1、中枢神经系统疾病的基因治疗中枢神经系统疾病的基因治疗 石奕武石奕武神经科学研究所神经科学研究所广州医学院第二附属医院广州医学院第二附属医院 概概 述述定义定义早期早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前目前广义上来讲是指将某种遗传物质转广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。达到治疗疾病目的的方法。 基因治疗的概念基因治疗的概念 基本程序基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载
2、体的选择回输回输体内体内重组表达载体重组表达载体靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移筛选筛选能有效、适度表能有效、适度表达目的基因的靶细胞达目的基因的靶细胞重组表达载体重组表达载体导入导入靶细胞靶细胞 应用与展望应用与展望1 1）单基因缺陷病）单基因缺陷病2 2）体细胞的基因治疗）体细胞的基因治疗3 3）靶细胞可以从病人机体获取）靶细胞可以从病人机体获取4 4）治疗效果胜过危害）治疗效果胜过危害5 5）表达水平无需严格调控）表达水平无需严格调控6 6）动物实验证明符合严格的安全标准）动物实验证明符合严格的安全标准研究概况研究概况19901990年，年，美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞
3、基因治疗的方案，美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（即将腺苷脱氨酶（ADAADA）导入一个）导入一个4 4岁患有严重复合免疫缺陷综合征岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCIDSCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素（ILIL2 2）刺激其增殖，经）刺激其增殖，经1010天左右再经静脉输入患儿。大约天左右再经静脉输入患儿。大约1 12 2月月治疗一次，治疗一次，8
4、 8个月后，患儿体内个月后，患儿体内ADAADA水平达到正常值的水平达到正常值的2525，未见明显副，未见明显副作用。此后又进行第作用。此后又进行第2 2例治疗获得类似的效果。例治疗获得类似的效果。致使世界各国都掀起了致使世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。基因治疗的研究热潮。经过十几年的发展，基因治疗已取得初步的临床疗效，例如经过十几年的发展，基因治疗已取得初步的临床疗效，例如20002000年年法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使1111名有免疫缺陷的婴儿恢名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能复了正常的免疫功能, ,尽管后来有一名儿童患了白血病尽管后来
5、有一名儿童患了白血病, ,但这仍是近但这仍是近十年来基因治疗取得的最大成功。目前每年用于基因治疗上的总投资十年来基因治疗取得的最大成功。目前每年用于基因治疗上的总投资在在1010亿美元左右，主要集中在美国，其次是欧洲。到亿美元左右，主要集中在美国，其次是欧洲。到20012001年底全世界年底全世界已批准了已批准了600600个基因治疗临床试验方案，其中针对癌症治疗的方案居首个基因治疗临床试验方案，其中针对癌症治疗的方案居首位，有位，有378378个方案，占总数的个方案，占总数的63.1%63.1%；其次是针对单基因疾病、心血管；其次是针对单基因疾病、心血管病、传染性疾病（主要是病、传染性疾病（
6、主要是HIVHIV）、基因标记和其他疾病治疗方案。）、基因标记和其他疾病治疗方案。神经系统疾病的防治神经系统疾病的防治-人们面临的巨大挑战人们面临的巨大挑战大多数炎症、营养缺乏性疾病及良性肿瘤等，大多数炎症、营养缺乏性疾病及良性肿瘤等，通过传统的药物、手术和饮食疗法可以治愈通过传统的药物、手术和饮食疗法可以治愈相当多的疾患不能治愈相当多的疾患不能治愈-帕金森病、亨廷顿病帕金森病、亨廷顿病等等有一些疾病至今仍无防治方法，如阿尔茨海默有一些疾病至今仍无防治方法，如阿尔茨海默病及恶性肿瘤等病及恶性肿瘤等全新的治疗概念全新的治疗概念中枢神经系统中枢神经系统(CNS)(CNS)的基因的基因治疗治疗(ge
