1、实验材料实验材料1.1.肠道致病菌的鉴定：肠道致病菌的鉴定： 玻片每人玻片每人2 2张；张； 革兰染液；革兰染液； 沙门菌属多价沙门菌属多价O O血清（血清（1 1套套/ /班）；班）； 双糖铁培养基（双糖铁培养基（2 2支支/ /组，组，1818支支/ /室）；室）； 大肠，伤寒，痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象大肠，伤寒，痢疾三种细菌在双糖铁培养基上的生长现象 示教（每个教室示教（每个教室1 1组）。组）。2.2.药敏实验：药敏实验： 菌液（菌液（1 1个个/ /组，组，8 8个个/ /室）。室）。 固体平板（固体平板（2 2个平板个平板/ /组，组，1919个个/ /室）；室）；
2、药敏纸片（药敏纸片（1 1套套/ /班）。班）。 药敏实验的示教板（药敏实验的示教板（1 1个个/ /室，共室，共8 8个）。个）。3.3.内毒素的检测（内毒素的检测（2 2人人/ /组，组，2 2支鲎试剂，共支鲎试剂，共3838支鲎试剂支鲎试剂/ /室）室） 三、肠道杆菌的鉴定三、肠道杆菌的鉴定 二、药敏试验二、药敏试验 一、内毒素的检测一、内毒素的检测一、内毒素的检测一、内毒素的检测 目的目的 1.1.掌握内毒素实验的原理和操作方法。掌握内毒素实验的原理和操作方法。 2.2.熟悉内毒素实验的意义。熟悉内毒素实验的意义。 检测方法检测方法 家兔发热法：比较烦琐，且灵敏度不高；家兔发热法：比较
3、烦琐，且灵敏度不高； 鲎实验法：灵敏度高，可检测小于鲎实验法：灵敏度高，可检测小于10ng/ml 的内毒素的内毒素。鲎鲎 horseshoe crab 原理：原理：鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。 内毒素（内毒素（LPSLPS） 激活激活 凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白凝固蛋白 （溶解状态）（溶解状态） （凝胶状态）（凝胶状态）凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶 材料：材料： 鲎试剂鲎试剂 内毒素试剂内毒素试剂 鲎试剂专用溶解水鲎试剂专用溶解水
4、无菌无热源质吸管无菌无热源质吸管实实 验验对对 照照0.2ml0.2ml溶解水溶解水0.1ml0.1ml溶解水溶解水+0.1ml+0.1ml内毒素内毒素方法：方法：（每四人两支鲎试剂，一支实验一支对照）（每四人两支鲎试剂，一支实验一支对照）结果：结果： 实验组出现凝固实验组出现凝固 对照组不出现凝固对照组不出现凝固垂直放入垂直放入37温箱，温箱，20-30分钟观察结果。分钟观察结果。内毒素检测的应用：内毒素检测的应用：1.1.检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素；检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素；2.2.临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引临床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引 起的
5、内毒素血症（内毒素休克）等。起的内毒素血症（内毒素休克）等。二、药二、药 敏敏 试试 验验目的要求目的要求1.1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定；掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定；2.2.了解药敏试验的操作方法和意义。了解药敏试验的操作方法和意义。 原原 理理 含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生浓度梯度。在纸片周围抑菌
6、浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。测试菌对测定药物的敏感程度。 主要实验材料主要实验材料1.1.大肠杆菌，白色葡萄球菌培养物大肠杆菌，白色葡萄球菌培养物2.2.含抗生素的滤纸片：含抗生素的滤纸片： 青霉素青霉素 氯霉素氯霉素 链霉素链霉素 庆大霉素庆大霉素3.3.普通平板，细菌接种工具，培养箱普通平板，细菌接种工具，培养箱 方法步骤方法步骤1.1.标记分区；标记分区；2.2.密涂接种；密涂接种；3.3.贴药敏纸片；贴药敏纸片；4.4.培养；培养；5.5.结果观察。结果观察。1.标记分区标记分区
