。2.检查法检查法 （1）平皿法）平皿法 增订增订 阴性对照试验阴性对照试验 取试验用的稀释剂取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，凝，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得长菌。个平板，均不得长菌。 修订修订 细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般48h，真菌，真菌72h；必要时，可适当延长培养时间必要时，可适当延长培养时间5-7d。（细（细菌培养时间菌培养时间USP48-72h，Ep5d；真菌培养时间；真菌培
17、养时间USP 5-7d，EP5d。平皿法；平皿法和涂抹法）。平皿法；平皿法和涂抹法） 在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。中的菌数为计数结果报告。l细菌数细菌数30300，霉菌数，霉菌数30100。l当仅有当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值
18、报告菌数。菌数报告规则当同时有当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于值报告菌数；若比值大于2但不超过但不超过5时，以低稀释时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于大于5，或高稀释级的菌落数
19、大于或等于低稀释级的，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。应进行方法的重新验证。l当各稀释级的平均菌落数均小于当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。l各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。（2
20、）薄膜过滤法）薄膜过滤法 。l 取相当于取相当于1g或或1ml供试品的供试液，加至供试品的供试液，加至100ml稀稀释剂中，混匀，过滤。用释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同冲洗量同“方法的验证方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。培养基至少制备一张滤膜。
21、 阴性对照试验阴性对照试验 取试验用的稀释剂取试验用的稀释剂2ml同法操作，作为阴性对照。阴性对同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。目的：检验稀释剂或冲洗液、吸管、滤器、照不得有菌生长。目的：检验稀释剂或冲洗液、吸管、滤器、培养基、环境和操作技术是否符合无菌性要求。培养基、环境和操作技术是否符合无菌性要求。 培养和计数培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于多于100个。个。 菌数报告规则菌数报告规则 以相当于以相当于1g或或1ml供试品的菌落数报告菌数；若最低稀释供试品的菌落数报告菌数；若最低稀释级的滤膜上
22、无菌落生长，以级的滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（报告菌数（1g或或1ml供试品供试品/滤膜），或滤膜），或1乘以稀释倍数的值报告菌数。乘以稀释倍数的值报告菌数。 控制菌检查控制菌检查 1.方法的验证方法的验证 对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，检查法应重新验证。检查法应重新验证。 验证时按各品种项下
23、微生物限度规定控制菌选验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 菌株菌株 大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC（B）44102 、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 、乙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌CMCC（B） 50094、铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌CMCC（B） 10104、生孢梭、生孢梭菌菌CMCC（B） 64941。 菌液制备
24、菌液制备 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养1824h，取培，取培养物养物1ml用用0.9%无菌氯化钠溶液稀释无菌氯化钠溶液稀释至至1ml含含10100cfu。 验证方法验证方法试验组：取规定量供试液及试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，基中，依相应控制菌检查法进行检查。
25、当采用薄膜过滤法时，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠
26、埃希菌。阴性对照菌不得检出。性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 结果判定结果判定 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行
27、。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 2.检查法检查法 供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检查，增菌培养基的实际用量同查，增菌培养基的实际用量同“方法的验证方法的验证”。 阳性对照试验阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为阳性对照试验的加菌量为10100cfu，方法同供试，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。菌。 阴性对照试验阴性对照试验 取稀释剂取稀释剂10 ml加入加入100 ml（或（或2
28、00 ml）相应控）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。 控制菌检查的步骤：控制菌检查的步骤： 取供试液接种增菌培养基，增菌、分离培养，革取供试液接种增菌培养基，增菌、分离培养，革兰染色、生化试验等基本未变动，仅一些控制菌保兰染色、生化试验等基本未变动，仅一些控制菌保留了前几项主要生化鉴别试验，删去了一些生化鉴留了前几项主要生化鉴别试验，删去了一些生化鉴别方法，这样的删节、简写，主要是节省篇幅。并别方法，这样的删节、简写，主要是节省篇幅。并不是删去，可以不做。如有可疑菌落，应进行分离、不是删去，可以不做。如有可疑菌落，应进行分离、纯化、
29、革兰染色镜检和适宜的生化试验，确认是否纯化、革兰染色镜检和适宜的生化试验，确认是否是要检查的控制菌。是要检查的控制菌。 大肠埃希菌大肠埃希菌 取供试液取供试液10ml直接或处理后接种至直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培的胆盐乳糖培养基中，培养养基中，培养1824小时，必要时可延至小时，必要时可延至48小时。取上述小时。取上述培养物培养物0.2ml，接种至含，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，培养基的试管内，培养，于于5、24小时在小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为培养基作本底对照。若管内培养物
