1、 Chapter 4 The Replication of DNA Chapter 8 of the bookIntroductionWhen will the DNA replication happen? DNA DNA 复制在细胞周期的复制在细胞周期的S S期期E.coliE.coli 37 37 0.5 h0.5 h10105 5 bp/minbp/minmammalian cell mammalian cell 500-5000 bp/min （4）细菌）细菌(E.coli)DNA每个每个细胞周期只复制一次细胞周期只复制一次1、Semi-Conservative Replicatio
2、n 1958 Meselson-stahl 设计的设计的CsCl超离心试验证实了超离心试验证实了 DNA复制的这一特性复制的这一特性概念：概念： 复制过程中各以双螺旋复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模的其中一条链为模 板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子 代代DNA分子分子 15N 标记实验标记实验 细胞生长在细胞生长在15N 标记培养基中标记培养基中 转入正常转入正常N源培养基中源培养基中 分离各代分离各代DNA 分析各代分析各代DNA的浮力密度的浮力密度15N 标记标记 DNA未标记未标记 DNA CsCL密度梯度离心密度梯度离心 浮力密
3、度浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml 聚合反应：聚合反应：substratedNTP Poly(核苷酸核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷核苷酸酸)n+13-OH 2Pi The direction of replicationCorrectly paired bases are required for DNA-polymerase-catalyzed nucleotide addition子链子链DNA延伸方向只能是延伸方向只能是535 OHT C AT C A C 5 OH 3ppp OH C+ p
4、pi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 pppa、因能量的需要，、因能量的需要， DNA的的5 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0.2M Nacl 的生理环境中，的生理环境中， 使使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5端端 需要其他机制以解脱需要其他机制以解脱 The initiation of a new strand of DNA requir
5、es an RNA primer (primase)DNA helicases unwind the double helix in advance of the replication forkSingle-stranded DNA- binding proteins stabilize ssDNA prior to replicationTopoisomerases remove supercoils produced by DNA unwinding at the replication forkDNA polymerase extend the DNA chainTable 8-1 (
6、factors involved in the replication) 1)、 解螺旋酶解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶又称解旋酶, 通过水解通过水解ATP获得能量获得能量,解开解开DNA双链双链. 2). 单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB): 结合在结合在DNA单链上单链上,有时有时有协同效应有协同效应. 3)、 DNA旋转酶旋转酶 ：消除复制叉前进过程中产生的：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋正超螺旋，产生负超螺旋.The initiation of DNA replication（1） OriC in E. coli chromosomal DNA 四个四个9
7、bp的重复序列的重复序列 dnaA结合位点结合位点 三个三个13bp的重复序列的重复序列若干若干GATC位点位点酵母菌的复制起点酵母菌的复制起点称为ARS(autonomously replicating sequence)，有100多个bp。ARS包括一个共有序列(A)和附加元件(B1B3)。A功能域为ARS的中心，可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；A元件在芽殖酵母中高度保守，是复制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是复制起始识别复合物（origin recognition complex, ORC）结合复制起始位点所必需的，对起始因
8、子在复制起始位点的组装起基本作用。Replication fork 真核生物（真核生物（Eukaryote） : 多复制起点多复制起点 即即一个一个genome中有中有多个复制单位多个复制单位The initiation of DNA replicationDnaA is the initiatorprimasean RNA enzyme involved in the replication of DNA.Primase catalyzes the synthesis of a short RNA segment (called a primer) complementary to a ss
9、DNA template.no known DNA polymerases can initiate the synthesis of a DNA strand without an initial RNA or DNA primer 引发体（包括引发酶）引发体（包括引发酶）ppp RNA引物引物DNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase DNA Ligase 所需条件：所需条件： a、 切刻的切刻的 3OH 和和 5P 相邻相邻 b、 切刻各自碱基处于配对状态切刻各自碱基处于配对状态 c、 需要能量需要能量 原
10、核（原核（ATP、NAD） 真核（真核（ATP） 用途：用途： 复制过程中，复制过程中，5 端端RNA引物被置换后切刻的连接引物被置换后切刻的连接 修复、重组修复、重组DNA polymerase 三种三种DNA聚合酶的结构和功能聚合酶的结构和功能 35 exonuclease activity（polymerase I, II, III） 校对功能校对功能(proofreading) 53 exonuclease activity (polymerase I, III) DNApol的的53外切活性有以下三个特点：外切活性有以下三个特点： 必须有必须有5磷酸末端磷酸末端 被除去的核苷酸必须是