7、ne therapy)(gene therapy)一、中枢神经系统基因治疗概述一、中枢神经系统基因治疗概述存在着一定的困难存在着一定的困难: :CNSCNS被严密的骨质系统所包裹被严密的骨质系统所包裹, ,使得一些重要的使得一些重要的物理操作相对难以进行；物理操作相对难以进行；完整的血脑屏障完整的血脑屏障(BBB)(BBB)的存在是向脑内导入基的存在是向脑内导入基因转移载体的天然屏障；因转移载体的天然屏障；神经系统功能的分子机制及其疾病的分子遗传学变神经系统功能的分子机制及其疾病的分子遗传学变化最近才缓慢地得到了初步的认识化最近才缓慢地得到了初步的认识, ,因此因此, ,能够通过基能够通过基因
8、修饰而得到治疗的神经系统疾病较少因修饰而得到治疗的神经系统疾病较少; ;对于某些对于某些CNSCNS代谢性疾病代谢性疾病( (如溶酶体蓄积病如溶酶体蓄积病),),在出生在出生之前就已经在细胞内有大量毒性物质的堆积之前就已经在细胞内有大量毒性物质的堆积, ,提示必提示必需在胚胎期就进行治疗才有可能取得满意的疗效需在胚胎期就进行治疗才有可能取得满意的疗效; ; 神经系统由多种功能不同并且高度分化的细胞组神经系统由多种功能不同并且高度分化的细胞组成成, ,细胞之间存在着不同的、复杂的甚至是变化着的细胞之间存在着不同的、复杂的甚至是变化着的联系联系, ,不同的神经元和胶质细胞之间在结构上和功能不同的神
9、经元和胶质细胞之间在结构上和功能上可能存在着相当大的差异上可能存在着相当大的差异, ,因此因此, ,神经系统远比其神经系统远比其它器官都要复杂它器官都要复杂; ;神经细胞或胶质细胞均很难大量分离以用于原神经细胞或胶质细胞均很难大量分离以用于原代培养和遗传修饰。对成熟神经元和代培养和遗传修饰。对成熟神经元和/ /或胶质细或胶质细胞进行遗传修饰并有效地进行脑内移植的技术方胞进行遗传修饰并有效地进行脑内移植的技术方法还未完全成熟。法还未完全成熟。随着近年来基因治疗的技术方法上的进展随着近年来基因治疗的技术方法上的进展, , 初步初步结果显示基因治疗在结果显示基因治疗在CNSCNS疾病的治疗中也具有广
10、疾病的治疗中也具有广阔的应用前景。其原因在于阔的应用前景。其原因在于: :随着定位克隆和疾病相关基因的分离和鉴定技随着定位克隆和疾病相关基因的分离和鉴定技术的发展术的发展, ,越来越多的神经系统疾病的遗传学病越来越多的神经系统疾病的遗传学病因得到了澄清因得到了澄清; ; 随着对疾病发生发展的分子机制了解的随着对疾病发生发展的分子机制了解的深入深入, ,目前已经确认的基因治疗方法不仅适目前已经确认的基因治疗方法不仅适用于有明确基因改变的遗传性疾病用于有明确基因改变的遗传性疾病, ,而且也而且也适用于非遗传性疾病的治疗适用于非遗传性疾病的治疗; ; 可以使用非神经细胞或非胶质细胞可以使用非神经细胞
11、或非胶质细胞( (如自如自体成纤维细胞或成肌细胞体成纤维细胞或成肌细胞) )作为遗传修饰细作为遗传修饰细胞胞; ; 最近发现有些药物可造成最近发现有些药物可造成BBBBBB的一过的一过性渗透性损伤性渗透性损伤, ,从而使大分子物质甚至基因从而使大分子物质甚至基因转移载体进入脑内转移载体进入脑内; ; 已成功地构建了一些新型的、能够感染非已成功地构建了一些新型的、能够感染非分裂期终分化细胞分裂期终分化细胞( (如神经元如神经元) )的病毒基因转的病毒基因转移载体移载体( (如复制缺陷型重组腺病毒、疱疹病毒如复制缺陷型重组腺病毒、疱疹病毒及腺病毒相关病毒等及腺病毒相关病毒等),),从而使向成熟神经
12、元从而使向成熟神经元和和/ /或胶质细胞内直接进行基因转移成为可或胶质细胞内直接进行基因转移成为可能。能。（一）中枢神经系统基因治疗的分类（一）中枢神经系统基因治疗的分类根据靶细胞分类根据靶细胞分类生殖细胞生殖细胞(germ cell)(germ cell)基因治疗基因治疗: :将受精卵或早期将受精卵或早期胚胎细胞做为治疗目标进行生殖细胞的基因治疗胚胎细胞做为治疗目标进行生殖细胞的基因治疗是可行的；受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势是可行的；受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势必影响后代，伦理学障碍和技术上的困难使生殖必影响后代，伦理学障碍和技术上的困难使生殖细胞基因治疗目前仍为禁区。细胞基因治疗目
