1、理论上三大发现理论上三大发现技术上三大发明技术上三大发明 遗传物质是遗传物质是DNA DNA双螺旋结构双螺旋结构 遗传信息传递方式遗传信息传递方式 工具酶工具酶 载体载体 转录酶转录酶1973年年 以以DNA重组实验成功为标志重组实验成功为标志现代分子生物学现代分子生物学跨越天然物种屏障跨越天然物种屏障定向创造新物种定向创造新物种工具酶工具酶基因基因载体载体受体细胞受体细胞必要条件必要条件操作过程操作过程 获得获得外源基因（目的基因外源基因（目的基因/ /目的片段）目的片段） 与载体进行体外与载体进行体外重组重组形成重组体（重组子）形成重组体（重组子） 将重组体将重组体导入导入（转化（转化/
2、/转导转导/ /转染）受体细胞转染）受体细胞 细胞扩增和细胞扩增和筛选筛选含有重组体的受体细胞（宿主细胞含有重组体的受体细胞（宿主细胞/ /寄主细胞）寄主细胞） 培养含有重组体的细胞（阳性克隆）培养含有重组体的细胞（阳性克隆）检测检测表达产物表达产物DNA聚合酶聚合酶 DNA Polymerase逆转录酶逆转录酶 Reverse TranscriptaseT4多核苷酸酶多核苷酸酶 T4 Polymerase Kinase碱性磷酸酶碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase活性定义活性定义限制酶的一个活性单位（限制酶的一个活性单位（1U），原则），原则上是在上是在50l的反应液中，的反应
3、液中，37的温的温度条件下，经过度条件下，经过1小时反应，将小时反应，将1gDNA完全分解所需要的酶量。完全分解所需要的酶量。特点特点 识别部位序列一识别部位序列一般为般为4、5或或6个核苷个核苷酸序列；酸序列； 呈双重轴对称。呈双重轴对称。性质性质切断识别部位或其附近特定部切断识别部位或其附近特定部位后，产生两种末端，即位后，产生两种末端，即平齐末端和粘性末端（平齐末端和粘性末端（5突突出端和出端和3突出端）。突出端）。Pst ICTGCAGGACGTCEcoR I3突突出出5突突出出同裂酶同裂酶isoschizomer指来源不同，但有相同识别序列的限制性内切酶。指来源不同，但有相同识别序列
4、的限制性内切酶。 同尾酶同尾酶isocaudamer指识别序列不同，但切割指识别序列不同，但切割DNA后可以产生相同粘端的后可以产生相同粘端的限制性内切酶。限制性内切酶。 DNA连接酶可以催化单链连接酶可以催化单链DNA的连接吗？的连接吗？DNA连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？连接酶可以催化缺少核苷酸的切口的连接吗？主要连接酶的功能特点主要连接酶的功能特点最常用连接酶最常用连接酶T4DNA lingaseE.coli.DNA lingase平齐末端双链平齐末端双链DNA分子的连接分子的连接功能功能有有无无匹配粘性末端双匹配粘性末端双链链DNA分子的连分子的连接功能接功能有有有有辅助因子
5、辅助因子ATPNAD+p载体和插入片段载体和插入片段容易连接成环状的重组容易连接成环状的重组DNADNA分子分子可能出现问题：可能出现问题：载体自身环化载体自身环化，造成假阳性背景克隆；，造成假阳性背景克隆；插入片段可插入片段可双向插入双向插入；插入片段可插入片段可多拷贝插入多拷贝插入。p当当DNADNA片段两端为片段两端为可实现定向克隆可实现定向克隆，连接效率高，简捷，连接效率高，简捷粘性末端连接粘性末端连接可在连接前，用碱可在连接前，用碱性磷酸酶将载体性磷酸酶将载体DNA 5端去磷酸端去磷酸化，这样只有载体化，这样只有载体和插入片段之间才和插入片段之间才能发生连接；能发生连接；利利用用磷磷
6、酸酸酶酶防防止止载载体体DNADNA的的重重新新环环化化。 质粒载体的定向克隆质粒载体的定向克隆基因工程常用工具酶基因工程常用工具酶作作 用用限制性内切酶限制性内切酶识别识别DNA特定序列，切割特定序列，切割DNA链链DNA聚合酶聚合酶I或大片段或大片段Klenow fragment1、切口平移制作标记、切口平移制作标记DNA探针；探针；2、合成、合成cDNA第二第二条链；条链；3、填补双链、填补双链DNA3凹端；凹端；4、DNA序列分析序列分析DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA分子或片断分子或片断Taq DNA聚合酶聚合酶聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）逆转录酶逆转录酶合成合成
