1、一、萃取法 萃取 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。第1页/共120页发展与应用 传统的有机溶剂萃取是石化和冶金工业常用的分离提取技术。 在生物质中，可用于有机酸、氨基酸、抗生素、维生素、激素和生物碱等生物小分子的分离和纯化。 20世纪60年代末以来应用于生物大分子如多肽、蛋白质、核酸等分离纯化的反胶团萃取法。 70年代以来，双水相萃取技术迅速发展，为蛋白质特别是胞内蛋白质的提取纯化提供了有效的手段。 利用超临界流体为萃取剂的超临界流体萃取法的出现，使萃取技术更趋全面，适用于各种物质的分离纯化。第2页/共120页 萃取法根据参与溶质分配的两相物态、性质的不
2、同而分为多种 液固萃取 液液有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界流体萃 各具特点，适用于不同种类物质的分离纯化。第3页/共120页 萃取原理 液-液萃取法即两相溶剂提取，是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的的方法。 简单的萃取过程是将萃取剂加入到样品溶液中，使其充分混合，因某些组分在萃取剂中的平衡浓度高于其在原样品溶液中的浓度。于是这些组分从样品溶液中向萃取剂中扩散，使这些组分与样品溶液中的其他组分分离。第4页/共120页萃取原理分配定律 组分A在两相间的平衡关系可以用平衡常数K来表示： K=CA/CA 式中 CA-组分A在萃取剂中的浓度； CA-组分A在原样品溶
3、液中的浓度。 对于液一液萃取，K通常称为分配系数。可将其近似地看做组分在萃取剂和原样品溶液中的溶解度之比。第5页/共120页 物质在萃取剂和原溶液中的溶解度差别越大，K值越大，萃取分离效果越好。 当K100时，所用萃取剂的体积与原溶液体积大致相等时，一次简单萃取可将99%以上的该物质萃取至萃取剂中，但这种情况往往很少。 K值取决于温度、溶剂和被萃取物的性质，而与组分的最初浓度、组分与溶剂的质量无关。第6页/共120页 萃取过程的分离效果主要表现为被分离物质的萃取率和分离纯度。 萃取率为萃取液中被萃取的物质与原溶液中该物质的溶质的量之比。萃取率越高，表示萃取过程的分离效果越好。 第7页/共120
4、页影响萃取效果的因素 影响分离效果的主要因素包括：萃取剂、被萃取的物质在萃取剂与原样品溶液两相之间的平衡关系(主要表现为被萃取物质在萃取剂与原样品溶液两相中的溶解度差别)、在萃取过程中两相之间的接触情况。在被萃取物质一定的条件下，主要决定于萃取剂的选择和萃取次数。 第8页/共120页萃取溶剂的选择 萃取剂对萃取效果的影响很大，萃取溶剂选择的主要依据是被萃取的物质的性质，相似相溶原理相似相溶原理是萃取剂选择的基本规则。还应考虑： (1)分配系数 (2)密度 (3)界面张力(4)黏度 (5)其他第9页/共120页 (1)分配系数 被分离物质在萃取剂和原溶液之间的分配系数是选择萃取剂首先应考虑的问题
5、(可以根据被分离物质在萃取剂和原溶液中的溶解度来做大致判断)。分配系数K大，表示被萃取组分在萃取相的组成高(被萃取物质在萃取剂中的溶解度大)，萃取剂用量小，溶质容易被萃取出来。 (2)密度 在液一液萃取中两相间应保持一定的密度差，以利于两相的分层。第10页/共120页(3)界面张力 萃取体系的界面张力较大时，细小的液滴比较容易聚集，有利于两相的分离，但界面张力过大，液体不易分散，难以使两相很好地混合；界面张力过小时，液体易分散，但易产生乳化现象使两相难以分离。因此，应从界面张力对两相混合与分层的影响综合考虑，一般不易选择界面张力过小的萃取剂。(4)黏度 萃取剂黏度低，有利于两相的混合与分层，因
6、而黏度低的萃取剂对萃取有利。(5)其他 萃取剂应有良好的化学稳定性，不易分解和聚合。一般选择低沸点溶剂以利于萃取剂容易与溶质分离和回收，且毒性应尽可能低，此外，价格、易燃易爆性、购买难度等都应加以考虑。第11页/共120页常用萃取剂 常用的萃取溶剂有石油醚、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙醚及正丁醇等。 如果在水溶液中的有效成分是不溶于水的亲脂性物质，一般多用亲脂性有机溶刘，如苯、石油醚做萃取剂； 较易溶于水的甾体、黄酮等物质用氯仿、乙醚、二氯甲烷等进行萃取； 偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就用弱亲脂性的溶剂，如乙酸乙酯、丁醇、水饱和的正丁醇等。第12页/共120页 混合溶剂混合溶剂的萃