13、前仍为禁区。体细胞体细胞(somatic cell)(somatic cell)基因治疗：体细胞基因治疗基因治疗：体细胞基因治疗只涉及体细胞的遗传转变，不影响下一代，现已被只涉及体细胞的遗传转变，不影响下一代，现已被广泛接受做为广泛接受做为CNSCNS严重疾病的治疗方法之一，在现代严重疾病的治疗方法之一，在现代伦理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取伦理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。得了可喜的成果。 根据基因转移的途径根据基因转移的途径in vivo (in vivo (活体直接转移，或称一步法活体直接转移，或称一步法) )：指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露
14、的指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNADNA直直接导入接导入CNSCNS内；操作简便、容易推广。内；操作简便、容易推广。尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题基因转移研究的方向，只有基因转移研究的方向，只有in vivoin vivo基因转移方法成基因转移方法成熟了，基因治疗才能真正走向临床。熟了，基因治疗才能真正走向临床。指外源基因克隆至一个合适的载体，首先导入体外指外源基因克隆至一个合适的载体，首先导入体外培养的自体或异体培养的自体或异体( (有特定条件有特定条件) )的细胞，经筛选后的细胞，经筛选后将能表达外源基因的受体细胞重新
15、输回受试者将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者CNSCNS内内, , 实质上就是遗传修饰细胞的脑移植。实质上就是遗传修饰细胞的脑移植。经典、安全、而且效果较易控制，但是步骤多、技经典、安全、而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大、不容易推广。术复杂、难度大、不容易推广。ex vivo(离体转移或称二步法离体转移或称二步法)（二）中枢神经系统基因治疗的策略（二）中枢神经系统基因治疗的策略根据宿主根据宿主CNSCNS病变的不同，病变的不同，CNSCNS基因治疗的策略也不同，概括基因治疗的策略也不同，概括起来主要有下列四种：起来主要有下列四种：1 1、基因替代、基因替代(gene rep
16、lacement) (gene replacement) 指去除整个变异基因，指去除整个变异基因，用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更正。正。优点：遗传性疾病等的最理想的方法优点：遗传性疾病等的最理想的方法缺点：难以实现缺点：难以实现2 2、基因修正、基因修正(gene correction) (gene correction) 将致病基因的突变将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。碱基序列纠正，而正常部分予以保留。如基因打靶技术如基因打靶技术( (同源基因重组同源基因重组) )的研究进展已表明，的研究进展已表明，哺乳
17、动物细胞基因组确实存在着某些结构和酶学机哺乳动物细胞基因组确实存在着某些结构和酶学机制，可使外源制，可使外源DNADNA在特定的部位进行重组，从而使缺在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复成为可能。陷基因在原位特异性修复成为可能。 3 3、基因增强、基因增强(gene augmentation) (gene augmentation) 将目的基因导将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。近十年来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导近十年
18、来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导入真核细胞，并获得表达，因而是目前较为成熟的方入真核细胞，并获得表达，因而是目前较为成熟的方法。最适宜隐性单基因疾病的治疗法。最适宜隐性单基因疾病的治疗 4 4、基因抑制、基因抑制(gene constraint)(gene constraint)和和/ /或基因失或基因失活活(gene inactivation) (gene inactivation) 导入外源基因去干导入外源基因去干扰、抑制有害的基因表达。如向肿瘤细胞导入扰、抑制有害的基因表达。如向肿瘤细胞导入肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因( (如如RbRb或或p53)p53)，以抑制癌基因的，以抑制癌基