7、cDNA第一条链第一条链T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多核苷酸催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 末端加入同质多聚物尾末端加入同质多聚物尾S1核酸酶、绿豆核酸核酸酶、绿豆核酸酶酶降解单链降解单链DNA或或RNA，使双链，使双链DNA突出段变为平端突出段变为平端DNA端酶端酶I降解降解DNA，在双链，在双链DNA上产生随机缺口上产生随机缺口RNA酶酶A降解除降解除RNA磷酸酶磷酸酶切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基 E.coli. DNA聚合酶聚合酶I E.coli. DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段（Klenow fra
8、gment） T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 耐高温耐高温DNA聚合酶：聚合酶： Taq DNA聚合酶聚合酶DNA PolymeraseReverse TranscriptaseAlkalinephosphataseT4 Polymerase Kinase 细菌碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶BAP 牛小肠碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶CIP是能够携带外源是能够携带外源DNA进入宿主细胞进行扩进入宿主细胞进行扩增和表达的增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建而成的。等构建而成的。质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒组
9、 合 载组 合 载体体种种 类类 p能在宿主细胞中独立复制能在宿主细胞中独立复制;p具有多种限制酶的单一切点（多克隆具有多种限制酶的单一切点（多克隆位点）以便外源位点）以便外源DNA插入；插入；p具有筛选标记具有筛选标记,以区别阳性与阴性重组以区别阳性与阴性重组分子分子;p分子较小，便于体外基因操作，同时分子较小，便于体外基因操作，同时载体载体DNA与宿主与宿主DNA便于分离；便于分离；必必要要条条件件具备条件具备条件表达载体表达载体: :具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。加尾信号等基因表达元件。分类分类 克隆载体：克隆载体：以
10、繁殖以繁殖DNADNA为目的的载体，通常为目的的载体，通常分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如分子较小，自我复制能力强，拷贝数高。如pBR322pBR322、pUCpUC、M13M13等。等。穿梭载体：穿梭载体：带有两种复制原点，在原核细胞带有两种复制原点，在原核细胞和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真和真核细胞中都能繁殖的载体，通常用于真核基因的克隆。核基因的克隆。表达载体：表达载体：以获得基因表达产物为目的的载以获得基因表达产物为目的的载体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数体，通常要具有强启动子、结构稳定、拷贝数高和能在宿主细胞中高效表达等特点。高和能在宿主细胞中高效表达等特点。克
11、隆载体的特性克隆载体的特性 复制起始：在受体细胞中独立复制复制起始：在受体细胞中独立复制 多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点多克隆位点：含多个限制性核酸内切酶单一切点 多选择标记：抗药性，其他遗传标记多选择标记：抗药性，其他遗传标记 分子量小：能容纳的外源分子量小：能容纳的外源DNADNA片段尽可能大片段尽可能大 常用克隆载体常用克隆载体 质粒质粒 噬菌体噬菌体 CosmidCosmid 真核病毒真核病毒 YAC, BACYAC, BAC分类分类松弛型松弛型* *独立复制，拷贝数高独立复制，拷贝数高, 10-200个个拷贝拷贝/细胞，例如细胞，例如pUC载体可达载体可达700个个/细胞