7、取效果常比单一溶剂好得多，乙醚一苯、氯仿一乙酸乙酯(或四氢呋哺)都是良好的混合溶剂，也可以在氯仿、乙醚中加入适量的乙醇或甲醇制成亲水性较大的混合溶剂来萃取亲水性成分。 一般有机溶剂亲水性越大，与水两相萃取时的效果就越不好，因为亲水性大的有机溶剂能使较多的亲水性杂质伴随而出。 当从水相萃取有机物时，向水溶液中加入无机盐能显著提高萃取效率，这是由于加入无机盐后降低了被提取组分在水中的溶解度，从而使被提取组分在两相的分配系数发生了变化。 对于酸性萃取物常向水溶液中加入硫酸铵，对于中性和碱性物质应向水溶液中加入氯化钠。第13页/共120页 实际应用中常采用一些可以与被萃取物质反应的酸、碱作为萃取剂。
8、例如，用10的碳酸钠水溶液可以将有机羧酸从有机相萃取到水相，而不会使酚性物质转化为溶于水的酚钠，所以酚性物质仍留在有机相。但用5%10的氢氧化钠水溶液可以将羧酸和酚性物质一起萃取到水相，用5%10稀盐酸可以萃取有机氨类。第14页/共120页 萃取次数的影响 利用分配定律。可算出经过N次萃取后在原溶液中某组分的剩余量： Wn=W0KV/(KV十S)n 式中 Wn-经过n次萃取后溶质在原溶液中的剩余量； W0-萃取前化合物的总量； K分配系数； V原溶液的体积； S每次萃取时萃取剂用量； n萃取次数。第15页/共120页 当萃取剂用量一定时，n越大，Wn越小，萃取效果越好，即将全部萃取剂分为多次萃
9、取比一次全部用完萃取效果好。 当萃取总量不变时，萃取次数增加，每次萃取剂的用量就要减小，n5时，n和S这两种因素的影响几乎抵消，再增加萃取次数，Wn变化很小，所以一般同体积溶剂分35次萃取即可。第16页/共120页两相溶剂萃取在操作时的注意事项萃取前先用小试管做预试验，观察萃取后二液相分层现象和萃取效果。如果容易产生乳化，大量萃取时要避免猛烈震摇，可通过延长萃取时间达到萃取效果。检查不同溶剂的萃取效果可以通过薄层色谱法。第17页/共120页 萃取溶液呈碱性时，常出现乳化现象，有时由于在水溶液中有少量轻质沉淀，两相密度接近，两液相部分互溶等都会引起分层不明显或不分层。此时，可以静置时间长一些或加
10、入一些食盐增加水相的密度，使絮状物溶于水中，迫使有机物溶于有机相萃取剂中；或用玻璃棒不断搅拌进行机械破乳；有时由于两相溶剂的比例正好使两相溶剂完全乳化，这是应加入其中一种溶剂改变原来的溶剂比例，然后再进一步破乳。如果上述方法不能将乳化层破坏，在分液时，应将乳化层与萃余相(水层)一起放出，再进行萃取。也可将乳化层单独分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤；或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层，然后再进行萃取处理。第18页/共120页样品水溶液的相对密度最好在1.11.2之间过稀则溶剂用量太大影响操作，并且有效成分的回收率低，过浓则提取不完全。 溶剂与样品水溶液应保持一定的比例
11、，第一次提取时溶剂要多一些，一般为样品溶液的13，以后的用量可以少一点，一般为1/41/5。第19页/共120页一般萃取34次即可，但亲水性成分不易转入有机溶剂层时，需增加萃取次数。具体萃取次数可以通过薄层色谱法来确定。 第20页/共120页萃取容器 微量萃取时用离心试管，萃取后用滴管将萃取相吸出：小量萃取时用分液漏斗，注意上层液体从上口倒出，下层液体由下口经活塞放出；中量萃取可以用适当的下口瓶。用搅拌器搅拌一定时间使两相混合后，静置分层。第21页/共120页双水相萃取 双水相体系 双水相的成相现象实际上是由于亲水高聚物之间的不相容性造成的。绝大多数天然的或合成的亲水性高聚物的水溶液在与第二种
12、亲水性高聚物混合时，超过一定的浓度范围就能产生两相，两种高聚物则分别溶于互不相溶的两相中，形成所谓的“双水相体系”。机理 由于高聚物之间的不相容性，即高聚物分子的空间阻碍作用，使之相互无法渗透，出现分离的倾向。当满足一定的成相条件时，即可分为两相。 近年来，又发现某些高聚物溶液与一些无机盐溶液相混合时，同样会在一定的浓度下形成双水相体系。这就是高聚物无机盐双水相体系。许多研究者仍致力于双水相体系成相机理的研究，现仍无十分成熟的理论。 第22页/共120页 常见于生物产物分离的高聚物高聚物双水相体系有乙二醇(PEG)葡聚糖(dextran)，高聚物无机盐体系有PEG磷酸盐和PEG硫酸盐体系。第2
13、3页/共120页类 型相(I)相()A聚丙烯醇(PPG)聚乙二醇，聚乙烯醇，葡聚糖聚乙二醇(PEG)聚乙烯醇，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮B葡聚糖(dextran)NaCl，Li2SO4C羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基纤维素钠盐D聚乙二醇(PEG)磷酸钾，硫酸铵，硫酸钠聚丙烯醇(PPG)葡萄糖，甘油第24页/共120页 A、D两类聚合物为多元醇、多元糖结构，能使生物大分子稳定，且无毒性，已被许多国家的药典所收录，这两类在生物制品分离中应用较多。 对高聚物一高聚物体系操作比较容易，且变性作用少，界面吸附少；而聚合物一无机盐体系由于高浓度的盐废水不能直接排人生物氧化池，使其可行性受到环保的限制，且某些生物物质