7、2.密涂接种密涂接种3.贴药敏纸片贴药敏纸片4.培养培养 置置37温箱，温箱， 培养培养18-24h。 五、五、 结果结果 抑菌圈直径抑菌圈直径操作内容操作内容1.1.两人两人1 1个平板个平板2.2.密涂接种大肠杆菌，贴片，标记及培养密涂接种大肠杆菌，贴片，标记及培养三、肠道杆菌的鉴定三、肠道杆菌的鉴定病病 原原 菌菌 的的 检检 验验 程程 序序增菌培养革兰染色分离培养接种琼脂斜面纯培养采集标本生化试验生化试验血清学试验血清学试验动物试验动物试验分析鉴定革兰染色观察菌落特征观察菌落特征 概念：用生化的方法来检测细菌对概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质各种基质的代谢作用及代谢产物的代谢作
8、用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验。这种生化试验称为细菌的生化反应试验。 意义：是意义：是鉴别细菌鉴别细菌的重要依据。的重要依据。细菌的生化反应细菌的生化反应生化反应生化反应碳水化合物碳水化合物代谢试验代谢试验各种酶类试验：各种酶类试验：抑菌试验抑菌试验糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验甲基红试验V-PV-P试验试验蛋白质和氨基蛋白质和氨基酸代谢试验酸代谢试验硫化氢试验硫化氢试验吲哚试验吲哚试验碳源和氮源碳源和氮源利用试验利用试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验IMViC试验试验尿素酶实验尿素酶实验（一）糖发酵试验（一）糖发酵试验 原理原理 根据细
9、菌分解利用糖能力的差根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否异表现出是否产酸产气产酸产气作为鉴定作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂发酵培养基中加入指示剂溴甲酚溴甲酚紫紫（其（其pHpH在在5.25.2以下呈黄色，以下呈黄色，pHpH在在6.86.8以上呈紫色），经培养后根据以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒产气，可在发酵培养基中放入倒置置杜氏小管杜氏小管观察。观察。微量细菌生化鉴定管微量细菌生化鉴定管1 1、确定细菌是否生长、确定细菌是否生长2 2、产酸，则培养基指示剂
10、（溴甲酚紫）变为黄色，以、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+ +”表示。表示。3 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用泡，用“”表示。表示。4 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“- -”表示。表示。 结果结果 方法方法 取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置倒立小管内无气泡，接种细菌后置3737温箱培养温箱培养18182424小时，观察结果。小时，观察结果。 大肠杆菌
11、伤寒杆菌 副伤寒杆菌葡萄糖 +乳糖 - - 糖发酵实验糖发酵实验（二）（二）IMViC试验试验 是一组试验是一组试验 靛基质试验或称吲哚试验（靛基质试验或称吲哚试验（I I）、）、甲基红试验（甲基红试验（M M）、）、V VP P试验（试验（V V）和枸橼酸盐利用试验（和枸橼酸盐利用试验（C C）可缩写为可缩写为IMViCIMViC试试验，验，i i是为了发音的需要加入的。是为了发音的需要加入的。 常用于革兰阴性的肠道细菌检测中，可区分产气杆菌属常用于革兰阴性的肠道细菌检测中，可区分产气杆菌属和大肠杆菌属和大肠杆菌属 大肠杆菌；产气肠杆菌；大肠杆菌；产气肠杆菌； 伤寒杆菌伤寒杆菌- -； 痢疾
12、杆菌痢疾杆菌- -。 原理原理 色氨酸色氨酸几乎存在于所有的蛋白质中，某些细菌含色氨几乎存在于所有的蛋白质中，某些细菌含色氨酸酶，能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质（吲酸酶，能将分解蛋白胨中的色氨酸而生成靛基质（吲哚）。后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形哚）。后者与寇氏试剂中对二甲基氨基苯甲醛作用，形成成红色红色。 方法方法 将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，将大肠杆菌、产气杆菌分别接种在蛋白胨水培养基中，3737培养培养24244848小时取出，在上述细菌的培养液内各加小时取出，在上述细菌的培养液内各加入寇氏试剂数滴，略加振摇，静止半分钟后观察结果。入寇氏试剂数滴，略