12、细胞严紧型严紧型受受体染色体受受体染色体DNA复制控制，拷复制控制，拷贝数低，贝数低，1-几个拷贝几个拷贝/细胞，例如细胞，例如pSC101天然型天然型人工型人工型* *可转移型可转移型不可转移型不可转移型* *氯霉素扩增氯霉素扩增氯霉素可抑制染氯霉素可抑制染色体色体DNADNA复制，但质粒复制不受影复制，但质粒复制不受影响，可增加拷贝数。响，可增加拷贝数。1 1、什么是质粒、什么是质粒? ?2 2、质粒作为基因工程载体的原因、质粒作为基因工程载体的原因? ?3 3、质粒的分类、质粒的分类? ?基因工程使用的质粒的特点基因工程使用的质粒的特点? ?兼容型兼容型非兼容型非兼容型* *克隆载体克隆
13、载体pUC19pUC19质粒图谱质粒图谱克隆载体克隆载体pBR322pBR322质粒图谱质粒图谱用于原核宿主的载体用于原核宿主的载体用于植物宿主的载体用于植物宿主的载体用于动物宿主的载体用于动物宿主的载体逆转录病毒逆转录病毒猿猴空泡病毒猿猴空泡病毒40（SV40）昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒其他动物病毒其他动物病毒质粒质粒噬菌体噬菌体科斯质粒科斯质粒?双链双链DNA50kb线性线性噬菌体噬菌体DNADNA分子的两端各有分子的两端各有1212个碱基的互个碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为补单链序列，是天然的粘性末端，称为。噬菌体经过改造去除中间噬菌体经过改造去除中间非必需部分可以插入大片非必
14、需部分可以插入大片段段DNA分子（约分子（约20Kb）是）是构建基因文库主要载体之构建基因文库主要载体之一。一。噬菌体作为基因工程载噬菌体作为基因工程载体的最主要原因是什么体的最主要原因是什么? ?其它原因呢？其它原因呢？适于克隆适于克隆5-20kb的外的外源基因片段，常用于构建基因组源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。文库。允许插入允许插入5-7kb的外的外源源DNA,适于构建适于构建cDNA文库。如文库。如gt 噬菌体载体。噬菌体载体。噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体切除非必需的中央区切除非必需的中央区增减某些限制性酶切位点增减某些限制性酶切位点插入适当的筛选标记基因插入适当的
15、筛选标记基因噬菌体噬菌体是指含有是指含有噬菌体粘性末端的杂种质粒，由噬菌体粘性末端的杂种质粒，由DNA的的COS区区(约约20-数百数百bp)与质粒重组而与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆制，但不表达任何噬菌体的功能。可以克隆40-50Kb的外源的外源DNA片段。片段。粘粒、柯斯质粒粘粒、柯斯质粒-天然载体系统天然载体系统天然载体系统：天然载体系统：土壤脓杆菌（土壤脓杆菌（Ti质粒）质粒） 发根脓杆菌（发根脓杆菌（Ri质粒）质粒）人工导入技术：人工导入技术：基因枪、高压、激光、基因枪、高压、激光、 人工
16、介导等人工介导等基因导入基因导入土壤脓杆菌土壤脓杆菌植物病原菌植物病原菌Ti质粒感染质粒感染冠瘿瘤冠瘿瘤T-DNAT-DNA特点：特点： 可自发转移，并整合进植物基因组；可自发转移，并整合进植物基因组； 导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成；导致冠瘿瘤形成，控制冠瘿碱合成； 长度长度12-24Kb。Ti质粒的功能组件：质粒的功能组件：T-DNAT-DNA由由Ti质粒衍生出的载体系统质粒衍生出的载体系统人工染色人工染色体载体体载体YACBACPACS酵母人工染色体酵母人工染色体细菌人工染色体细菌人工染色体P P1 1噬菌体衍生出噬菌体衍生出的人工染色体的人工染色体特点特点能容纳能容纳最大外源最大外源D
17、NA片断片断(1000Kb以上以上)拷贝数低，稳定拷贝数低，稳定易分离易分离承载外源承载外源DNA可达可达300Kb承 载 外 源承 载 外 源 D N A 达达300Kb组成组成着丝粒着丝粒(CEN)+端粒端粒(TEL)+自主复制序自主复制序列列(ARS)细菌细菌F F因子因子性质粒性质粒(结构基础结构基础)P1噬菌体噬菌体+BACMAC哺乳动物人工染色体哺乳动物人工染色体主要是结构基因主要是结构基因人工合成基因人工合成基因（化学合成（化学合成/ /酶促合成）酶促合成）构建构建cDNAcDNA文库文库构建基因组文库构建基因组文库PCRPCR扩增扩增cDNAcDNA文库的构建文库的构建提取出组