14、会在这类体系中失活。 第25页/共120页影响生物物质在双水相系统中分配的因素主要有： 组成相系统的聚合物种类、结构、平均分子量、浓度； 系统中所加盐的种类、浓度、电荷等； 被分配物质的分子大小、形状、荷电性； 温度、pH等环境因素；第26页/共120页双水相萃取特点 在常用的双水相萃取体系中，各种细胞、噬菌体等的分配系数或大于100，或小于0.01，蛋白质(如各类酶)的分配系数在0.110之间，无机盐的分配系数则一般在1.0左右。这些不同物质分配系数的差异，构成了双水相萃取分离的基础。第27页/共120页主要表面在以下三方面： 双水相萃取的主要分离对象一般是具有生理活性的生物物质。采用一般溶
15、剂萃取的方法可能会造成失活而使收率大幅度下降。双水相体系中水的含量高达7090，组成双水相体系的高聚物PEG、dextran和无机盐等对于生物活性物质如酶、核酸等无毒害，不会造成生理活性的质的失活和变性。有时，有的物质还可能起到稳定和保护生物活性的作用。第28页/共120页 双水相萃取可以直接从含菌体的发酵液或培养液中直接提取所需要的蛋白质。根据不同物质在双水相体系中分配系数的差异，可以在不经破碎的条件下操作，直接提取胞内酶。 双水相萃取的操作与通常的溶剂萃取相似。所用设备可以选用柱式萃取设备、混合澄清槽和离心萃取器等。这一操作便于连续进行、处理量可以较大。第29页/共120页 通常的生产工艺
16、中，从发酵液中分离酶一般采用加入大量(NH4)2CO3使酶盐析出来的方法。此后，连同菌体和其他固体物一起过滤，滤饼加热烘干制成酶粉。这类工艺不仅过滤速率慢、效率低，而且失活也比较严重，所制得的酶制剂为含菌体、盐类及其固体的粗制酶，总收率一般在75%左右。 目前采用双水相萃取分离纯化酶，纯化系数(组分在两相中浓度比值之比)为18左右，收率在90以上，优点十分明显。第30页/共120页第31页/共120页 双水相萃取技术在生物工程产物的分离中具有特殊的优势。 双水相萃取技术仍处于开发研究阶段。新的萃取体系、最佳的工艺条件、体系的分相技术以及相应的设备研究等都有待于进一步加以解决。 在生物工程的下游
17、工程中，双水相萃取技术将不断地展示出它的应用前景。第32页/共120页沉淀分离法沉淀分离法 概述 沉淀分离法是在样品溶液中加入某些溶剂或沉淀剂，通过化学反应或者改变溶液的pH值、温度等，使分离物质以固相物质形式沉淀析出的一种方法。 通过沉淀分离可使有效成分成为沉淀析出或使杂质成为沉淀除去。能否将物质从溶液中析出，取决于分离物质的溶解度或溶度积，需要选择适当的沉淀剂和沉淀条件。第33页/共120页在应用沉淀法进行分离时，要考虑以下3种因素： 沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，才能使目标成分得到较好分离； 对于一些活性物质(如酶、蛋白质等)的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是
18、否破坏； 对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离，必须考虑残留物对人体的危害。第34页/共120页 根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀法大致可以分为： 溶剂沉淀法 沉淀剂沉淀法 盐析沉淀法第35页/共120页基本原理相似相溶的溶解性规律。根据相似相溶的溶解性规律，化合物在不同溶剂中的溶解度是不同的，据此可以向样品溶液中加入某种试剂，使一些物质的溶解度显著降低而沉淀析出。第36页/共120页对于水溶性的多糖、鞣质、酶、蛋白质等，向其水溶液中加入丙酮、乙醇等有机溶剂就可以使它们沉淀析出。例如果胶生产中所用的“水溶醇沉”工艺是用乙醇作沉淀剂把果胶从水溶液中沉淀出来，丹参注射液生产中所用的“水溶醇沉”是用
19、乙醇作沉淀剂把鞣质、多糖等杂质从水溶液中沉淀出来。第37页/共120页 当用醇水提取叶类植物有效成分时，往往有大量的叶绿素被提取出来，一种除去叶绿素的方法是利用叶绿素不溶于水的特点，把浸提液浓缩回收乙醇后的水溶液放置在冰箱中静置使叶绿素沉淀析出。第38页/共120页溶剂沉淀法的影响因素如下。(1)溶剂的种类 选择合适的有机溶剂是溶剂沉淀的关键，溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、石油醚、四氢呋喃等，其中乙醇最常用。选择沉淀剂的规则是相似相溶的溶解性规律和溶度积规则，可以通过小试验来选择合适的沉淀剂。选择沉淀剂时还要考虑沉淀剂的毒性、价格等因素。第39页/共1
