1、Molecular Biology Course2 主要核酸操作技术主要核酸操作技术核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术核酸分离技术核酸分离技术PCR技术技术mRNA的纯化和文库的构建的纯化和文库的构建基因克隆技术基因克隆技术DNA序列分析技术序列分析技术突变位点的检测突变位点的检测Molecular Biology Course主要内容主要内容遗传标记遗传标记DNA遗传标记遗传标记基因突变基因突变SNPSNP检测技术检测技术Molecular Biology Course遗传标记遗传标记 遗传标记：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记遗传标记：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记 分
2、子标记（分子标记（Molecular Markers） 广义：可遗传并可检测的特异广义：可遗传并可检测的特异DNA序列、序列、RNA或蛋白质。或蛋白质。 狭义：指狭义：指DNA或或RNA标记。标记。 DNA遗传标记：指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基遗传标记：指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。水平遗传多态性的直接的反映。 DNA遗传标记的种类（遗传标记的种类（P436）：）： 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性RFLP、简单重复序列（、简单重复序列（SSR）、）、SNP。Molecular Biology Cour
3、se主要内容主要内容遗传标记遗传标记DNA遗传标记遗传标记基因突变基因突变SNPSNP检测技术检测技术Molecular Biology CourseDNA遗传标记遗传标记(P437) 第一代标记：第一代标记： 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP） 定义：用限制性内切酶特异性切割定义：用限制性内切酶特异性切割DNA链，由于链，由于DNA的一的一个个“点点”上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生上的变异所造成的能切与不能切两种状况，可产生不同长度的片段，可用凝胶电泳显示多态性。不同长度的片段，可用凝胶电泳显示多态性。 优点：广泛用于检测优点：广泛用于检测已知已知DNA点突
4、变点突变，可以检测大到几千个，可以检测大到几千个碱基对碱基对DNA片段；对片段；对SNP位点检测和基因分型均能位点检测和基因分型均能较准确较准确的判断。的判断。 缺点：限制性酶切过程中不可避免的遭遇到酶切不完全或缺点：限制性酶切过程中不可避免的遭遇到酶切不完全或DNA降解的现象，且只能检测降解的现象，且只能检测已知已知多态位点，不能罕见的或多态位点，不能罕见的或未知的突变位点；每次酶切未知的突变位点；每次酶切2-3个片段，信息量有限；限制个片段，信息量有限；限制性内切酶价格较昂贵。性内切酶价格较昂贵。Molecular Biology CourseDNA遗传标记遗传标记 第二代标记：简单重复序
5、列（第二代标记：简单重复序列（SSR） 定义：真核生物基因组中散布有由大量由简单重复序列所组定义：真核生物基因组中散布有由大量由简单重复序列所组成的成的微卫星微卫星和由串联重复短序列组成的和由串联重复短序列组成的小卫星小卫星。在小卫星或。在小卫星或微卫星的两端往往是相对保守的微卫星的两端往往是相对保守的限制性内切酶位点限制性内切酶位点。通过特。通过特异性引物进行异性引物进行PCR扩增、凝胶电泳和放射自显影（或银染），扩增、凝胶电泳和放射自显影（或银染），可以检测到在简单重复序列中由于可以检测到在简单重复序列中由于重复单位数重复单位数不同而造成的不同而造成的DNA区域的多态性。区域的多态性。 优
6、点：与优点：与RFLP标记相比标记相比SSR检测的检测的多态性频率高多态性频率高得多。得多。 应用：基因定位、应用：基因定位、DNA指纹分析、遗传分析和疾病诊断等。指纹分析、遗传分析和疾病诊断等。 缺点：要克隆足够数量的缺点：要克隆足够数量的SSR并进行测序，需要投入足够的并进行测序，需要投入足够的资金、人力和时间。资金、人力和时间。Molecular Biology CourseDNA遗传标记遗传标记 第三代标记：第三代标记：SNP 定义：基因组定义：基因组DNA序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。 SNP是基因组中最简单、最常见的多态形式，具有很高的是基
7、因组中最简单、最常见的多态形式，具有很高的遗传稳定性。遗传稳定性。 已经在人类基因组中发现了超过已经在人类基因组中发现了超过1000万个万个SNP位点，平均位点，平均约每约每300bp就有一个就有一个SNP。 绝大多数绝大多数SNP位于非编码区。位于非编码区。 优点：可用于检测优点：可用于检测未知突变；未知突变；可以与可以与DNA芯片技术相结合芯片技术相结合实现自动化检测。实现自动化检测。 缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受检测条件影响。缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受检测条件影响。Molecular Biology CourseDNA遗传标记遗传标记 依据依据DNA遗传标记进行遗传标记
8、进行基因分型基因分型。 P473基因型（基因型（genotype）：）： 人：除性染色体外，人类细胞内的染色体都有人：除性染色体外，人类细胞内的染色体都有两份两份，一个人所拥有的一个人所拥有的一对等位位点一对等位位点的类型被称为的类型被称为-。 泛指：同一泛指：同一基因座位基因座位上多个上多个等位位点等位位点的类型。的类型。 基因分型（基因分型（genotyping）：确定某个个体基因型的）：确定某个个体基因型的实验。实验。 等位位点等位位点（P66）：）：指染色体指染色体DNA同一位置上的每同一位置上的每个个碱基类型碱基类型。Molecular Biology Course主要内容主要内容遗