11、已经配对的被除去的核苷酸必须是已经配对的 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖糖 核苷酸核苷酸 （切刻平移）（切刻平移） 其中其中 DNApol 全酶有十种共全酶有十种共22个亚基个亚基二聚体二聚体 滑动钳滑动钳Interaction between DNA and DNA polymeraseThe initiation of DNA synthesis in E.coli 2、真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五种五种 位置位置 核内核内 核内核内 核内核内 核内核内 线粒体线粒体 合成合成 与与引发引发 修复修复 合成合成 合成合成,
12、修复修复 复制复制功能功能 酶酶结合结合 前导链前导链 后随链后随链35校校 NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 Activation of the pre-RC leads to the assembly of the eukaryotic replication forkThe activation of pre-RCs is tightly regulated by cyclin-dependent kinases (Cdks) （3）复制终止）复制终止a、终止序列终止序列 E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白止蛋白 序列
13、一：序列一：terE terD terA 序列二：序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用每个区域只对一个方向的复制叉起作用 b、专一性终止蛋白、专一性终止蛋白 E.coli 中由中由 tus gene 编码编码 （terminus utilization substance） 通过抑制通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用螺旋酶而发挥终止作用 每次复制时只使用一个终止位点每次复制时只使用一个终止位点ter 5、复制忠实性的保证、复制忠实性的保证 1、DNApol的的35外切酶活性外切酶活性 (exonuclease activity) 2、DNApol只能从引物的
14、只能从引物的3 端延伸端延伸DNA （需要需要RNA引物引物） a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高，、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高， 且不易校正且不易校正 b、RNA引物最终被降解而避免错误引物最终被降解而避免错误 3、后随链的不连续合成、后随链的不连续合成 因其有利于错配碱基的校正因其有利于错配碱基的校正 3.6. 真核生物真核生物DNA的复制的复制(DNA replication in Eukaryote) 3. 3. 真核生物真核生物DNADNA复制的引发酶复制的引发酶 DNApol + primaseDNApol + primase形成紧密的复合物形成紧密的复合物 6
15、-9 Nt RNA as primer 引发酶（引发酶（primase）：）： 50-60kd 作用方式为阵发性的，每次作用拷贝作用方式为阵发性的，每次作用拷贝615个核苷酸个核苷酸 既能利用既能利用NTP，又能利用，又能利用dNTP SV40体外体外DNA复制情况分析复制情况分析 端粒位于真核生物染色体DNA的3末端，由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。端粒的功能：维持染色体的完整性，决定细胞的寿命。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。端粒的结构端粒的结构DNA端粒由简单的串联重复序列组成人和其他脊椎动物：AGGGTT纤毛原生动
16、物四膜虫：GGGGTT和GGGGTTTT面包酵母：G13T和G15A共同特点：富含G；长度达几百到几kb；人类DNA端粒长几kb到几十kb。端粒酶端粒酶(Telomerase)是催化端粒合成的酶。它是由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体。端粒酶中的蛋白部份具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。端粒酶的作用机制：端粒酶的RNA分子与端粒DNA配对，以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA，向53延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA3端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次合成几百个或数千个重复序
17、列。（3） 补齐过程补齐过程 通过通过TG链的回折形成链的回折形成 发夹结构（发夹结构（GG氢键）氢键） 尺蠖模型尺蠖模型 实现端粒酶位置的实现端粒酶位置的 调整调整大多数体细胞不合成端粒酶，每次分裂后端粒就变短（约30200bp）。当端粒比正常的长度短数kb时细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象征。实验证明将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂次数。癌细胞主要特性是能无限期的分裂增生，这需要不断表达端粒酶。实验发现癌细胞的端粒酶活性很强。这点可被用来检验癌细胞。实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到而计数
18、细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡时，细胞终止分裂衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老 研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命研究端粒丢失的速率，预测人类的寿命 XX XY why?XX XY why?研究推测端粒酶与肿瘤的关系研究推测端粒酶与肿瘤的关系ColE1质粒DNA的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNA两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。其中RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切
19、割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。原核细胞DNA复制的调控 真核生物的复制起真核生物的复制起始受始受许可因子许可因子的控的控制制a、复制子的大小（、复制子的大小（Sizes of replicon）:Yeast or fly平均平均 40 kbMammals 平均平均 100 kbProkaryotic DNA: 1000 kbb、冈崎片段、冈崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic DNA:100-200 ntc、复制速度（、复制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA复制的比较复制的比较