20、20页(2)样品的浓度 样品浓度影响沉淀的分离效果，样品浓度高，沉淀完全，但样品浓度过高时，虽然能使使要沉淀的物质沉淀完全，但同时往往会发生共沉淀或包裹现象，使杂质也有一部分析出。样品浓度过稀时，用沉淀剂量过大，沉淀析出不彻底，同样分离效果不理想。第40页/共120页(3)温度 一般情况下物质的溶解度随温度降低而降低因此低温往往有利于沉淀析出，有时可以把要沉淀分离的物质在冰箱中放置。使沉淀析出更完全：有时还可以利用不同物质在不同温度下溶解度的差别，通过温度的调节达到分离的目的。如可以利用温度差进行蛋白质的分级沉淀。第41页/共120页(4)pH值 有些物质的溶解度受pH值影响较大在选择沉淀条件
21、时也要把pH值这个因素考虑进去。如蛋白质的沉淀往往需要控制pH值。 第42页/共120页 水提醇沉法和醇提水沉法 水提醇沉法的特点 传统中药大多是水煎口服。因此，水自然成为中药提取的最主要溶剂。水提醇沉法是先以水为溶剂提取中药成分，再以乙醇沉淀去除提取液中杂质的方法，从20世纪50年代开始，至今仍然是中药制药工业中广泛应用的工艺。相对而言，醇提水沉法则较少应用。第43页/共120页 水提醇沉法的特点在于：(1)水作溶剂，经济易得，极性大，溶解范围广，传统中药均用水煎，因此水提符合中医用药特点且能够保持中药药效成分；乙醇既能溶解水溶性成分，又能溶解非极性溶剂所能溶解的成分且通过调节醇浓度，可以选
22、择性地溶解或沉淀某些无效成分或杂质。第44页/共120页(2)中药中的化学成分复杂多样，其中，生物碱、萜类、甾体、苷类、黄酮类、蒽醌、香豆素、有机酸、氨基酸、单糖、低聚糖、多聚糖、蛋白质、酶、鞣质等物质被认为具有药理活性，而纤维素、蜡质、油脂、树脂等被视为无生理活性的杂质。水的浸出范围广，但选择性差，容易浸出大量的无效成分，一般提取液体积大，有效成分含量低，不利于制剂，醇沉可以除去某些杂质，达到精制、减小剂量、便于制剂的目的。第45页/共120页(3)乙醇沸点适中(78)，可回收反复使用，本身还具有杀菌作用，经过乙醇处理的物料不易发霉变质。第46页/共120页 水提醇沉法易造成有效成分损失，存
23、在较多问题。 主要缺点有：成品稳定性较差，尤其是液体制剂较易产生沉淀；总固体物及有效成分损失严重，难以保证成品制剂的有效性，不仅多糖、氨基酸等不溶于醇的物质可被除去，而且生物碱、苷类、黄酮等醇溶性物也会不同程度地被除去；成本高，损耗大量乙醇，能耗高，须配备专用乙醇回收设备；生产周期长。第47页/共120页 水提醇沉法的基本原理是：利用中药中的大多数成分如生物碱盐、苷类、有机酸类、氨基酸、多糖等易溶于水和醇的特性，用水提出，并将其提取液浓缩，加入适当的乙醇反复数次沉降，除去其不溶物质，最后得到澄明液体。 第48页/共120页不同浓度的乙醇沉淀的物质乙醇浓度()可沉淀的物质5060淀粉等75蛋白质
24、等80蛋白质、多糖、无机盐等第49页/共120页 醇提水沉法 乙醇是最常用的有机溶剂，具有溶解性好，对植物细胞穿透能力强的特点。除了蛋白质、粘液质、果胶和部分多糖外，大部分有机化合物都能溶解于乙醇中，同时，还可以根据被提取物质的性质，用不同浓度的乙醇提取。第50页/共120页 醇提水沉法是将药材用乙醇提取，回收乙醇后，加水沉淀。 其基本原理与操作大致与水提醇沉法相同，不同之处是乙醇提取可减少粘液质、淀粉、蛋白质等杂质的浸出，同时在乙醇中溶解度大而在水中溶解度小的杂质则可沉淀除去。第51页/共120页乙醇浓度与相关成分提取的关系乙醇浓度()能提出的成分90挥发油，树脂7080生物碱盐及部分生物碱
25、6070苷类45鞣质2035水溶性成分第52页/共120页水提醇沉法工艺流程第53页/共120页 水提醇沉法工艺要点水提醇沉法工艺要点 水提醇沉工艺实际上包含了水提取分离和加醇沉淀精制两个过程。工作中常以主要成分或浸膏得率为指标分别对这两个过程的工艺参数进行优选。第54页/共120页 影响因素主要有： 提取时间、次数、加水量、浓缩液的密度、pH、醇沉浓度等。 由于乙醇浓度决定了各种成分的溶解度，因此尤以醇沉浓度最为重要。醇提水沉法与之类似。第55页/共120页1加醇量的计算加醇量的计算 调节药液含醇量时，只能将计算量的乙醇加入药液，而不能用醇度计直接在含醇的药液中测量其含醇量。第56页/共12
26、0页2加醇方式加醇方式 (1)应将乙醇慢慢加入，边加边搅拌，使含醇量逐步提高，既能加速蛋白质、多糖类等的沉淀速度，促进沉淀完全，又能使有效成分迅速溶解，不被沉淀包裹。 (2)加醇的次数及所要达到的醇浓度应根据具体情况运用，基本原则是醇浓度由低到高逐步增加。分次醇沉，每次回收乙醇后再加乙醇至拟定量是最常用的方法，该法生产周期长，乙醇用量大；在每次加醇放置后滤过，不回收乙醇，仅在最后一次沉淀滤过后回收乙醇的方法，生产周期短，操作较方便，且可节省乙醇用量。 (3)加醇时药液温度不能太高，加至所需含醇量后，密闭，以防挥发，5-10冷藏1224h。第57页/共120页3药液浓度药液浓度 水提取液经浓缩后