19、因的表达。表达。此外利用反义技术此外利用反义技术(antisense(antisense technology) technology)封封闭某些特定基因的表达，以达到抑制有害基因闭某些特定基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的，已被广泛用于表达的目的，已被广泛用于CNSCNS恶性肿瘤恶性肿瘤( (如胶如胶质母细胞瘤质母细胞瘤) )等的基因治疗研究中。等的基因治疗研究中。（三）中枢神经系统基因治疗的原则（三）中枢神经系统基因治疗的原则必须分离出含有调节序列的特异性基因；必须分离出含有调节序列的特异性基因；必须能够获得足够数量携带该基因的载体或必须能够获得足够数量携带该基因的载体或/ /和细胞
20、；和细胞；必须建立一条有效的途径将该外源基因导入脑必须建立一条有效的途径将该外源基因导入脑内、转染靶细胞；最后转染入宿主脑细胞的目内、转染靶细胞；最后转染入宿主脑细胞的目的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。长的时间，且不产生有害的副作用。导入导入CNSCNS内的基因要特异、稳定、高效、安全并内的基因要特异、稳定、高效、安全并具有可调控性。具有可调控性。n1 1、目的基因的选择、目的基因的选择 该基因的异常是疾病发生的根源；该基因的异常是疾病发生的根源；该基因遗传的分子机制清楚；该基因遗传的分子机制清楚；基因已被克隆，一
21、级结构和表达调控机基因已被克隆，一级结构和表达调控机制较为清楚；制较为清楚；可在体外操作，而且安全有效；可在体外操作，而且安全有效；转移基因在受体细胞内最好能够完整地、转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。质。染色体基因组染色体基因组互补互补DNA (complementary DNADNA (complementary DNA，cDNAcDNA) )多数是通过多数是通过cDNAcDNA的克隆化技术得到的。可应的克隆化技术得到的。可应用人工合成、用人工合成、PCRPCR技术扩增等途径获得目的基技术扩增等途径获得目的基因因
22、2 2、目的基因来源：、目的基因来源：目的基因必须置于合适的启动子的控制之下，目的基因必须置于合适的启动子的控制之下，编码基因的信号肽序列编码基因的信号肽序列(signal sequence)(signal sequence)必须必须完整，只有这样，目的基因才可获得适当的表完整，只有这样，目的基因才可获得适当的表达，基因调控是目前基因治疗研究的薄弱环达，基因调控是目前基因治疗研究的薄弱环节。节。其原则为：其原则为：最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水平较低；平较低
23、；细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长，使得有足够的时间进行体外基因操作；命周期较长，使得有足够的时间进行体外基因操作；n3 3、 受体细胞的选择受体细胞的选择 n -成败的一个关键因素，选择病变发生细胞成败的一个关键因素，选择病变发生细胞/ /非病非病变发生细胞变发生细胞离体的细胞要能接受外源基因的转染；离体的细胞要能接受外源基因的转染；细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内；安全输送回体内；能预设某一安全机制，在必要时可激活以阻止能预设某一安全机制，在必要时可激活以阻止修饰细胞在体内有
24、害的生长和修饰细胞在体内有害的生长和/ /或有害功能的发或有害功能的发挥，以避免肿瘤发生。挥，以避免肿瘤发生。 目前，应用于目前，应用于CNSCNS基因治疗研究的靶细胞主要有基因治疗研究的靶细胞主要有成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、条件永生性神经细胞及神经干细胞。中脑细胞、条件永生性神经细胞及神经干细胞。适合于基因转染及脑内移植的靶细胞最好来自宿适合于基因转染及脑内移植的靶细胞最好来自宿主自身的同源细胞，以避免发生免疫排斥。主自身的同源细胞，以避免发生免疫排斥。胶质细胞胶质细胞优势是能很好地在体外生长与繁殖，移植到脑内优势是能很好地
25、在体外生长与繁殖，移植到脑内靶点后可很好地存活并整合到脑实质中，可获得靶点后可很好地存活并整合到脑实质中，可获得长期、稳定的转基因表达，是一种潜在的基因治长期、稳定的转基因表达，是一种潜在的基因治疗细胞载体；疗细胞载体；其缺陷是植入脑内成瘤的危害性大。其缺陷是植入脑内成瘤的危害性大。胚胎中脑细胞胚胎中脑细胞相对安全，但细胞难于获得，在体外培养相对安全，但细胞难于获得，在体外培养较难，且不易用经典方法行基因转染。较难，且不易用经典方法行基因转染。神经干细胞神经干细胞最理想的转基因靶细胞，因它们在生长因最理想的转基因靶细胞，因它们在生长因子作用下能够不断生长繁殖，且植入脑后子作用下能够不断生长繁殖
