1、二、尿激酶原的研究历史二、尿激酶原的研究历史1973 1973 年年BernikBernik从组织培养液中发现尿激酶原。从组织培养液中发现尿激酶原。1970 1970 年代末到年代末到19801980年代初人们先后从新鲜人年代初人们先后从新鲜人 尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中 纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。三、国内研究概况三、国内研究概况 七五期间，北京大学、南京大学七五期间，北京大学、南京大学和军事医学科学院生物工程研究所开始和军事医学科学院生物工程研究所开始研究重组人尿激酶原，都得到国家科技研究重组人尿激酶原，都得
2、到国家科技部部 863 863 委员会的资助。我所率先获委员会的资助。我所率先获得全长人尿酶原基因得全长人尿酶原基因cDNAcDNA克隆，接着克隆，接着又构建出高产工程细胞株。并于八五又构建出高产工程细胞株。并于八五中期和九五期间完成了重组尿激中期和九五期间完成了重组尿激酶原的中试工艺研究和临床前安全评价，酶原的中试工艺研究和临床前安全评价，于于20012001年完成年完成期临床试验。期临床试验。五、五、pro-UKpro-UK的化学结构的化学结构 pro-UKpro-UK由由411411个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的单链多肽（简称单链多肽（简称pro-UKpro-UK），分子量约），分
3、子量约为为49KD49KD左右，在左右，在302302位天冬酰胺残基有位天冬酰胺残基有一个糖链，分子量约一个糖链，分子量约2320Da2320Da，由岩藻，由岩藻糖、甘露糖、半乳糖和糖、甘露糖、半乳糖和N-N-乙酰乙酰- -葡萄糖葡萄糖胺组成，在第胺组成，在第1818位苏氨酸残基上有一位苏氨酸残基上有一个糖基个糖基岩藻糖，分子量岩藻糖，分子量180Da180Da。其一。其一级结构如下图所示：级结构如下图所示： 尿激酶原的结构尿激酶原的结构 Pro-UKPro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有1212对二硫键。对二硫键。pro-UKpro-UK分子按结构功能可分为四个
4、分子按结构功能可分为四个结构域，依次为：结构域，依次为：（1 1）表皮生长因子结构域）表皮生长因子结构域( (第第5-495-49位氨基酸残位氨基酸残基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促进进pro-UKpro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键，的生物合成有关，该区有三对二硫键，即在即在1111与与1919、1313与与3131、3333与与4242氨基酸残基之间氨基酸残基之间各有一对二硫键；各有一对二硫键；（2 2）KringleKringle（指环）结构域（第（指环）结构域（第50-13650-136位氨位氨基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞
5、膜蛋基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋白结合有关，该区也有三对二硫键，即白结合有关，该区也有三对二硫键，即 50 50 与与130130、7171与与113113、102102与与126126氨基酸残基之间各有氨基酸残基之间各有一对二硫键；一对二硫键； （3 3）丝氨酸蛋白酶结构域）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411(144-411位氨位氨基酸残基基酸残基),),位于其羧基端的位于其羧基端的HisHis204204、AspAsp255255与与SerSer356 356 三个氨基酸残基构成该酶的活性三个氨基酸残基构成该酶的活性中心，中心，Asn302 Asn302 为糖化位点为糖化位点,
6、 , 该区共有该区共有5 5对对二硫键，即在二硫键，即在 148-279148-279、189-205189-205、197 -197 -268268、293-258293-258和和368-380368-380氨基酸残基之间氨基酸残基之间各有一对二硫键；各有一对二硫键；（4 4）连接区）连接区( (第第136-143136-143位氨基酸残基位氨基酸残基) )。 六、六、pro-UKpro-UK的理化性质的理化性质 pro-UKpro-UK分子有四个酶切位点：分子有四个酶切位点： （1 1）第一个酶切位点在）第一个酶切位点在158158位赖氨酸与位赖氨酸与159159位异亮氨酸之间，纤溶酶、