27、再加醇沉淀可以减少乙醇的用量，使沉淀完全。 但药液浓度太大，粘稠度高，乙醇与药液难以充分接触，有效成分难以充分溶解，容易导致成分损失。 药液浓度太低，则需耗费大量的乙醇，延长工序时间，消耗更多能源。第58页/共120页 经验表明：醇沉药液浓度在1：1至1：2之间较适宜。浓缩最好采用减压低温，以避免药效成分的破坏；浓缩前后可调节pH，以保留更多的有效成分。 醇沉后的液体制剂易产生沉淀，致使药效降低，生产周期长，能耗高，对设备及安全性要求高。第59页/共120页4、生产设备、生产设备 水提醇沉法可以分为水提取和醇沉淀两个单元操作，多功能提取罐是提取的常用设备(也可以进行醇提)，适于中药的常压、减压
28、、加压水煎，温浸，渗漉，热回流，芳香油提取及有机溶剂回收等操作。第60页/共120页第61页/共120页5、应用实例、应用实例 中药复方I号是由鹿角、淫羊藿、山茱萸等六味中药组成的复方，临床应用时用汤剂，为了改革剂型，更好地发挥疗效，用水提醇沉法对该方的提取工艺进行了研究。 方案的初步试验：鹿角为特殊药材，且是方中君药，临床应用时与其余五味植物药共煎。为比较鹿角与其余五味植物药混煎和分煎的差异，选择淫羊藿苷作为指标并先设计了4种方案，即A：水提(植物药)；B：水提醇沉(植物药)；C：70醇提(植物药)；D：全方共煎(植物药+鹿角)。加10倍量水，提取3次，时间分别为2h、1.5h、15h，之后
29、合并提取液，回收乙醇，减压干燥，得干浸膏，称重并用HPLC法测定淫羊藿苷的含量，结果见表复方I号不同提取方案的比较 第62页/共120页复方I号不同提取方案的比较指标ABCD干膏量（g）26.320.225.724.1淫羊藿苷含量(%)1.131.521.190.889淫羊藿苷(g)0.2970.3070.3060.214第63页/共120页 由此可见，全方共煎，淫羊藿苷提取量最低，植物药用A、B、C 3种方案，淫羊藿苷提取量无显著差别，考虑到水提醇沉能更多地清除无效成分，因此拟将鹿角另煎，其余用水提醇沉法。 第64页/共120页 由此可见，全方共煎，淫羊藿苷提取量最低，植物药用A、B、C 3
30、种方案，淫羊藿苷提取量无显著差别，考虑到水提醇沉能更多地清除无效成分，因此拟将鹿角另煎，其余用水提醇沉法(表35)。 设计优选提取工艺：选择L9(34)正交表设计淫羊藿、山茱萸等五味植物药的提取工艺。第65页/共120页5复方I号提取因素水平 因素加水量煎煮时间煎煮次数水平1先14倍量后12倍量23水平2先12倍量后10倍量1.52水平3先10倍量后8倍量11第66页/共120页复方I号提取正交试验结果分析 试验号ABCD(空白)干浸膏量(g) 淫羊藿苷(mg/g)综合评分1111120.49.4329.832122219.329.5928.913133314.589.1327.7142123
31、20.028.1328.155223114.317.9222.236231221.3112.533.817313213.744.9118.658321320.946.0126.959332118.877.3926.26K186.4576.6390.5978.32K284.1978.0983.3281.37K371.8683.7864.5982.81K1/327.4825.5430.2026.11K2/328.0626.0327.7727.12K3/323.9627.9321.5327.60R4.112.398.671.49第67页/共120页 例4茯苓多糖的提取 根据多糖在水和醇中溶解性的差异
32、可以利用水提醇沉法使多糖沉淀出来予以分离。茯苓多糖具有抑制肿瘤生长，调节机体免疫等功能。李俊等3用水提醇沉法从茯苓中提取了茯苓多糖。 提取：取茯苓500g，切成碎片，加46倍量水，回流提取3次，时间分别为3h，2h，lh。合并3次提取液，滤过，得2000ml滤液。取600ml减压蒸馏浓缩成76ml，在搅拌下加入乙醇，使含醇量达到80，静置12h，离心，收集沉淀，加蒸馏水60ml溶解煮沸，趁热滤除不溶物，滤液在搅拌下再加入乙醇，使含醇量达到80，放置，析出褐色沉淀后，低温干燥，得茯苓多糖粗品。第68页/共120页 精制：将粗品溶于150mL蒸馏水中，煮沸，在搅拌下加入1鞣酸溶液，煮沸，离心，取上
33、清液加入鞣酸溶液至不混浊为止。加入2活性炭，搅拌10min，趁热滤过，滤液冷却，加醇至70，静置24h，滤过得沉淀物，用70乙醇洗涤至不含鞣酸为止。将湿品溶于583mL的20的热乙醇中，置于有50g中性氧化铝的漏斗中，减压后加入60的热蒸馏水连续洗脱，流出液减压浓缩成62.5mL，加乙醇至70，放置，滤过，取沉淀，干燥得纯品。 第69页/共120页沉淀剂沉淀法 添加某种化合物与溶液中待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法，称为沉淀剂沉淀法。 沉淀剂沉淀法所依据的原理是溶度积规则。 沉淀剂沉淀法有：金属离子沉淀法(如铅盐沉淀法)、阴离子沉淀法、非离子型聚合物沉淀法和均相沉淀法等