18、织细胞的全部提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成，在体外反转录成cDNA，与适当的载体，与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体常用噬菌体或质粒载体)连连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息信息的的cDNA克隆集合称为该组织细胞的克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库文库。cDNA和和cDNA文库文库以以mRNA为模板，经反转录酶催化合成为模板，经反转录酶催化合成DNA，则此，则此DNA序列与序列与mRNA互补，称为互补互补，称为互补DNA或或cDNA。分离有目的基因表达的组织
19、或细胞分离有目的基因表达的组织或细胞制备总制备总RNA和分离纯化和分离纯化mRNA 合成合成cDNA第一条链第一条链合成合成cDNA第二条链第二条链双链双链cDNA的修饰的修饰双链双链cDNA与载体的连接与载体的连接cDNA文库的构建过程文库的构建过程制备总制备总RNARNA和和mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化制备总制备总RNA方法：异硫氰酸胍法方法：异硫氰酸胍法 一步热酚法一步热酚法内源内源RNAse的抑制：添加的抑制：添加RNAse抑制剂，抑制剂， 如异硫氰酸胍等。如异硫氰酸胍等。外源外源RNAse的抑制：的抑制：0.05-0.1%DEPC处理用品，处理用品， 如水、枪头、离心管等。如
20、水、枪头、离心管等。关键：抑制关键：抑制RNAse活性活性焦炭酸二乙酯焦炭酸二乙酯亲和层析法亲和层析法 Oligo(dT)-纤维素柱层析纤维素柱层析mRNA的分离纯化的分离纯化模板（模板（mRNA）引物引物逆转录酶逆转录酶底物（底物（dNTP）buffer(Mg2+)合成合成cDNAcDNA第一条链第一条链逆转录过程逆转录过程条件条件自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法引物引物- -衔接头法衔接头法合成合成cDNAcDNA第二条链第二条链方法方法自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法甲基化甲基化加入接头加入接头双链双链cDNAcDNA的修饰的修饰小小 结结 cDNA文库具有文库具有组织细
21、胞特异性组织细胞特异性。 cDNA文库比基因组文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆细胞特异表达的基因。但易从中筛选克隆细胞特异表达的基因。但对真核细对真核细胞来说，从基因组胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同文库获得的不同，基因组，基因组DNA文库所含的是带有内文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。构建构建cDNA文库是真核生物基因克隆的常用方法文库是真核生物基因克隆的常用方
22、法。 克隆克隆cDNA可以了解蛋白质基因的结构及其表达。可以了解蛋白质基因的结构及其表达。 基因组文库基因组文库从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将用物理方法或酶法将DNA降解降解成预期大小的片段，然后将这成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基许多细胞一起组成一个含有基因组各因组各DNA片段
23、克隆的集合体，片段克隆的集合体，就 称 为就 称 为 基 因 组基 因 组 D N A 文 库文 库(genomic DNA library)。原核生物基因的克隆常通过构建基因组文库的方法进行。原核生物基因的克隆常通过构建基因组文库的方法进行。超声波、搅超声波、搅拌剪切力等拌剪切力等限制性内切酶限制性内切酶的不完全酶解的不完全酶解常用噬菌体、常用噬菌体、粘粒或粘粒或YACPCRPCR扩增扩增 原理原理 基本过程基本过程 反应体系的组成反应体系的组成详见实验部分 融合系统和融合蛋白融合系统和融合蛋白优点：防止表达产物被水解优点：防止表达产物被水解 可分泌到体外可分泌到体外缺点：目的蛋白的分离纯化
24、较麻烦缺点：目的蛋白的分离纯化较麻烦 瞬时表达系统与稳定表达系统瞬时表达系统与稳定表达系统目的基因插入宿主某蛋白质的目的基因插入宿主某蛋白质的基因中形成的表达系统。基因中形成的表达系统。融合系统表达的目的基因产融合系统表达的目的基因产物的物的N N端和宿主的蛋白质杂端和宿主的蛋白质杂合在一起形成融合蛋白。合在一起形成融合蛋白。进入宿主的目的进入宿主的目的DNADNA没有和宿主没有和宿主DNADNA整合，随着细胞生长，宿主内目的整合，随着细胞生长，宿主内目的基因的数量递减直至消失，表达过基因的数量递减直至消失，表达过程只能持续数天。程只能持续数天。进入宿主的目的进入宿主的目的DNADNA整整合宿