7、激肽释位异亮氨酸之间，纤溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶和半胱氨酸内肽酶及因放酶、胰蛋白酶和半胱氨酸内肽酶及因子子 可水解该酶切位点之间的肽键。可水解该酶切位点之间的肽键。该位点被切开后，该位点被切开后，148148位与位与279279位的二硫位的二硫键将键将A A链和链和B B链相连接，链相连接，A A链链C C末端的赖氨末端的赖氨酸自动脱落，酸自动脱落，pro-UKpro-UK即变成具有高度催即变成具有高度催化活性的双链尿激酶化活性的双链尿激酶(UK)(UK)； （2 2） 第二个酶切位点在第二个酶切位点在135135和和136136两个赖两个赖氨酸之间，高分子双链氨酸之间，高分子双链UKUK可
8、被纤溶酶继续可被纤溶酶继续水解该酶切位点，并脱去水解该酶切位点，并脱去N-N-末端的第末端的第 136136位赖氨酸，变成低分子双链位赖氨酸，变成低分子双链UKUK，分子量为，分子量为33KD33KD，其活性与高分子，其活性与高分子UKUK相同；相同；（3 3）第三个酶切位点在）第三个酶切位点在 143 143 位谷氨酸与位谷氨酸与144 144 位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键产生分子量为产生分子量为32KD32KD的单链低分子尿激酶原的单链低分子尿激酶原(pro-UK)(pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分，其溶血栓活性生花特性与高分子子pro-UKp
9、ro-UK相似；相似； （4 4）第四个酶切位点在）第四个酶切位点在156156位的精氨酸与位的精氨酸与157157位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽位的苯丙氨酸之间，凝血酶可水解该位点的肽键，生成双链键，生成双链pro-UKpro-UK，由，由148148位与位与279279位的二硫位的二硫键将键将A A、B B两条链相连接起来，其活性只有双链两条链相连接起来，其活性只有双链UKUK的的1/5001/500，但其催化活性与生化特性与单链，但其催化活性与生化特性与单链pro-UKpro-UK相似。纤溶酶可水解相似。纤溶酶可水解B B链链N-N-端第端第157157和和1 5 81 5 8
10、 两 个 氨 基 酸 ， 生 成 双 链两 个 氨 基 酸 ， 生 成 双 链 U KU K 。pro-UKpro-UK在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分在溶液中不稳定，容易逐渐水解成小分子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在子尿激酶原或变成双链尿激酶，但其冻干品在44以下是稳定的以下是稳定的。 七、尿激酶原的血栓溶解特异性七、尿激酶原的血栓溶解特异性1 1、pro-UKpro-UK本身活性很低，在血浆中只有本身活性很低，在血浆中只有微弱的活性，对体内纤溶系统影响很小，微弱的活性，对体内纤溶系统影响很小，当给药剂量太大时（超过当给药剂量太大时（超过1mg/kg1mg/kg），部），部分水解成
11、双链分水解成双链UKUK，则对体内纤溶系统有，则对体内纤溶系统有影响。影响。pro-UKpro-UK到达血栓表面，被那里的到达血栓表面，被那里的纤溶酶激活，部分变成双链纤溶酶激活，部分变成双链UKUK，后者激，后者激活结合在血栓表面构型有所改变的纤溶活结合在血栓表面构型有所改变的纤溶酶原变成纤溶酶，使血栓纤维蛋白部分酶原变成纤溶酶，使血栓纤维蛋白部分溶解。溶解。 2 2、当血栓纤维蛋白暴露出、当血栓纤维蛋白暴露出E-E-片段，单链片段，单链pro-pro-UKUK能直接激活结合在该片段能直接激活结合在该片段C-C-端两个赖氨酸残端两个赖氨酸残基上的纤溶酶原，其活性增加基上的纤溶酶原，其活性增加