34、。第70页/共120页 1铅盐沉淀法 铅盐沉淀法是分离植物成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种植物化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，可以与其他成分分离。 中性醋酸铅可以与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐，常用于沉淀有机酸、氨基酸、黏液质、鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮、果胶等。 碱式醋酸铅沉淀范围更广。第71页/共120页 通常在中草药的水或醇提取液中先加入醋酸铅浓溶液，静置后滤出沉淀，并将沉淀洗液并入滤液，再向滤液中加入碱式醋酸铅饱和溶液至不发生沉淀为止，这样就可以把原混合物分成醋酸铅沉淀、碱式醋酸铅沉淀和母液三部分，达到部位分离的目的。第72页/共120
35、页 脱铅方法可以用硫化氢、硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等。硫化氢法是将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使铅盐分解并转化为硫化铅而沉淀，达到除铅的目的。但硫酸铅、磷酸铅在水中仍有一定的溶解度，除铅不彻底。第73页/共120页2均相沉淀法 均相沉淀法是通过在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂，使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂，进而均匀地产生沉淀的方法。 直接将沉淀剂加入溶液中，容易出现局部浓度过高，产生的沉淀物过于细小或结构疏松，均匀不一，易吸附杂质影响纯度，而借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂，容易获得较纯净的沉淀。例如利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化，使pH值达到一定
36、值时就会生成沉淀。第74页/共120页盐析法 盐析法是在中草药的水提取液中加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中溶解度降低而沉淀析出，达到与水溶性杂质分离的目的。 常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。第75页/共120页 例如中草药三七的水提液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷即可沉淀析出。有些成分如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，往往在水提液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取，以提高萃取率。第76页/共120页结晶结晶 固体有机物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高溶解度增大。若把固体物质溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液
37、变成过饱和而析出结晶。 结晶是提纯固体化合物的一种重要方法，它适用于产品与杂质性质差别较大，产品中杂质含量小于5的体系。第77页/共120页 一般地讲，一个固体达到了一定的纯度，在一定条件下，就会出现结晶。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从过饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤出去)从而达到提纯目的。 一般能结晶的物质大部分是比较纯的化合物，有时结晶也是混合物，即使这样，也还是可以和不结晶的部分分开。第78页/共120页定义 从不是结晶状物质处理到结晶状物质，叫结晶。 从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶称为重结晶。第79页/共120页 在植