25、主染色体合宿主染色体DNADNA中稳中稳定遗传。定遗传。制备感受态细胞制备感受态细胞转化处理转化处理正常细胞正常细胞诱导诱导自然转变自然转变感受态细胞感受态细胞氯化钙导入法氯化钙导入法感受态：细胞容易吸收感受态：细胞容易吸收DNADNA分子的能力分子的能力原理：原理： 细胞膜主要成分是磷脂双分子层，外加电细胞膜主要成分是磷脂双分子层，外加电场作用，膜两侧电位差增大，膜变的不稳场作用，膜两侧电位差增大，膜变的不稳定而产生孔隙，使得大小分子可进入细胞定而产生孔隙，使得大小分子可进入细胞内，但此孔隙由于外加电场的移走而得到内，但此孔隙由于外加电场的移走而得到恢复，不会给细胞致命伤害。恢复，不会给细胞
26、致命伤害。电穿孔法（电击法）电穿孔法（电击法）优点：优点：转化效率高转化效率高 细菌细菌109-1010个转化体个转化体/g DNA结合态：结合态：重组体或含有目的基因的部分重组体或含有目的基因的部分载体整合到宿主染色体上，单拷贝，稳定载体整合到宿主染色体上，单拷贝，稳定遗传。遗传。并存态：并存态：重组体独立存在于宿主细胞中，重组体独立存在于宿主细胞中，多拷贝，可克隆基因。多拷贝，可克隆基因。两者兼有两者兼有生物学方法生物学方法核酸杂交核酸杂交物理学方法物理学方法筛选方法筛选方法遗传学方法遗传学方法免疫学方法免疫学方法噬菌斑的形成噬菌斑的形成原位杂交原位杂交SouthernSouthern杂交
27、杂交NorthernNorthern杂交杂交电泳法电泳法插入失活法插入失活法直接筛选法直接筛选法利用抗生素抗性基因筛选利用抗生素抗性基因筛选蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法利用营养缺陷互补筛选利用营养缺陷互补筛选插入失活法插入失活法以以pBR322为例为例, 请思考：请思考： 你还能设计出其它你还能设计出其它的筛选培养基吗？的筛选培养基吗？ 如果用限制酶如果用限制酶BamHIBamHI切割切割pBR322pBR322质粒进行插入失活，质粒进行插入失活，该如何设计筛选培该如何设计筛选培养基养基? ?直接筛选法直接筛选法插入失活重组插入失活重组AmprTets生长受抑制生长受抑制（重组体）（重组体）培养细
28、胞培养细胞Tet和和环丝氨酸环丝氨酸(一个平板一个平板)转化受体细胞转化受体细胞死亡死亡（非重组体）（非重组体）培养细胞培养细胞抑制细胞抑制细胞生长生长掺入蛋白质合掺入蛋白质合成导致细胞死成导致细胞死亡亡蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法- -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应原理原理 M13、pUC、pGEM等系列载体携带有一段大肠等系列载体携带有一段大肠杆菌的基因杆菌的基因LacZ，它编码，它编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的端的146个氨基酸，称为个氨基酸，称为肽肽； 载体的多克隆位点即处在载体的多克隆位点即处在lacZ基因区；基因区； 若多克隆位点处没有插入外源若多克隆位点处没有插入外源DNA片
29、段，片段，当载体转入基因型当载体转入基因型为为LacZM15（lac-）的大肠杆菌中时，质粒携带的）的大肠杆菌中时，质粒携带的lacZ基因基因将正常表达，生成将正常表达，生成肽，肽，与宿主的产物（与宿主的产物（-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端肽链）肽链）互补，形成完整的互补，形成完整的-半乳糖苷酶，宿主细胞才有半乳糖苷酶，宿主细胞才有-半半乳糖苷酶活性，这就是所谓的乳糖苷酶活性，这就是所谓的互补；在存在底物互补；在存在底物X-gal（乳（乳糖替代物）和诱导物糖替代物）和诱导物IPTG的条件下，代谢的条件下，代谢X-gal生成的产物生成的产物为蓝色，即出现为蓝色，即出现蓝色蓝色的菌落。的菌落。
30、如果在多克隆位点处插入了外源如果在多克隆位点处插入了外源DNA片段，将使片段，将使lacZ基因失基因失活，不能生成半乳糖苷酶，则重组克隆形成活，不能生成半乳糖苷酶，则重组克隆形成白色白色菌落。菌落。 请思考？请思考？若转化后的菌落全为蓝色，但通过若转化后的菌落全为蓝色，但通过PCRPCR等等手段检测到有目的手段检测到有目的DNADNA片段的插入，会片段的插入，会有这种情况出现吗？为什么？有这种情况出现吗？为什么？ 可能会出现，但机率可能会出现，但机率较小。较小。 前提条件：插入片断前提条件：插入片断较小，一般几百较小，一般几百bp，片断的插入不破坏片断的插入不破坏LacZ读码框。读码框。 免疫