12、500500倍，产生大倍，产生大量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此量纤溶酶，使血栓纤维蛋白迅速溶解，因此pro-UKpro-UK是特异性的纤溶酶原激活剂。单链是特异性的纤溶酶原激活剂。单链pro-pro-UKUK被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后，被纤溶酶、嗜热杆菌金属蛋白酶完全激活后，其比活性与尿激酶相同（其比活性与尿激酶相同（1-1.21-1.2 10105 5 IU/mg IU/mg，天，天然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为然尿激酶或尿激酶原的比活性的国际标准为104,000IU/mg104,000IU/mg）。）。 尿激酶原作用机理示意图尿激酶原作用机理示意图 D-doma
13、in E-domain E A B E A B C D F C D F EEEDDDPro-UKplasminogenplasminogenPlasminogen plasmonogenFDPUK，t-PA，SKplasminplasminplasminplasmin EEEE八、尿激酶原的生产工艺八、尿激酶原的生产工艺1、尿激酶原工程细胞的构建、尿激酶原工程细胞的构建 将人体分泌尿激酶的将人体分泌尿激酶的Detroit562Detroit562细胞细胞RNARNA提取出提取出来，用反转录及基因重组技术得到来，用反转录及基因重组技术得到构建了构建了Detroit Detroit 562562细
14、胞细胞cDNAcDNA文库，用合成的基因探针筛选获得人尿文库，用合成的基因探针筛选获得人尿激酶原全长激酶原全长cDNA，并，并构建成含人尿激酶原全长构建成含人尿激酶原全长cDNAcDNA的重组表达质粒的重组表达质粒pMTSVT-dupMTSVT-du，采用磷酸钙法将质粒转，采用磷酸钙法将质粒转染染CHOCHO细胞。经酶切鉴定正确后，最终挑选得到表达细胞。经酶切鉴定正确后，最终挑选得到表达水平最高的水平最高的CL-11GCL-11G工程细胞株。工程细胞株。该工程细胞株进行该工程细胞株进行了一系列鉴定的结果表明，它符合生物制品生产细了一系列鉴定的结果表明，它符合生物制品生产细胞的要求。胞的要求。2
15、、细胞的微载体灌流培养、细胞的微载体灌流培养 将工程细胞将工程细胞CL-11GCL-11G细胞株从生产种子库取出，复细胞株从生产种子库取出，复苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶内培养，基础培养基为苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶内培养，基础培养基为DMEM/F12DMEM/F12，再转入，再转入5 5升罐培养，细胞密度达到升罐培养，细胞密度达到1 110107 7细细胞胞/ml /ml 后转入后转入20L20L罐培养，采用多孔微载体无血清灌罐培养，采用多孔微载体无血清灌流培养。待细胞密度达到流培养。待细胞密度达到1 110107 7/ml/ml左右时，采用间隙左右时，采用间隙更换部分微载体的工艺，即每隔更换
16、部分微载体的工艺，即每隔10101515天更换约天更换约1/41/4微载体，每天收集培养上清微载体，每天收集培养上清1 1 1.21.2个体积个体积。我们用。我们用20L20L罐连续培养罐连续培养9191天，细胞密度最高达天，细胞密度最高达2.62.610107 7/ml/ml，共获，共获培养上清培养上清1909L,1909L,平均活性为平均活性为6280IU/ml,6280IU/ml,最高达最高达11200IU/ml11200IU/ml，总产量达到，总产量达到113g113g。 3 3、产品纯化制备工艺、产品纯化制备工艺 采用采用Streamline SP-Streamline SP-阳离子
17、交换色谱阳离子交换色谱SephacrylSephacryl S-200HR S-200HR凝胶色谱凝胶色谱对氨基苯甲醚对氨基苯甲醚亲和色谱亲和色谱QAE-SepharoseQAE-Sepharose阴离子交换色谱四阴离子交换色谱四步纯化工艺，从步纯化工艺，从19091909升培养上清，获得半成升培养上清，获得半成品品80g80g，回收率，回收率70%70%以上，纯度高于以上，纯度高于98%98%，单链，单链含量含量 98%98%。半成品加入保护剂和赋形剂后，。半成品加入保护剂和赋形剂后，经无菌过滤、分装、冻干，即成产品经无菌过滤、分装、冻干，即成产品78.4g78.4g。连续生产连续生产5 5