38、物提取分离时，有时找到合适的溶剂进行提取，提取液稍一浓缩就有结晶析出。 例如用乙醇从橘络中回流提取橙皮苷，在连续回流提取时就有橙皮苷结晶析出。但一般提取所得到的往往是糖浆状、半固体或固体粉末，所以从粗产物直接结晶是不适宜的，必须先采用其他方法进行初步提纯，例如萃取、水蒸气蒸馏、减压蒸馏等，然后再用结晶提纯。第80页/共120页 应用结晶法提纯有机化合物是利用要提纯分离的化合物与其他化合物在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系不同，使要提纯分离的化合物从其粗品混合物中分离出来。 结晶法分离精制的关键是正确选择溶剂和选择溶剂和结晶的条件。结晶的条件。第81页/共120页结晶条件 (1)有效成
39、分在欲结晶的混合物中的含量 一般来说，含量越高越易结晶，有的化合物需要比较单纯时才能结晶；有的虽含量不高，但如果条件选择得当，也可以得到结晶。 (2)合适的溶剂条件 有时化合物含量很高，因溶剂选择不当，也得不到结晶；有时含量不高，因选择了合适的溶剂，也能得到结晶，因此合适的溶剂很重要。如果结晶所用溶剂为单一溶剂，通常需要的溶剂对要结晶化合物的溶解度不能小，也不能太大。第82页/共120页(3)要结晶的化合物在所选溶剂中的浓度 一般来讲，浓度高些容易结晶；但浓度过高时，相应的杂质的浓度或溶液的黏度也增大，有时反而阻止结晶的析出。 实际工作中有时将较稀的溶液放置，到溶剂自然挥发到适当的浓度和黏度，
40、即能析出结晶。第83页/共120页 (4)合适的温度和时间 一般温度低些较好，有时在室温下不能结晶时，可以放置在冰箱或阴凉处。而且结晶的形成常需要较长时间，因此经常需要放置，甚至有时需要放置35天或更长时间。 (5)制备衍生物 某些化合物即使很纯，也不易结晶，而其盐或乙酰衍生物(如含一OH等基团化合物)等却易于结晶。这样可以先把要结晶的物质制备成衍生物再结晶，得到结晶后再还原。第84页/共120页结晶溶剂的选择 在进行结晶时，选择理想的溶剂是一个关键，理想的溶剂必须具备下列条件。 不与被提纯物质起化学反应。 选择性好 被提纯物质在溶剂中的溶解度对温度有较强的依赖性，温度升高，溶解度较大；在较低
41、的温度(如室温)下，被提纯物质溶解度较小。 I第85页/共120页 其他杂质在溶剂中的溶解度对温度的依赖性小，对杂质的溶解度非常大或非常小(前一种情况是使杂质留在母液中不随提纯物晶体一同析出，后一种情况是使杂质在热过滤时被除去)。 溶剂易于回收。通常溶剂的回收精制采用精馏方法，因此溶剂的沸点应相对较低，易于结晶分离出去，一般要求溶剂的沸点低于结晶的沸点。第86页/共120页 所选溶剂应使被提纯物质容易成核。生成的晶体应较完善，结晶产品的纯度高，以利于固液分离，因此所选溶剂的黏度要小，能给出较好的结晶。 同一种化合物在不同的溶剂中所得结晶的形状不同，在几种溶剂同样合适时，则应根据结晶的回收率、结
42、晶的形状、操作的难易、溶剂的毒性、易燃性和价格来选择。第87页/共120页 溶剂的选择先通过查阅文献，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶条件。一般来说，生物碱可溶于苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯和丙酮，苷类溶于各种醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等，氨基酸常用甲醇或乙醇来结晶等。 如果在文献中找不到合适的溶剂，可根据要结晶化合物的极性大小，利用相似相溶的溶解度规则，通过实验选择溶剂。第88页/共120页 取0.1g的产物放入一支试管中，滴入1mL溶剂，震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合作此产物重结晶的溶剂；若加热至沸腾还不溶解，可补加溶剂，当溶剂量大于4mL产物
43、仍不溶解时，则说明此溶剂也不适宜。如所选择的溶剂能在14mL溶剂沸腾的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多晶体，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。第89页/共120页 实验中应同时选用几种溶剂进行比较。有时很难选择到一种较为理想的单一溶剂，这时应考虑使用混合溶剂。 结晶和重结晶常用的混合溶剂 水-乙醇、甲醇-水、 石油醚-苯、氯仿-醇 、苯- 无水乙醇、水-丙醇、 甲醇-乙醚、 石油醚-丙酮、 乙醇-乙醚-乙酸乙酯、苯-环己烷、水-乙酸 、甲醇-二氯乙烷、氯仿-醚 乙醚-丙酮、丙酮-水第90页/共120页结晶的操作步骤1、制备提纯物的饱和液 这是结晶操作过程中的关键步骤。其目的是用溶