31、学方法免疫学方法 重组的目的基因可以在受体细胞内表达重组的目的基因可以在受体细胞内表达存在目的蛋白的抗体存在目的蛋白的抗体先决条件先决条件裂解裂解菌落的蛋白裸露出来菌落的蛋白裸露出来转膜转膜菌落印在膜上菌落印在膜上在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落二抗与一抗结合二抗与一抗结合加加一抗一抗一抗与裸露的蛋白质结合一抗与裸露的蛋白质结合洗去游离的一抗，加洗去游离的一抗，加二抗二抗洗去游离的二抗，加洗去游离的二抗，加显色剂显色剂显色显色找出阳性克隆找出阳性克隆原理原理菌落原位杂交菌落原位杂交噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交原位杂交法原位杂交法分类分类带有菌落或噬菌斑的培养基平板带有菌落或噬菌斑的培养基平
32、板原位转印（硝酸纤维素膜）原位转印（硝酸纤维素膜）在膜上裂解菌体，碱变性在膜上裂解菌体，碱变性DNADNA固定固定DNADNA（烘烤（烘烤/ /紫外）紫外）加标记好的探针加标记好的探针洗去多余探针并干燥洗去多余探针并干燥压压X X光片，放射自显影光片，放射自显影洗片洗片查出可能的阳性克隆查出可能的阳性克隆原原 理理原理原理提取受体细胞总提取受体细胞总DNA目的目的DNA分离分离电泳电泳限制酶切割限制酶切割洗片洗片原位转膜（硝酸纤维素膜）原位转膜（硝酸纤维素膜） 在膜上碱变性在膜上碱变性DNA并中和并中和洗膜、压片、放射自显影洗膜、压片、放射自显影加标记好的探针加标记好的探针预杂交预杂交杂交杂交
33、 固定（烘烤固定（烘烤/紫外照射）紫外照射）Southern杂交杂交与原位杂交的区别用于杂交的核酸需经过：分用于杂交的核酸需经过：分离、纯化、限制酶酶解、离、纯化、限制酶酶解、凝胶电泳分离，然后才能凝胶电泳分离，然后才能转移到膜上进行杂交。转移到膜上进行杂交。分子杂交分子杂交杂交杂交水平水平实验目的实验目的探针探针目标目标分子分子实验原理实验原理SouthernSouthern杂交杂交DNADNA证明外源基因整合到证明外源基因整合到宿主染色体宿主染色体DNADNA上上DNADNA/RNA/RNADNADNA互补核酸互补核酸分子之分子之间的氢间的氢键特异键特异性结合性结合反应反应Northern
34、Northern杂交杂交RNARNA证明外源基因整合到证明外源基因整合到宿主染色体宿主染色体DNADNA上，上，并正常转录并正常转录DNADNA/RNA/RNARNARNAWesternWestern杂交杂交蛋白蛋白质质证明外源基因整合到证明外源基因整合到宿主染色体宿主染色体DNADNA上，上，正常转录并翻译出正常转录并翻译出特异性蛋白质特异性蛋白质特异特异性性抗体抗体目标目标蛋白蛋白质质抗原抗原- -抗体抗体免疫学反免疫学反应应主要分子杂交技术比较主要分子杂交技术比较Southern blotNorthern blotWestern blotSNP (single nucleotide po
35、lymorphism) SNP (single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 指基因组指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（序列中由于单个核苷酸（A、T、C、G）的突变而引起的多态性。的突变而引起的多态性。基因组中最简单、最常见基因组中最简单、最常见的多态性类型的多态性类型RFLP RFLP 限制性片段长度多态限制性片段长度多态SSR SSR 微卫星标记微卫星标记SNP SNP 单核苷酸多态性单核苷酸多态性遗传标记技术遗传标记技术突变类型突变类型转换转换颠换颠换C T G AC AG TC GA T2/3嘧啶之间嘧啶之间/ /嘌呤之间嘌呤之间嘧啶
36、和嘌呤之间嘧啶和嘌呤之间基因芯片技术基因芯片技术SNP SNP 检测技术应用检测技术应用是在固相支持介质上进行分子杂交和原位是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量荧光检测的一种高通量SNP分析方法。分析方法。 通过优化芯片杂交程序，使探针只通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有错配与完全互补的序列杂交而不与含有错配碱基的序列杂交。碱基的序列杂交。 待测基因样品经待测基因样品经PCRPCR扩增及荧光化学扩增及荧光化学标记后与固定的探针进行杂交。标记后与固定的探针进行杂交。基因芯片技术对分子生物学研究的重要意义？基因芯片技术对分子生物学研究的重要意义？是蛋白