30、呈现荧光，为MUG阳性；阳性；不呈现荧光，为不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴阴性和靛基质阴性。性。 l如如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基
31、质阳性，则应取阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。（
32、和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。（ChP、BP、USP）大肠菌群菌落形态特征大肠菌群菌落形态特征l菌落疑似者再进行确证试验l菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。麦康凯琼脂呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。大肠埃希菌在大肠埃希菌在EMB、MAC上的特征上的特征 生化试验生化试验 沙门菌沙门菌 修订修订 取供试品取供试品10g或或10ml加至加至200ml的营养肉汤的营养肉汤培养培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验
33、组。取基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验组。取10ml稀释液加稀释液加至至200ml营养肉汤培养基中营养肉汤培养基中，为阴性，为阴性对照组。培养对照组。培养1824h，阴性对照应无菌生长。，阴性对照应无菌生长。l 取上述培养物取上述培养物1ml，接种四硫磺酸钠亮绿培养基，接种四硫磺酸钠亮绿培养基，培 养 后 ， 划 线 分 离 胆 盐 硫 乳 琼 脂 （ 或培 养 后 ， 划 线 分 离 胆 盐 硫 乳 琼 脂 （ 或 SS） 或） 或MacC(或或EMB)培养基平板，培养培养基平板，培养1824h（必要时（必要时延长至延长至4048h）。若平板上无菌落生长，或生长的）。若平板上无菌落生
34、长，或生长的菌落不同于表中所列的特征，判供试品未检出沙门菌。菌落不同于表中所列的特征，判供试品未检出沙门菌。l若平板上生长的菌落特征与表中所列的菌落形态特若平板上生长的菌落特征与表中所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选征相符或疑似，用接种针挑选23个菌落分别于三个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种培养种培养1824小时，如斜面未见红色、底层未见黄小时，如斜面未见红色、底层未见黄色或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门色或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行菌否则，应取三
35、糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。（菌。（ChP、BP、USP）增菌培养增菌培养l预增菌 取营养肉汤培养基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供试液各10ml，其中1瓶加入对照菌液0.1ml(含菌量为50100个cfu/ml)作阳性对照，第3瓶加入稀释剂10ml作阴性对照，培养1824h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效l增菌培养 轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1ml各接种于1管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824h。阳性对照管应呈现混浊分离培养分离培养l轻微
36、摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取12环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养2448h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表平板沙门菌属亚属沙门菌亚属胆盐硫乳琼脂(DHL)无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属同沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等
37、大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属同麦康凯琼脂(MacC)同曙红亚甲蓝琼脂平板发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属同菌落特征补充菌落特征补充l由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显l在SS琼脂平板上，H2S特征有
38、时不明显，沙门菌属亚属因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心l在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别l阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查l由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别菌落与结果报告菌落与结果报告l如阳性对照平板有典型菌落生长，供试品平板均未生长或无疑似菌落生长，则报告1g或1ml供试品未检出沙门菌菌落传纯菌落
39、传纯l从每个供试品的分离平板上挑取23个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养242h，观察结果三糖铁琼脂反应三糖铁琼脂反应l疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；斜面红色，底层黄色；斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。l多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气
40、体的菌种。l对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。脲酶试验脲酶试验 l用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养4及24h，观察结果。红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应，与变形杆菌相区别 赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验 l用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养2448h观察结果。对照管黄色(产酸)，试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应 动力试验动力试验 l用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细