13、加振摇，静止半分钟后观察结果。1. 吲哚试验吲哚试验v大肠杆菌为阳性大肠杆菌为阳性v伤寒杆菌为阴性伤寒杆菌为阴性 结果结果 阴性阴性 阳性阳性葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH降至降至4.4以下以下甲基红试剂甲基红试剂培养基培养基变红变红2.甲基红试验甲基红试验乙酰甲基甲醇（中性）pH5.4 甲基红试剂甲基红试剂培养基培养基橘黄色橘黄色大肠杆菌大肠杆菌产气杆菌产气杆菌 方法方法 在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂在大肠杆菌和产气杆菌培养物中滴加甲基红指示剂数滴，立即观察结果。数滴，立即观察结果。 结果结果 红色为阳性，红色为阳性，+ 不出现红色为阴性，不出现红色为阴性，
14、-葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇二乙酰二乙酰V-P试剂试剂培养基培养基变红变红与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基与蛋白胨培养基精氨酸中的胍基反应生成红色化合物反应生成红色化合物3. VP试验试验产气杆菌产气杆菌 方法方法 取出试管培养物，加入等量的李氏试剂，摇匀后取出试管培养物，加入等量的李氏试剂，摇匀后不加塞，静置不加塞，静置3030分钟观察结果。分钟观察结果。 结果结果 红色为阳性，红色为阳性，+ +无红色为阴性，无红色为阴性，- -枸橼酸盐枸橼酸盐铵盐铵盐碳酸盐碳酸盐氨氨培养基培养基pH上升上升溴麝香草酚蓝溴麝香草酚蓝 呈碱性变色呈碱性变色培养基变蓝培养基培养基 4. 枸橼酸
15、盐利用试验枸橼酸盐利用试验产气杆菌产气杆菌 结果结果 深蓝色为阳性深蓝色为阳性+ 绿色为阴性绿色为阴性-（三）硫化氢产生试验（三）硫化氢产生试验 原理原理 某些细菌能分解蛋白质中的某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸含硫氨基酸，如半胱氨，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 方法方法 分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中。养基中。3737孵育孵育2424小时后观察结果。小时后观察结果。
16、 结果结果 沿穿刺线部位呈黑褐色，沿穿刺线部位呈黑褐色，表明有硫化氢产生，为阳性以表明有硫化氢产生，为阳性以“+ +”表示，不变色者为阴性，表示，不变色者为阴性，以以“- -”表示。表示。 大肠杆菌：大肠杆菌：- - 变形杆菌：变形杆菌：+ +二、肠道杆菌的鉴定二、肠道杆菌的鉴定实验目的：实验目的： 1.1.熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程；熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程； 2.2.进一步熟练掌握革兰染色的操作；进一步熟练掌握革兰染色的操作； 3.3.学会在选择培养基中进行菌落的观察；学会在选择培养基中进行菌落的观察； 4. 4.掌握肠道杆菌在双糖铁培养基上的生长掌握肠道杆菌在双糖铁培养基上的生长
17、特点。特点。粪粪 便便 增菌培养（必要时）增菌培养（必要时）SS SS 培养基培养基菌落特征；涂片镜菌落特征；涂片镜检（革兰染色）；检（革兰染色）；生化反应生化反应血清学鉴定血清学鉴定（玻片凝集）（玻片凝集）报告结果报告结果肠道杆菌的鉴定程序已完成已完成接种双糖铁接种双糖铁SSSS培养基上各菌的生长特点：培养基上各菌的生长特点：大肠杆菌：粉红色大菌落大肠杆菌：粉红色大菌落痢疾杆菌：无色细小半透明菌落痢疾杆菌：无色细小半透明菌落伤寒杆菌：半透明小菌落，黑色沉淀伤寒杆菌：半透明小菌落，黑色沉淀（一）观察（一）观察SS培养基上细菌生长现象培养基上细菌生长现象冲洗冲洗染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使
18、用油镜观察实验结果染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果（二）革兰染色（取（二）革兰染色（取ssss培养基上的两种菌落的细菌染色）培养基上的两种菌落的细菌染色） 1.细菌涂片的制备细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2.染色染色 初染（结晶紫）初染（结晶紫） 媒染（碘液）媒染（碘液） 脱色脱色（丙酮乙醇）（丙酮乙醇） 复染（沙黄）复染（沙黄） 吸水纸吸干吸水纸吸干 10s10s10-20s30s冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗方法：穿刺方法：穿刺+ +斜面斜面 接种针挑取单个菌落，沿接种针挑取单个菌落，沿培养基中心垂直插入至距离管培养基中心垂直插入至距离管底底0.5cm0.5c