37、质是蛋白质(protein)(protein)和基因组和基因组(genome)(genome)研究在形式和内容上的完研究在形式和内容上的完美组合。美组合。该技术是研究某一物种、个体、器官、组该技术是研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。全部蛋白质图谱。步骤：步骤： 制备蛋白样品制备蛋白样品 SDS-PAGE分离样品分离样品 分离的蛋白原位印迹到膜上，封闭膜上未反应分离的蛋白原位印迹到膜上，封闭膜上未反应的位点，抑制抗体的非特异性吸附的位点，抑制抗体的非特异性吸附 固定在膜上的蛋白作抗原，与一抗结合固定在膜上的蛋白作抗
38、原，与一抗结合(对应的对应的非标记抗体非标记抗体) 洗去游离一抗，加入二抗洗去游离一抗，加入二抗(酶偶联或放射性同位酶偶联或放射性同位素标记的素标记的)，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分蛋白成分检测样品中是否检测样品中是否存在蛋白抗原存在蛋白抗原免疫印迹免疫印迹法法辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE蛋白质所带电荷以及分子大小和形状蛋白质所带电荷以及分子大小和形状聚丙
39、烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶单体单体交联剂交联剂丙烯酰胺丙烯酰胺ArcArc甲叉基双丙烯酰胺甲叉基双丙烯酰胺BisBis分离依据：分离依据：不连续电泳不连续电泳浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应凝胶层凝胶层缓冲液离子成分缓冲液离子成分pH值值电位梯度电位梯度类型类型Tris-盐酸盐酸凝胶浓度凝胶浓度%凝胶孔径凝胶孔径样品胶样品胶（上）（上）pH=6.73大大浓缩胶浓缩胶（中）（中）pH=6.73大大分离胶分离胶（下）（下）pH=8.97.5小小不连续电泳三层凝胶的性质不连续电泳三层凝胶的性质SDS-PAGE（最常用的）（最常用的）SDS 十二烷基磺（硫）酸钠十二烷基磺（硫）酸钠
40、1%-2%应用：测定蛋白质的分子质量应用：测定蛋白质的分子质量分离依据：分离依据：蛋白质分子的迁移率取决于分子质量蛋白质分子的迁移率取决于分子质量大小，与分子形状及所带电荷无关。大小，与分子形状及所带电荷无关。为什么？为什么？p 当向蛋白质溶液中加入足够量的当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS和巯基乙和巯基乙醇，醇，SDS能破坏蛋白质分子间的共价键能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋，使蛋白质变性而改变原有构象，特别是强还原剂巯白质变性而改变原有构象，特别是强还原剂巯基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而保证蛋白质与从而保证蛋白质与SDS结合形成带负
41、电荷的结合形成带负电荷的蛋蛋白质白质-SDS复合物复合物。p 蛋白质蛋白质-SDS复合物所带的负电荷复合物所带的负电荷的量远远超过的量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差异。蛋白质间原有的电荷差异。p 另外，另外，蛋白质蛋白质-SDS复合物的形状是长椭圆形复合物的形状是长椭圆形，不同蛋白质的不同蛋白质的SDS复合物短轴长度是恒定的，复合物短轴长度是恒定的，约为约为1.8nm，而长轴长度则与蛋白质相对分子，而长轴长度则与蛋白质相对分子质量成正比，质量成正比，p 这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小。因此，决于相对分子质量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白质的子大小的不同将其分开。可以按蛋白质的子大小的不同将其分开。等电聚焦等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)第一向：第一向：依据蛋白质分子质量的不同依据蛋白质分子质量的不同依据蛋白质等电点的不同依据蛋白质等电点的不同第二向：第二向：The End of Chapter 4