41、菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留23天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动 靛基质试验靛基质试验 l用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应 血清学凝集试验血清学凝集试验 凝集反应的观察凝集反应的观察l将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿
42、内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果 凝集试验的结果判定凝集试验的结果判定l如试验及对照试验均出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验l当培养物与0多价1血清未出现凝集现象时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量0.9%无菌氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此处理后的菌悬液与沙门菌0多价1血清按上法作凝集试验。如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基增菌，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼胆盐乳糖培养基增菌，划线接种于溴化
43、十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养脂培养基的平板上，培养1824h。特征性菌落，纯培养，。特征性菌落，纯培养，革兰染色，镜检及氧化酶试验，绿脓菌素试验。革兰染色，镜检及氧化酶试验，绿脓菌素试验。 若疑似菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，判供试品未若疑似菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试。检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试。 若氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜若氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。绿假单胞菌。 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验
44、阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。假单胞菌。 l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基培养取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基培养1824h，必，必要时可延至要时可延至48h的培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养的培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养2472h。若。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供所
45、列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。试品未检出金黄色葡萄球菌。 若平板上生长的菌落与表若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，所列的菌落特征相符或疑似，应挑选应挑选23个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养养1824 h。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养接种于营养肉汤培养基中，培养1824h，作血浆凝固酶试，作血浆凝固酶试验。验。l增订增订 大肠菌群和梭菌检查法。大肠菌群和梭菌检查法。l大肠菌群（大肠菌群（Coliform 或或Coliform bacter
46、ia） 作为水质粪便污染的指示菌已有作为水质粪便污染的指示菌已有80多年的历史。大肠菌多年的历史。大肠菌群是指在群是指在37生长时能发酵乳糖，生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。大肠菌群基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰大肠菌群基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长
47、。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量 大肠埃希菌属大肠埃希菌属枸橼酸菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属克雷伯菌属肠杆菌属肠杆菌属 I+ - + -+- +- -+M+ + +- - -V-P- - -+ + +C- - -+ +- +H2S- - - - -乳糖乳糖（
48、44）+ - +- - - +-大肠菌群分类大肠菌群分类 1. 肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的4类细菌，只有大肠埃希菌类细菌，只有大肠埃希菌才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。得确认是否是大肠埃希菌。直接检查直接检查 E.coli，一步到位。，一步到位。64年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。2. 检查大肠菌
49、群检查大肠菌群 乳糖发酵的乳糖发酵的4类菌，其卫生学类菌，其卫生学 意义是相同的，意义是相同的，都是来自人和动物的粪便污染，检查大肠菌群即可。都是来自人和动物的粪便污染，检查大肠菌群即可。WHO 50年来一贯的方法，在大多数国家推行。为了与国际接轨，年来一贯的方法，在大多数国家推行。为了与国际接轨，我国我国74年开始采用国际通用的大肠菌群检查法。年开始采用国际通用的大肠菌群检查法。3. 只要是发酵型的细菌，便可认为是大肠菌群。采用葡萄糖发只要是发酵型的细菌，便可认为是大肠菌群。采用葡萄糖发 酵试验检测，包括了肠杆菌科所有的细菌。前苏联酵试验检测，包括了肠杆菌科所有的细菌。前苏联20世纪世纪50
50、年代引入我国，一直沿用到年代引入我国，一直沿用到20世纪世纪60年代初期。年代初期。l大肠菌群检查方法大肠菌群检查方法 1.食品卫生国标方法食品卫生国标方法 初发酵初发酵，3管或管或5管胆盐乳糖培管胆盐乳糖培养基，产酸产气；养基，产酸产气；EMB分离培养，分离培养， 挑选多个可疑菌落，挑选多个可疑菌落，复发酵复发酵确证，报告确证，报告MPN。 2.WHO 假定试验，假定试验，MacC肉汤或乳糖胰胨肉汤，产肉汤或乳糖胰胨肉汤，产气，假定阳性；不产气，再培养气，假定阳性；不产气，再培养24h，产气，假定，产气，假定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。阳性假定阴性；不产气，假定阴性。 证实试验证实试验