19、m处处，原路退出。，原路退出。 接种环接种环挑取单个菌落挑取单个菌落，自斜面底部向上划一直线，然后，自斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。再从斜面底部向上轻轻来回作蜿蜒划线。 培养培养18-2418-24小时，观察结果并分析。小时，观察结果并分析。注意：注意：1. 1. 应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。应在菌落稀疏部位挑取单个菌落。 2. 2. 穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。穿刺和斜面接种原则上应为同一个菌落。 3. 3. 不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。不同的小组可以选择不同颜色的菌落来接种。（三）双糖铁培养基（三）双糖铁培养基（KIA）进行培养）进行培
20、养 双糖铁培养基上各菌的生长特点双糖铁培养基上各菌的生长特点n含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有乳糖和葡萄糖：产酸产气n含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀。硫化氢，可形成黑色沉淀。n酚红指示剂：酚红指示剂： 酸酸 黄黄 碱碱 红红 酚红的变色范围：酚红的变色范围：6.8-8.0 黄黄-红红1.1.大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），使斜面及底层均呈黄色并有气泡。），使斜面及底层均呈黄色并有气泡。2.2.沙门菌和志贺菌沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖只发酵葡萄糖，不发酵乳糖
21、，分解，分解葡萄糖产的酸使培养基葡萄糖产的酸使培养基pHpH下降，酚红指示剂变黄，下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%0.1%，在斜面的酸性物，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。，而底层则为黄色。 双糖铁培养基上各菌的生长特点双糖铁培养基上各菌的生长特点 双糖铁培养基上各菌的生长现象双糖铁培养基上各菌的生长现象大肠杆菌大肠杆菌黄色有气泡黄色有气泡伤寒杆菌伤寒杆菌上红下黄中间有黑色沉淀上红下黄中间有黑色沉淀痢疾杆菌痢疾
22、杆菌上红下黄上红下黄（四）血清学试验（四）血清学试验-玻片凝集法玻片凝集法方法：方法： 1.1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。分别取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。分别在两边滴加在两边滴加1 1滴沙门菌属多价血清。滴沙门菌属多价血清。 2.2. 用接种环挑取用接种环挑取SSSS平板上菌落（平板上菌落（黑色菌落，粉红黑色菌落，粉红色大菌落色大菌落）与血清混合研磨成均匀乳状。）与血清混合研磨成均匀乳状。 3.3.轻轻摇动玻片，轻轻摇动玻片，1min1min内观察结果。内观察结果。 伤寒血清伤寒血清+ +待测菌待测菌 伤寒血清伤寒血清+ +待测菌待测菌结果结果: : 凝集凝集+ + （伤
23、寒杆菌）；无凝集（伤寒杆菌）；无凝集- -（大肠杆菌）（大肠杆菌）本次实验所做内容本次实验所做内容肠道杆菌鉴定肠道杆菌鉴定（1 1）观察菌落特征（）观察菌落特征（SSSS平板）平板）（2 2）取可疑菌落做革兰染色（）取可疑菌落做革兰染色（1 1张张/ /人）人）（3 3）双糖铁培养基接种（）双糖铁培养基接种（2 2支支/ /组）组）（4 4）血清学试验鉴定伤寒杆菌（）血清学试验鉴定伤寒杆菌（1 1张张/ /人）人）（5 5）观察大肠杆菌，伤寒杆菌在双糖铁培养基上）观察大肠杆菌，伤寒杆菌在双糖铁培养基上的生长现象（示教）的生长现象（示教） 结果判断依据结果判断依据 SS平板：菌落的形态，颜色；平
24、板：菌落的形态，颜色；革兰染色：形态，排列，染色特点革兰染色：形态，排列，染色特点双糖铁培养基上生化特点双糖铁培养基上生化特点血清学试验的结果血清学试验的结果 实验报告实验报告肠道致病菌培养后的鉴定结果以及鉴定依据。肠道致病菌培养后的鉴定结果以及鉴定依据。1.SS1.SS培养基菌落特点。培养基菌落特点。2.2.革兰染色的结果。革兰染色的结果。3.3.玻片凝集的结果。玻片凝集的结果。4.4.双糖铁的生长现象描述。双糖铁的生长现象描述。5.5.结论。结论。下周实验内容下周实验内容 口腔微生物观察及牙菌斑检测口腔微生物观察及牙菌斑检测； 真菌染色观察真菌染色观察真菌菌落的观察；真菌菌落的观察；每个班务必带一个发霉的每个班务必带一个发霉的馒头！（班长负责）馒头！（班长负责）