26、，且植入脑后也能根据所处环境分化成相应细胞，并与也能根据所处环境分化成相应细胞，并与宿主形成突触联系。宿主形成突触联系。4 4、基因载体的选择、基因载体的选择 目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必须将目的基因重组于表达载体的合适位置，再导须将目的基因重组于表达载体的合适位置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体有载体有质粒载体质粒载体(plasmid vector)(plasmid vector)和病毒载体和
27、病毒载体(viral vector(viral vector) )两大类。两大类。n质粒载体质粒载体一般可用物理的、化学的以及融合法导入靶细胞。一般可用物理的、化学的以及融合法导入靶细胞。包含哺乳动物细胞的表达调控元件，细菌胞浆内进包含哺乳动物细胞的表达调控元件，细菌胞浆内进行 复 制 的 表 达 元 件 ， 因 此 被 称 为 穿 梭 载 体行 复 制 的 表 达 元 件 ， 因 此 被 称 为 穿 梭 载 体(shuttle (shuttle vector)vector)，意指在哺乳动物细胞和原核生物细胞中，意指在哺乳动物细胞和原核生物细胞中均能稳定复制、稳定存在的基因载体。均能稳定复制、
28、稳定存在的基因载体。目前被广泛应用于哺乳动物细胞的质粒载体目前被广泛应用于哺乳动物细胞的质粒载体有有pSV2pSV2，pRSVpRSV，pcDNA3pcDNA3和和pCIpCI载体系列等。载体系列等。可插入较大长度的外源基因可插入较大长度的外源基因( (10kb10kb以上以上) )，有较广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不有较广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细胞株，用于胞株，用于ex vivoex vivo基因转移。基因转移。病毒载体的构建原则与质粒载体相似，但进入靶细病毒载体的构建原则与质粒载体相似，但进入靶细胞的方
29、式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组胞的方式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞，进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞，以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表达。有多种病毒载体，其特点各异。达。有多种病毒载体，其特点各异。病毒载体病毒载体（四）中枢神经系统基因转移的方法和实（四）中枢神经系统基因转移的方法和实施途径施途径CNSCNS基因转移方法分为物理、化学和生物学三大基因转移方法分为物理、化学和生物学三大类
30、。前两类是非病毒的方法，后一类即生物学方类。前两类是非病毒的方法，后一类即生物学方法主要指病毒介导的基因转移，包括病法主要指病毒介导的基因转移，包括病毒，病毒两类。毒，病毒两类。1 1、病毒载体介导途径、病毒载体介导途径 即以复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。许多病即以复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。许多病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、慢病毒及多种杂交型病毒载体等，已应腺相关病毒、慢病毒及多种杂交型病毒载体等，已应用于用于CNSCNS基因治疗的基础和临床研究。作为基因治疗基因治疗的基础和临床研究。作为基因治疗的载体
31、，要得到广泛应用，必须简单、安全、可靠，的载体，要得到广泛应用，必须简单、安全、可靠，且能在宿主体内长期稳定表达且能在宿主体内长期稳定表达。迄今为止，病毒载体用于迄今为止，病毒载体用于CNSCNS细胞基因传递细胞基因传递取得了许多进展，尽管其安全性及效率仍取得了许多进展，尽管其安全性及效率仍有待提高，但有待提高，但in vivoin vivo方法已成为目前方法已成为目前CNSCNS基因转移的主要研究方向，只有基因转移的主要研究方向，只有in vivoin vivo方方法取得成功，法取得成功，CNSCNS基因治疗才能走向临床。基因治疗才能走向临床。重组病毒载体因其自然感染途径而成为较有效的重组病