18、批产品，其中三批样品送国家卫生批产品，其中三批样品送国家卫生部生物制品检定所检定，部生物制品检定所检定，2323项指标全部合格。项指标全部合格。 三批三批pro-UKpro-UK电泳结果电泳结果九、重组人尿激酶原的九、重组人尿激酶原的 临床前安全试验临床前安全试验1 1 急性毒性试验：急性毒性试验： 小鼠急性毒性试验结果显示，小鼠急性毒性试验结果显示，pro-pro-UKUK的半数致死量（的半数致死量（LDLD5050） 97.5 97.5 mg/kgmg/kg。在。在1414天观察期内，小鼠体重天观察期内，小鼠体重增加正常，未见任何异常，死亡率增加正常，未见任何异常，死亡率为零。为零。2 2
19、 pro-UKpro-UK的长期毒性试验的长期毒性试验 Beagle Beagle狗的长期毒性研究结果表明，狗的长期毒性研究结果表明，pro-UK pro-UK 28mg/kg28mg/kg和和8mg/kg8mg/kg组每次静脉滴注后可见牙组每次静脉滴注后可见牙龈不同程度充血，给药后半小时明显减轻，龈不同程度充血，给药后半小时明显减轻，4 4 小时内恢复正常。用药后注射部位容易出小时内恢复正常。用药后注射部位容易出血，需要适当延长压迫止血时间。血，需要适当延长压迫止血时间。2mg/kg2mg/kg组组未观察到上述症状。未观察到上述症状。3 Wistar3 Wistar大鼠的长期毒性试验大鼠的长
20、期毒性试验 大鼠静脉注射大鼠静脉注射pro-UK 3pro-UK 3、1010和和30mg/kg30mg/kg后，后， 三三个剂量组受试动物均未出现毒性反应症状，食个剂量组受试动物均未出现毒性反应症状，食量、体重增长正常。量、体重增长正常。1313项血液学检查结果显示，项血液学检查结果显示，RBCRBC、HgbHgb、RetiReti、HCTHCT、MCHCMCHC、MCHMCH与对照与对照组比较有显著差别或非常显著差别（组比较有显著差别或非常显著差别（P P 0.05, 0.05, P P 0.01 ) 0.01 )，但都在正常范围波动，没有明显的时，但都在正常范围波动，没有明显的时效关系和
21、量效关系。效关系和量效关系。 4. pro-UK4. pro-UK的特殊毒性试验研究结果的特殊毒性试验研究结果1).1).小鼠骨髓细胞微核试验小鼠骨髓细胞微核试验 昆明小鼠静脉注射昆明小鼠静脉注射pro-UK90mg pro-UK90mg /kg/kg后，后，1212、2424、3636、4848及及7272小时取小时取材检查，对多染红细胞微核率及红材检查，对多染红细胞微核率及红系细胞造血均无明显影响。各取样系细胞造血均无明显影响。各取样点的微核率及点的微核率及PCE/NCEPCE/NCE值均在正常值均在正常范围之内。范围之内。2). pro-UK2). pro-UK的遗传毒性研究的遗传毒性研
22、究 用沙门氏菌诱变性实验平皿掺入法检测用沙门氏菌诱变性实验平皿掺入法检测pro-UKpro-UK对测试菌株对测试菌株TA97TA97、TA98TA98、TA100TA100 和和TA102TA102的致突变作用。结果表明，的致突变作用。结果表明，pro-UKpro-UK在在0.10.1 20002000 g g/ /皿浓度范围内皿浓度范围内, , 在活化和非在活化和非活化条件下，诱发四菌株产生的回变菌落活化条件下，诱发四菌株产生的回变菌落数与相应的自发突变率和数与相应的自发突变率和 S S9 9对照组相比无对照组相比无明显增加，表明明显增加，表明pro-UKpro-UK对沙门氏菌无致基对沙门氏
23、菌无致基因突变作用。因突变作用。3). pro-UK3). pro-UK的的CHLCHL细胞染色体畸变试验细胞染色体畸变试验 pro-UK100pro-UK100、200200、400400 g/mlg/ml分别分别与与CHLCHL细胞接触培养细胞接触培养2424、4848小时小时( (加加S S9 96h)6h)收获细胞，三个剂量收获细胞，三个剂量pro-UKpro-UK对对CHLCHL细胞染色体畸变率均无明显影响，细胞染色体畸变率均无明显影响，也未见诱发也未见诱发CHLCHL细胞染色体畸变及数细胞染色体畸变及数目改变。目改变。4). pro-UK4). pro-UK的生殖毒性研究的生殖毒性
24、研究 小鼠致畸胎试验结果表明，小鼠妊娠后小鼠致畸胎试验结果表明，小鼠妊娠后第第6 6 1515天，每天静注天，每天静注pro-UK 1pro-UK 1、5 5、1515、45mg/kg45mg/kg，连续，连续1010天，天，5 5、1515、45 mg/kg45 mg/kg各剂量组均有流产和母鼠死亡，各剂量组均有流产和母鼠死亡，1mg/kg1mg/kg和和15mg/kg15mg/kg组存活的胎鼠各发现一个足组存活的胎鼠各发现一个足外翻畸形，畸形率为外翻畸形，畸形率为 0.9%0.9%和和0.7%0.7%，均在，均在正常范围，正常范围，5mg/kg5mg/kg和和45mg/kg45mg/kg组