44、剂充分分散产物和杂质，以利于分离提纯。 一般用锥形瓶或圆底烧瓶来溶解固体。若溶剂易燃(不能用明火加热)或有毒时，应装回流冷凝器。加入沸石和已称量好的粗产品，先加少量溶剂，然后加热使溶液沸腾或接近沸腾，边滴加溶剂边观察固体溶解情况，使固体刚好完全溶解，停止滴加溶剂，记录溶剂用量。再加入20左右的过量溶剂，主要是为了避免溶剂挥发和热过滤时因温度降低，使晶体过早地在滤纸上析出造成产品损失。第91页/共120页 溶剂用量不宜太多，否则会造晶体析出太少或根本不析出，此时，应将多余的溶剂蒸发掉，再结晶冷却。有时，总有少量固体不能溶解，应将热溶液倒出或过滤，在剩余物中再加入溶剂，观察是否能溶解，如加热后缓慢
45、溶解，说明此产品需要加热较长时间才能全部溶解。如仍不溶解，则视为杂质去除。第92页/共120页2、脱色 粗产品中常有一些有色杂质不能被溶液去除，因此，需要用脱色剂来脱色。最常用的脱色剂是活性炭，它是一种多孔物质，可以吸附色素和树脂状杂质，但同时它也可以吸附产品，因此加入量不宜太多，所加活性炭的量，视杂质多少而定，一般为粗产品质量的1%-5。第93页/共120页 具体方法：待上述热的饱和溶液稍冷却后，加入适量的活性炭摇动，使其均匀分布在溶液中。加热煮沸510min即可。注意!千万不能在沸腾或近沸的热溶液中加入活性炭，否则会引起暴沸，使溶液冲出容器造成产品损失。在非极性溶剂如苯、石油醚中，活性炭脱
46、色效果不好，可试用其他方法如氧化铝吸附脱色。 第94页/共120页3热过滤 其目的是去除不溶性杂质。为了尽量减少过滤过程中晶体的损失。操作时应做到：仪器热(将所有的仪器用烘箱或气流烘干器烘热待用)、溶液热、动作快。热过滤有两种方法，即常压热过滤(重力过滤)和减压热过滤(抽滤)。 第95页/共120页 减压热过滤装置与减压过滤装置相同。操作时在进行减压热过滤之前。要把布氏漏斗和抽滤瓶烘热，在布氏漏斗中放置一张大小与布氏漏斗底部恰好一样的滤纸，先用热溶剂将滤纸润湿抽真空使滤纸与漏斗底部贴紧。然后迅速将热溶液倒入布氏漏斗中，真空度不宜太高，以防溶剂损失过多。停止抽滤时，先打开缓冲瓶上的活塞使之与大气
47、相通，再关泵，以免发生倒吸现象。 第96页/共120页 减压热过滤的优点是过滤快，缺点是当用沸点低的溶剂时，因减压会使热溶剂蒸发沸腾，导致溶液浓度变大，晶体过早析出。 热过滤时动作要快，以免液体或仪器冷却后，晶体过早地在漏斗中析出，如发现此现象，应用少量热溶剂洗涤，使晶体溶解进入到滤液中。如果晶体在漏斗中析出太多，应加热溶解再进行热过滤。第97页/共120页4、冷却结晶 冷却结晶是使产物重新形成晶体的过程。其目的是进一步与溶解在溶剂中的杂质分离。将上述热的饱和溶液冷却后，晶体可以析出。当冷却条件不同时，晶体析出的情况也不同。为了得到形状好，纯度高的晶体。在结晶析出的过程中应注意以下几点。 第9
48、8页/共120页 应在室温下慢慢冷却至有固体出现，再用冷水或冰进行冷却，这样可以保证晶体形状好，颗粒大小均匀，晶体内不含有杂质和溶剂。否则，当冷却太快时会使晶体颗粒太小，晶体表面会从液体中吸附更多的杂质，加大洗涤难度。当冷却太慢时，晶体颗粒有时太大(超过2mm)，会将溶液夹带在里边，给干燥带来一定的困难。因此，控制好冷却速度是晶体析出的关键。第99页/共120页 在冷却结晶过程中，不宜剧烈摇动或搅拌，这样会造成晶体颗粒太小。当晶体颗粒超过2mm时，可稍微摇动或搅拌几下，使晶体颗粒大小趋于平均。 有时滤液已冷却，但晶体还未出现，可用玻璃棒摩擦瓶壁促成晶体形成，或取少量溶液，使溶剂挥发得到晶体，再
49、将该晶体作为晶种加入到原溶液中，液体中一旦有了晶种或晶核，晶体将会逐渐析出。晶种的加入量不宜过多，而且加入后不要搅动，以免晶体析出太快，影响产品的纯度。 第100页/共120页 有时从溶液中析出的是油状物，此时，更深一步的冷却可以使油状物成为晶体析出，但含杂质较多。应重新加热溶解，然后慢慢冷却，当油状物析出时，剧烈搅拌可使油状物在均匀分散的条件下固化，如还是不能固化则需要更换溶剂或改变溶剂用量。再进行结晶。 对于在常温难于结晶的物质，可以把溶液放在冰箱中冷却，使晶体析出。第101页/共120页 5抽滤-真空过滤 抽滤的目的是将留在溶剂(母液)中的可溶性杂质与晶体(产品)彻底分离。其优点是：过滤
50、和洗涤速度快，固体与液体分离的比较完全固体容易干燥。 抽滤装置采用减压过滤装置。具体操作与减压热过滤大致相同。所不同的是仪器和液体都应该是冷的，所收集的是固体而不是液体。第102页/共120页 在晶体抽滤过程中应注意以下几点。 转移瓶中的残留晶体时，应用母液转移，不能用新的溶剂转移以防溶剂将晶体溶解造成产品损失。用母液转移的次数和每次母液的用量都不宜太多。一般23次即可。 晶体全部转移至漏斗中后，为了将固体中的母液尽量抽干，可用玻璃钉或瓶塞挤压晶体。当母液抽干后，将安全瓶上的活塞打开使之与大气相通向布氏漏斗中加入少量溶剂洗涤晶体，再将溶剂抽干同时进行挤压。这样反复23次，将晶体吸附的杂质洗干净