32、毒载体因其自然感染途径而成为较有效的基因转移手段，病毒载体用于脑内基因传递应具基因转移手段，病毒载体用于脑内基因传递应具备哪些特点呢？备哪些特点呢？1 1、插入基因的容量必须足够插入基因的容量必须足够因载体内包含了目的基因、特异性调控序列及可因载体内包含了目的基因、特异性调控序列及可诱导的启动子；诱导的启动子； 病毒载体的特点2 2、脑内基因注射存在容量限制问题，故向特定神、脑内基因注射存在容量限制问题，故向特定神经元细胞群转染目的基因时，经元细胞群转染目的基因时，载体的转染效率及载体的转染效率及滴度必须较高滴度必须较高3 3、转基因产物的稳定表达、转基因产物的稳定表达是必要的，由于启动子是必
33、要的，由于启动子的失活，载体序列的物理丧失，细胞毒性效应及的失活，载体序列的物理丧失，细胞毒性效应及外源蛋白的免疫反应，此目标常常较难实现。外源蛋白的免疫反应，此目标常常较难实现。4 4、转基因产物表达量的可调控性、转基因产物表达量的可调控性也是重要的，载体中也是重要的，载体中包含的特异性调控序列对治疗控制是必要的。病毒载体具有包含的特异性调控序列对治疗控制是必要的。病毒载体具有CNSCNS细胞特异性的靶向性，即病毒载体能通过细胞特异性启动细胞特异性的靶向性，即病毒载体能通过细胞特异性启动子、特殊的受体表达或轴浆运输路线，选择性地感染某些细子、特殊的受体表达或轴浆运输路线，选择性地感染某些细胞
34、。胞。病毒载体病毒载体介导的基因转移能应用于临床，介导的基因转移能应用于临床，无毒无毒性或炎症性免疫反应性或炎症性免疫反应是必要的。是必要的。2 2、非病毒介导途径、非病毒介导途径即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。体内。避免重组病毒包装过程中产生的野生病毒污染和免疫避免重组病毒包装过程中产生的野生病毒污染和免疫反应，具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可反应，具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可通过物理方法实现靶向性转移（如基因枪）等优点。通过物理方法实现靶向性转移（如基因枪）等优点。直接导入的直接导入的DNADNA通常难以
35、整合入基因组，基通常难以整合入基因组，基因表达存在不稳定性，且在非分裂细胞中因表达存在不稳定性，且在非分裂细胞中基因的转染效率不高，使其应用受到限基因的转染效率不高，使其应用受到限制。制。迄今为止，在基因治疗研究中所用的非病迄今为止，在基因治疗研究中所用的非病毒基因转移法有直接注射法，磷酸毒基因转移法有直接注射法，磷酸钙转染法、电穿孔法、颗粒轰击技术、脂钙转染法、电穿孔法、颗粒轰击技术、脂质体介导的转移法，受体介导的基质体介导的转移法，受体介导的基因转移法等。因转移法等。这些基因转移方法可以转移仅由组成的载这些基因转移方法可以转移仅由组成的载体，并依赖不同机制将大分子物质摄入哺乳动物体，并依赖
36、不同机制将大分子物质摄入哺乳动物细胞中，并在细胞内运输。由此等方法转移的外细胞中，并在细胞内运输。由此等方法转移的外源基因的表达是暂时的，因为这些基因不易稳定源基因的表达是暂时的，因为这些基因不易稳定整合到宿主细胞的基因组，而易被细胞内的整合到宿主细胞的基因组，而易被细胞内的酶降解，并将其排出胞外。酶降解，并将其排出胞外。从概念上说，非病毒基因转移要比病毒基从概念上说，非病毒基因转移要比病毒基因转移方法安全。应用这些方法的前提是因转移方法安全。应用这些方法的前提是重组基因在人组织中只需要暂时性表达，重组基因在人组织中只需要暂时性表达，这在某些疾病如脑肿瘤的治疗中是很有用这在某些疾病如脑肿瘤的治
37、疗中是很有用的，同时这些基因可以象药物一样被反复的，同时这些基因可以象药物一样被反复应用。应用。二、中枢神经系统疾病基因治疗二、中枢神经系统疾病基因治疗的实验研究的实验研究许多实验动物模型已应用于许多实验动物模型已应用于CNSCNS疾病基因治疗疾病基因治疗研究，包括神经系统遗传病、神经变性疾研究，包括神经系统遗传病、神经变性疾病、脑缺血、脑创伤及脑肿瘤等。病、脑缺血、脑创伤及脑肿瘤等。这些模型这些模型均可通过药物诱导或损伤诱发，而脑肿瘤模均可通过药物诱导或损伤诱发，而脑肿瘤模型则可通过体外培养的肿瘤细胞移植动物脑型则可通过体外培养的肿瘤细胞移植动物脑内而产生。内而产生。随着许多神经系统疾病致病