25、及溶剂组及溶剂对照组存活胎鼠未发现畸形。对照组存活胎鼠未发现畸形。十、十、pro-UKpro-UK的一般药理学试验的一般药理学试验 通过小鼠通过小鼠( (剂量：剂量：5.25.2、10.410.4、20.8mg /kg)20.8mg /kg)，大鼠大鼠( (剂量剂量:3.6:3.6、6.06.0、12.0mg/kg)12.0mg/kg)，犬，犬( (剂量剂量: : 0.60.6、1.21.2、2.4mg/kg)2.4mg/kg)和豚鼠回肠和豚鼠回肠 ( (剂量剂量:1 :1 1010-6 -6 和和1 1 1010-5 -5g/ml)g/ml)的一般药理学试验的结果表明，的一般药理学试验的结果
26、表明，pro-UKpro-UK对受试动物的一般行为、状态及中对受试动物的一般行为、状态及中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统等均无明显影响。对出血时间和血小板系统等均无明显影响。对出血时间和血小板凝结功能也无明显影响。仅发现犬实验中手凝结功能也无明显影响。仅发现犬实验中手术创面有渗血现象，实验结束后全身血液有术创面有渗血现象，实验结束后全身血液有类似肝素化状态。类似肝素化状态。十一、十一、pro-UKpro-UK的药效学试验结果的药效学试验结果 11.1 pro-UK11.1 pro-UK对家兔外源性血栓的溶栓作用对家兔外源性血栓的溶栓作用: :
27、用体外血栓形成仪制备血栓，染色后经颈静用体外血栓形成仪制备血栓，染色后经颈静脉注入家兔体内，观察不同剂量脉注入家兔体内，观察不同剂量 pro-UKpro-UK的溶栓的溶栓作用，并与作用，并与UKUK进行比较。结果表明，进行比较。结果表明，pro-UKpro-UK与与UKUK同等剂量的溶栓作用相似，同等剂量的溶栓作用相似， pro-UKpro-UK的溶血栓的溶血栓功能随剂量增加而增强，功能随剂量增加而增强， 其溶栓率与对照组比其溶栓率与对照组比较差异非常明显较差异非常明显 ( ( P P 0.0010.001) ) ，正常家兔对注入，正常家兔对注入的血栓有一定生理性溶解作用。揭示的血栓有一定生理
28、性溶解作用。揭示pro-UKpro-UK对对家兔试验性血栓有明显的溶解作用。家兔试验性血栓有明显的溶解作用。表表1 pro-UK1 pro-UK对实验兔肺血栓的溶解作用对实验兔肺血栓的溶解作用组别组别 剂量剂量 动物数动物数 原血栓重原血栓重 24h后栓重后栓重 溶栓率溶栓率 (U/kg) (只只) (mg) (mg) (%) 对照组对照组 0 8 32.25 2.05 23.88 2.30 25.95 5.42 10000 8 31.75 1.58 15.38 4.96 52.47 14.58 UK 20000 8 30.25 1.49 13.38 4.72 56.27 14.90 4000
29、0 7 30.43 1.62 9.71 3.25 68.30 9.70 80000 7 31.43 1.99 11.71 6.29 63.12 18.82 pro-UK 10000 5 32.00 2.35 15.40 5.13 52.48 14.47 20000 8 30.25 1.28 15.88 3.18 51.54 9.75 40000 8 32.38 1.77 12.88 3.94 59.72 14.19 80000 8 31.25 1.49 9.50 3.63 69.69 11.25 160000 8 32.38 1.85 8.25 3.33 74.44 10.25 11.2 pr
30、o-UK11.2 pro-UK对猪冠状动脉血栓的对猪冠状动脉血栓的 溶栓作用及相关指标的影响溶栓作用及相关指标的影响 中国试验小型猪直接用电刺激冠状动脉形成中国试验小型猪直接用电刺激冠状动脉形成冠脉内血栓，用不同剂量冠脉内血栓，用不同剂量pro-UKpro-UK进行溶栓治疗，进行溶栓治疗，结果表明，结果表明，UKUK和和pro-UKpro-UK对猪冠脉血栓有显著对猪冠脉血栓有显著的溶栓作用，的溶栓作用，pro-UKpro-UK4 410104 4IU/kgIU/kg、8 810104 4 IU/kgIU/kg、 161610104 4IU /kg IU /kg 三个剂量组与对照组相三个剂量组与