38、基因的明确，应随着许多神经系统疾病致病基因的明确，应用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因的转基因动物模型已成为现实，这些小鼠模型的转基因动物模型已成为现实，这些小鼠模型包括嗜质体酶缺乏症、视网膜变性综合征，此包括嗜质体酶缺乏症、视网膜变性综合征，此外还包括自发性脑肿瘤和神经变性综合征等。外还包括自发性脑肿瘤和神经变性综合征等。（一）遗传性神经疾病（一）遗传性神经疾病 人类基因治疗最早着眼于遗传性疾病（主要限于单基因人类基因治疗最早着眼于遗传性疾病（主要限于单基因遗传病），随着越来越多遗传病），随着越来越多CNSCNS遗传病致病基因的发现和克遗传病致病
39、基因的发现和克隆，应用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因的隆，应用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因的转基因动物模型也已成为现实，使得遗传性疾病的基因转基因动物模型也已成为现实，使得遗传性疾病的基因治疗研究变得更加活跃。治疗研究变得更加活跃。1 1、HuntingtonHuntington病病 一种以基底节和大脑皮层变性为主要病变的常染色体显一种以基底节和大脑皮层变性为主要病变的常染色体显性遗传病，性遗传病，主要临床特征是慢性进行性发展的舞蹈样动主要临床特征是慢性进行性发展的舞蹈样动作和痴呆。其发病机制仍不清楚，目前，研究发现作和痴呆。其发病机制仍不清楚，目前，研究发现HDHD与与IT
40、15IT15基因的单一型突变有关，导致基因的单一型突变有关，导致HuntingtonHuntington蛋白中的蛋白中的多聚谷胺酰胺纤维大量增加，使纹状体多聚谷胺酰胺纤维大量增加，使纹状体GABAGABA能输出神经能输出神经元细胞群对兴奋性毒性、氧化应急和线粒体功能障碍的元细胞群对兴奋性毒性、氧化应急和线粒体功能障碍的敏感性增加。敏感性增加。几种几种HDHD基因治疗方法已分别在基因治疗方法已分别在DNADNA、RNARNA和蛋白水平进和蛋白水平进行了研究，反义基因治疗对这种疾病来说还存在技术行了研究，反义基因治疗对这种疾病来说还存在技术上困难，但保护性基因治疗方法却取得了令人鼓舞的上困难，但保
41、护性基因治疗方法却取得了令人鼓舞的结果。后者主要包括移植能分泌保护或替代因子的工结果。后者主要包括移植能分泌保护或替代因子的工程细胞，例如产生程细胞，例如产生NGFNGF的成纤维细胞或神经前体细的成纤维细胞或神经前体细胞。胞。几种神经营养因子，包括几种神经营养因子，包括BDNFBDNF，已被证实有益于纹，已被证实有益于纹状体神经元的存活。状体神经元的存活。BemelmansBemelmans等将克隆等将克隆BDNFBDNF基因的基因的AdAd注射至注射至Huntington Huntington 病模型大鼠的纹状体中，发现病模型大鼠的纹状体中，发现BDNFBDNF的存在能促进纹状体神经元的存活
42、。的存在能促进纹状体神经元的存活。 2 2、杜兴氏肌营养不良征、杜兴氏肌营养不良征目前，目前，dystrophindystrophin基因已被克隆，基因已被克隆，dystrophindystrophin全长全长cDNAcDNA约约为为14kb14kb。应用。应用dystrophindystrophin基因治疗基因治疗DMDDMD的研究正在进行，的研究正在进行，AkkarajuAkkaraju等应用第一和第二代复制缺陷型等应用第一和第二代复制缺陷型HSVHSV载体，介导全载体，介导全长长dystrophindystrophin基因转移至基因转移至dystrophindystrophin缺陷的肌萎
43、缩细胞和缺陷的肌萎缩细胞和转基因小鼠体内，并观察到转基因小鼠体内，并观察到dystrophindystrophin在肌萎缩细胞中和在肌萎缩细胞中和小鼠体内的表达，但治疗范围局限于注射部位，因不能得小鼠体内的表达，但治疗范围局限于注射部位，因不能得到全身性的治疗效果，其应用前景并不乐观。到全身性的治疗效果，其应用前景并不乐观。ChoCho等就此问题进一步进行了探索，他们在等就此问题进一步进行了探索，他们在应用重组应用重组AdAd介导介导dystrophindystrophin基因转移取得成基因转移取得成功的基础上，通过改变血管腔内的功的基础上，通过改变血管腔内的StarlingStarling力