31、对照组相比均能明显缩小冠脉血栓横切面积，减轻心肌比均能明显缩小冠脉血栓横切面积，减轻心肌缺血程度和范围，缩小梗塞区。缺血程度和范围，缩小梗塞区。UK ( 80000 UK ( 80000 IU/kg) IU/kg) 溶栓率为溶栓率为 40.1 %40.1 %，pro-UK pro-UK 三个剂量组的三个剂量组的溶栓率依次为溶栓率依次为34.4%34.4%、45.6%45.6%、47.3%47.3%；对照组自；对照组自溶率为溶率为6.7%6.7%。对照对照UK UK （ 8 8万万IU/kg)IU/kg)U-PA( 4U-PA( 4万万IU/kg)IU/kg)U-PA( 8U-PA( 8万万IU
32、/kg)IU/kg)U-PA( 16U-PA( 16万万IU/kg)IU/kg)UKUK和和u-PAu-PA对冠脉血栓溶解的作用对冠脉血栓溶解的作用pro-UKpro-UK对猪冠状动脉血栓对猪冠状动脉血栓的溶栓作用的溶栓作用0204060对照液UK 80000u/kgu-PA 40000u/kgu-PA 80000u/kg u-PA 160000u/kg图1-2.各组血栓溶解率的比较血栓溶解率(%)给药前后血浆P L G 的变化给药前后血浆P L G 的变化406080100120140020406080100120140时间（分）时间（分）变化率（% ）变化率（% ）图图3. 各组药物各组药
33、物2-AP的变化比较的变化比较406080100120药前药前药后药后154590135min变化率变化率%对照液对照液UK 8万万u-PA 8万万u-PA 16万万给药前后血浆F I B 的变化给药前后血浆F I B 的变化100150200250300350400020406080100120140时间（分）FIB浓度（m g % ）十二、十二、pro-UKpro-UK动物体内的动物体内的药代动力学研究药代动力学研究1、用用HPLCHPLC法研究家兔法研究家兔pro-UKpro-UK和和UKUK的药代动力的药代动力学结果表明，单链学结果表明，单链pro-UK pro-UK 和双链和双链 U
34、KUK分别按分别按双指数函数和单指数函数衰减。单链双指数函数和单指数函数衰减。单链pro-UKpro-UK的初相半衰期的初相半衰期(t (t1/21/2( ( ) )=7=7 2 2分钟分钟) )与双链与双链UKUK的初的初相半衰期（相半衰期（t t1/21/2( ( ) )= 9= 9 3 3分钟比较接近；单链分钟比较接近；单链pro-UKpro-UK的末相半衰期为的末相半衰期为 t t1/21/2( ( ) )=43=43 1010分钟，提分钟，提示单链示单链 pro-UKpro-UK在体内的作用机理与双链在体内的作用机理与双链UKUK不不同。单链同。单链 pro-UKpro-UK和双链和
35、双链UKUK的药时曲线下的面的药时曲线下的面积积(AUC)(AUC)分别为分别为398398 46KBq.min.ml46KBq.min.ml-1 -1 和和151151 15 15 KBqKBq. min.ml. min.ml-1 -1。十三、十三、期临床耐受性试验期临床耐受性试验 1 1、健康受试者的遴选：、健康受试者的遴选： 受试者共受试者共2323人，男人，男1111人，女人，女1212人，人，年龄年龄20-3520-35岁，平均岁，平均27276 6岁；体重岁；体重51-73kg51-73kg，平均，平均63.763.75.2kg5.2kg。所有入。所有入选者的凝血和纤溶指标均合格，
36、乙选者的凝血和纤溶指标均合格，乙肝表面抗原均为阴性，生化检测和肝表面抗原均为阴性，生化检测和心电图正常。心电图正常。表表2.232.23名受试者的性别、年龄、体重等情况名受试者的性别、年龄、体重等情况 A组组3/325.5 1.961.8 3.1B组组3/328.5 6.359.3 2.7C组组3/327.2 6.160.2 6.2D组组2/325.0 6.457.0 4.5组别组别性别性别 ( (男男/ /女女) ) 年龄（岁）年龄（岁） 体重（体重（kgkg）表表3. 233. 23名受试者凝血指标的体检结果名受试者凝血指标的体检结果剂量组剂量组PT(S)PA(%)APTT(S)FIB(m
37、g/dl)A组组11.12 0.4489.33 4.9328.50 1.22229.67 42.08B组组10.57 0.2995.73 6.8529.13 2.86229.50 42.53C组组11.22 0.6188.40 6.7431.37 2.77284.67 92.87D组组11.80 0.5782.66 5.8329.24 2.34230.00 16.432 2、受试者应用药物前后血常规和、受试者应用药物前后血常规和 血液生化指标的检查结果血液生化指标的检查结果 23 23名受试者应用药物前后血常规和血名受试者应用药物前后血常规和血液生化指标的检查结果表明，各个剂量液生化指标的检查
38、结果表明，各个剂量组试验前与给药后组试验前与给药后2424小时比较，四项血小时比较，四项血常规指标，常规指标，50mg50mg组组RBCRBC稍有上升，其余稍有上升，其余各项指标都轻微减少，其结果都在正常各项指标都轻微减少，其结果都在正常范围，统计学分析无显著性差异；范围，统计学分析无显著性差异；3 3、受试者应用药物前后、受试者应用药物前后 凝血指标的测定结果凝血指标的测定结果 受试者应用药物前后凝血和纤溶指标的测定结果受试者应用药物前后凝血和纤溶指标的测定结果表明，四个剂量组表明，四个剂量组PTPT和和INRINR值在给药后第值在给药后第2 2小时均略小时均略有上升。有上升。PAPA在给药
39、后第在给药后第2 2小时均稍有下降，小时均稍有下降，24 24 小时小时后均恢复至用药前水平，从统计结果看用药前后均后均恢复至用药前水平，从统计结果看用药前后均无显著性。四个剂量组无显著性。四个剂量组APTTAPTT在给药后第在给药后第2 2小时均略小时均略有延长，有延长，2424小时也均恢复到正常水平，虽然小时也均恢复到正常水平，虽然20mg20mg组组统计学分析有显著性，但延长值未超过正常值一倍统计学分析有显著性，但延长值未超过正常值一倍, ,没有临床意义。没有临床意义。表表4 4 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化剂剂量量组组项项 目目时间时
40、间PT(S) PA(%) APTT(S) INR FIB(mg/dl) FDP( g/ml) PLG(%) 2-AP(%) 5mg给药前给药前11.43 0.6286.17 5.60 47.00 35.39 1.15 0.06 225.83 185.26 10 114.67 38.76 84.03 6.99 给药后给药后2 小时小时11.50 0.43 76.55 17.99 64.00 41.60 1.29 182.75 49.48 10 114.27 37.24 83.55 3.65 给药后给药后24小时小时11.25 0.40 87.67 4.37 28.33 1.75 1.15 0.0
41、7 219.20 64.20 10 40*117.03 36.33 105.53 34.60 20mg给药前给药前11.08 0.64 90.25 6.85 30.75 3.10 1.11 0.09 192.00 34.13 10 91.05 34.87 88.78 9.99 给药后给药后2小时小时11.92 1.71 83.17 14.05 54.83* 14.361.27 0.30 196.17* 78.66 10-40 99.60 35.86 92.95 8.94 给药后给药后24小时小时11.27 0.71 88.00 7.62 31.67* 3.08 1.15 0.10 262.00
42、* 79.96 10-40 110.90 35.06 113.92 31.97表表5 5 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化(续续)剂剂量量组组项项 目目时间时间PT(S) PA(%) APTT(S) INR FIB(mg/dl) FDP( g/ml) PLG(%) 2-AP(%) 35mg给药前给药前11.10 0.1489.30 1.72 31.67 4.58 1.13 0.02 262.38 121.38 10 120.07 39.07 126.83 26.33 给药后给药后2 小时小时12.05 1.80 81.82 13.54 40.90
43、 10.32 1.30 0.32 234.50 132.6 10-40 40 96.52 32.04 110.83 22.64 给药后给药后24小时小时11.87 1.50 83.22 11.88 29.97 2.95 1.26 0.26 305.17 78.68 10-40 40 , 10 128.00 34.37 112.35 30.80 50mg给药前给药前11.66 0.61 84.42 5.79 28.92 2.44 1.22 0.10 238.80 90.99 10 109.42 33.97 79.62 7.44 给药后给药后2 小时小时13.00 1.75 73.20 10.90