44、和肌纤维成熟度，试图从血管内途径给力和肌纤维成熟度，试图从血管内途径给予克隆予克隆dystrophindystrophin基因的基因的AdAd，从而达到全身，从而达到全身治疗目的。治疗目的。 3、神经退变性疾病：、神经退变性疾病：如帕金森病如帕金森病目前有两种主要策略：目前有两种主要策略：神经递质合成或代谢酶的基因转移，可部分增神经递质合成或代谢酶的基因转移，可部分增强变性系统的功能。强变性系统的功能。营养因子或保护蛋白的转基因可以延缓或阻止营养因子或保护蛋白的转基因可以延缓或阻止进一步的神经变性进程。进一步的神经变性进程。、帕金森病（、帕金森病（Parkinsons disease，PD ）
45、 中老年人常见的中枢神经系统变性疾病之一，主要病理中老年人常见的中枢神经系统变性疾病之一，主要病理特征为黑质纹状体系多巴胺能神经元进行性死亡，多巴特征为黑质纹状体系多巴胺能神经元进行性死亡，多巴胺胺(dopamine, DA)(dopamine, DA)含量显著减少。临床表现为静止性震含量显著减少。临床表现为静止性震颤、肌强直、动作减少及平衡障碍。由于其病因和发病颤、肌强直、动作减少及平衡障碍。由于其病因和发病机制尚未明确，目前的所有治疗手段，包括药物治疗和机制尚未明确，目前的所有治疗手段，包括药物治疗和各种外科手术只限于症状控制，不能从根本延缓或阻止各种外科手术只限于症状控制，不能从根本延缓
46、或阻止其病程的进展。其病程的进展。7070年代后期国内外学者曾尝试应用肾上腺髓质细年代后期国内外学者曾尝试应用肾上腺髓质细胞、胚胎黑质细胞、交感神经节细胞及复合组织胞、胚胎黑质细胞、交感神经节细胞及复合组织细胞移植治疗细胞移植治疗PDPD。取得了一些进展，但由于供体细胞来源困难、免取得了一些进展，但由于供体细胞来源困难、免疫排斥、植入细胞难以在宿主脑内长期存活等诸疫排斥、植入细胞难以在宿主脑内长期存活等诸多因素，限制了它的临床应用。多因素，限制了它的临床应用。目前对目前对PDPD治疗研究最多、最有前途的方法为基因治疗研究最多、最有前途的方法为基因治疗。治疗。PDPD被认为是中枢神经系统疾病基因
47、治疗的被认为是中枢神经系统疾病基因治疗的最佳模型，因为它的病理机制较明确，病变部位最佳模型，因为它的病理机制较明确，病变部位局限，变性细胞单一，相关的基因已被克隆，有局限，变性细胞单一，相关的基因已被克隆，有适当的动物模型，移植的方法也比较成熟。适当的动物模型，移植的方法也比较成熟。 PDPD基因治疗主要有两条途径：通过引入左旋多巴基因治疗主要有两条途径：通过引入左旋多巴或多巴胺合成酶，提高纹状体内多巴胺含量；通或多巴胺合成酶，提高纹状体内多巴胺含量；通过引入潜在的神经保护分子，阻止多巴胺神经元过引入潜在的神经保护分子，阻止多巴胺神经元进一步死亡，促进受损的黑质纹状体系统重建和进一步死亡，促进
48、受损的黑质纹状体系统重建和功能恢复。提高脑内多巴胺含量能减轻其临床症功能恢复。提高脑内多巴胺含量能减轻其临床症状，而阻止多巴胺能神经元死亡，则有可能从根状，而阻止多巴胺能神经元死亡，则有可能从根本上治愈该病。本上治愈该病。体内多巴胺合成过程中存在两种催化酶，体内多巴胺合成过程中存在两种催化酶，酪氨酸羟化酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylasetyrosine hydroxylase，THTH）和）和芳香氨基酸脱羧酶芳香氨基酸脱羧酶（aromatic-amino-acid aromatic-amino-acid decarboxylasedecarboxylase, AADC,
49、AADC），），THTH是脑内多巴胺生物是脑内多巴胺生物合成的限速酶，合成的限速酶，PDPD患者患者THTH及及TH mRNATH mRNA的水平明显的水平明显低于正常人，而低于正常人，而TH mRNA/THTH mRNA/TH的比值与正常人没有的比值与正常人没有明显差异，提示通过脑内补充明显差异，提示通过脑内补充THTH基因，可以促进基因，可以促进L-DopaL-Dopa的生成。的生成。而而AADCAADC即使在纹状体失神经支配情况下，即使在纹状体失神经支配情况下，在非多巴胺神经能神经元或胶质细胞中仍充分存在非多巴胺神经能神经元或胶质细胞中仍充分存在。故治疗中只需在纹状体内表达外源性在。故治
50、疗中只需在纹状体内表达外源性THTH，多，多巴胺含量即可明显提高。但巴胺含量即可明显提高。但THTH的活性功能离不开的活性功能离不开辅助因子辅助因子BH4BH4的作用，在纹状体失神经支配时这的作用，在纹状体失神经支配时这种辅助因子的水平也下降，种辅助因子的水平也下降，THTH和和BH4BH4合成酶，合成酶，GTP-cyclohydrolase1GTP-cyclohydrolase1的联合移植，对获得足够的联合移植，对获得足够的的L-dopaL-dopa产物是需要的。产物是需要的。Wolff Wolff 等应用逆转录病毒载体将等应用逆转录病毒载体将TH cDNATH cDNA 转染至大转染至大鼠