44、 45.96 18.15 1.46 0.33 211.40 57.58 1040 96.66 30.92 99.02* 3.24 给药后给药后24小时小时11.60 0.68 84.40 7.16 30.20 2.39 1.22 0.12 242.00 35.82 10 120.60 40.27 97.28* 4.20 给药前后P A 、P T、 A P TT的变化02040608010004812162024时间（小时）时间（秒）、%给药前后血浆P L G 的变化给药前后血浆P L G 的变化4060801001201400510152025时间（小时）时间（小时）百分含量（% ）百分含量（
45、% ）给药前后血浆给药前后血浆a2 2-AP的变化-AP的变化4050607080901001101201301400510152025时间（小时）时间（小时）百分含量（% ）百分含量（% ）给药前后血浆F I B 的变化给药前后血浆F I B 的变化601101602102603100510152025时间（小时）时间（小时）微克/ 毫升微克/ 毫升结论结论 （1).231).23名正常受试者静脉接受重组人尿型纤溶名正常受试者静脉接受重组人尿型纤溶酶原激活剂酶原激活剂(pro-UK)5(pro-UK)550mg50mg后，均未观察到后，均未观察到任何不良反应，皮肤黏膜及其它部位未见出血；任何
46、不良反应，皮肤黏膜及其它部位未见出血； 注射局部皮肤无刺激反应表现。尿常规、血常注射局部皮肤无刺激反应表现。尿常规、血常规、心电图以及血液生化规、心电图以及血液生化2626项测定指标也均在项测定指标也均在正常范围。表明该药物对身体各系统、以及对正常范围。表明该药物对身体各系统、以及对肝、肾功能均无明显毒性作用。肝、肾功能均无明显毒性作用。 十四、健康受试者十四、健康受试者iviv重组重组pro-UKpro-UK的药代动力学的药代动力学 正常受试者显示健康受试者正常受试者显示健康受试者iv iv剂量为剂量为20mg20mg，35mg35mg和和50mg50mg重组重组pro-UKpro-UK后后
47、( (其中其中25%25%推注，推注，75%75%在在1h1h内恒速滴注内恒速滴注) )，血浆，血浆总总pro-UKpro-UK、scproscpro-UK -UK 和纤溶酶活性浓度和纤溶酶活性浓度- -时间变化的结果显示，血浆总时间变化的结果显示，血浆总pro-UKpro-UK、scproscpro-UK-UK和纤溶酶活性浓度均依赖于剂和纤溶酶活性浓度均依赖于剂量或滴注速度明显增高。量或滴注速度明显增高。表表6 6 健康志愿者健康志愿者iv iv 不同剂量重组不同剂量重组pro-UKpro-UK后后血浆血浆pro-UKpro-UK的药代动力学参数的药代动力学参数参数参数 单位单位 20mg
48、35mg 50mg N=7 N=6 N=6AUC(0-6h) ng.h.mL-1 216.9 50.6 501.3 152.5 638.2 62.7 AUC(0- ) ng.h.mL-1 229.0 56.1 535.0 177.1 652.0 65.2 MRT h 1.5 0.2 1.5 0.1 1.2 0.1 CLS L/h 0.0920.025 0.0610.019 0.0460.005 VSS L 0.1370.038 0.090 0.023 0.0570.006 t1/2 h 2.4 0.6 2.6 0.4 1.9 0.5 Cmax ng.mL-1 99.3 23.6 209.0 2
49、1.2 369.8 15.3 tmax h 0.17 0.37 0.04 0.03 0.25 0.37 双链双链 生成率生成率(0-6h) % -6.1 9.9 15.4 4.2 27.8 7.6 双链双链 生成率生成率(0- ) % -8.3 10.4 15.0 4.3 27.9 7.0 表表7 7 健康志愿者健康志愿者iv iv不同剂量重组不同剂量重组pro-UKpro-UK后后血浆血浆scproscpro-UK-UK的药代动力学参数的药代动力学参数参数参数单位单位20 mg 35 mg50 mgn = 7n = 6n = 6AUC(0-6h)ng.h.mL-1227.2 43.1424.
50、8 133.6 a457.1 26.5 cccAUC(0- )ng.h.mL-1244.6 48.7456.1 155.4 a466.7 30.4 cccMRTh1.5 0.11.5 0.2 bb1.2 0.1 cccCLSL/h0.085 0.0170.048 0.016 aa0.043 0.003 cccVSSL0.124 0.0280.071 0.018 aa0.052 0.003 ccct1/2h2.8 0.52.6 0.4 bb1.9 0.2 ccCmaxng.mL-192.9 23.7 175.2 14.0 aaa, bbb296.6 9.3 cccTmaxh0.21 0.250.