9、传标记遗传标记DNA遗传标记遗传标记基因突变基因突变SNPSNP检测技术检测技术Molecular Biology Course基因突变基因突变 定义：由于体内外各种因素使基因特定的定义：由于体内外各种因素使基因特定的DNA序列序列的碱基组成或排列顺序发生改变，导致的碱基组成或排列顺序发生改变，导致DNA一级结一级结构改变。构改变。 根据分子机制不同分为：插入突变、缺失突变、点根据分子机制不同分为：插入突变、缺失突变、点突变突变 。 插入插入/缺失突变：缺失突变：DNA序列插入序列插入/缺失一个或多个核缺失一个或多个核苷酸的突变。苷酸的突变。 eg. 转座子（复制型转座子、非复制型转座子）。转
10、座子（复制型转座子、非复制型转座子）。Molecular Biology Course基因突变基因突变 点突变：指一种碱基通过化学修饰、遗传变异、复点突变：指一种碱基通过化学修饰、遗传变异、复制错误等引起的单一碱基的改变。制错误等引起的单一碱基的改变。 分为转换（分为转换（transition）和颠换（）和颠换（transversion）。）。 转换最常见，约占转换最常见，约占SNP的的2/3。Molecular Biology Course主要内容主要内容遗传标记遗传标记DNA遗传标记遗传标记基因突变基因突变SNPSNP检测技术检测技术SNP (P66) SNP广泛存在于人类基因组中。广泛存
11、在于人类基因组中。 单单倍倍/体体型（型（haplotype）：位于染色体上某一区域的一组相）：位于染色体上某一区域的一组相关联的关联的SNP等位位点被称为等位位点被称为-。 相邻相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代（图的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代（图2-42）。）。 34个相邻的个相邻的SNP标记构成的标记构成的单体型单体型就可有就可有816种。种。SNP SNP分类：分类： 根据根据SNP在基因组中的分布位置，可分为：在基因组中的分布位置，可分为： cSNP（1/5）、）、pSNP、rSNP。 从对生物遗传性状的影响上看，从对生物遗传性状的影响上看，cSNP又可分为：又
12、可分为： 同义同义cSNP、非同义非同义cSNP 。 SNP的应用（的应用（P69）：）： 人类基因单体型图的绘制人类基因单体型图的绘制 SNP与疾病易感基因的相关性分析与疾病易感基因的相关性分析 指导用药与药物设计指导用药与药物设计 动物、植物、微生物的遗产改造动物、植物、微生物的遗产改造/育种育种Molecular Biology Course主要内容主要内容遗传标记遗传标记DNA遗传标记遗传标记基因突变基因突变SNPSNP检测技术检测技术SNP检测技术检测技术（课下拓展课下拓展，各技术有何优缺点），各技术有何优缺点） 限制性酶切片段长度多态性分析限制性酶切片段长度多态性分析-RFLP 单
13、链构象多态性分析单链构象多态性分析-SSCP 毛细管电泳毛细管电泳 变性高效液相色谱变性高效液相色谱-DHPLC 异源双链分析异源双链分析-HA 变性梯度凝胶电泳分析变性梯度凝胶电泳分析-DGGE DNA芯片技术芯片技术-DNA chip 实时荧光实时荧光PCR分析分析 直接序列测定，直接序列测定， PCRMolecular Biology CourseSNP检测技术检测技术 PCR-RFLP： 原理：先用原理：先用PCR技术技术扩增扩增目的基因片段，由于目的基因片段，由于DNA个别个别碱基的突变，致使碱基的突变，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，分子的限制酶切位点及数目发生改变，用
14、用限制酶切割限制酶切割目的片段，所产生的片段数目和每个目的片段，所产生的片段数目和每个片段的长片段的长度度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。P427： Molecular Biology Course突变位点的检测技术突变位点的检测技术 单链构象多态性单链构象多态性（SSCP）：）： 是一种基于单链是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象，在电泳如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象，在电泳时泳动的速度不同。将时泳动的速度不同
15、。将PCR产物经变性后，进行产物经变性后，进行单链单链DNA凝胶电泳时，凝胶电泳时，靶靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位。中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位。 优点：简单快速，价廉，特别适合大样本的筛选；用优点：简单快速，价廉，特别适合大样本的筛选；用SSCP法检测小法检测小于于200bp的的PCR产物时，检出率可达产物时，检出率可达70-95。 缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受凝胶交联度、电泳温度、片缺点：存在假阳性和假阴性；检测效果受凝胶交联度、电泳温度、片断长度等条件影响，当片段大于断长度等条件影响，当片段大于400bp时，检出率仅为时，检出率仅为50
16、左右；同时左右；同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Molecular Biology Course突变位点的检测技术突变位点的检测技术 异源双链分析法异源双链分析法（HA） 原理：原理： 由于突变和野生型由于突变和野生型DNA形成的异源杂合形成的异源杂合双链双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链会产生与相应的同源双链DNA不同的迁率。不同的迁率。 优点：优点：HA是是SSCP法鲜为人知的姊妹篇，操作也比较简法鲜为人知的姊妹篇，操作也比较
17、简便。便。 HA和和SSCP两种方法突变检测模式不同，两种方法两种方法突变检测模式不同，两种方法可以同时在同一张凝胶上进行，二者可以相互掩盖对方的可以同时在同一张凝胶上进行，二者可以相互掩盖对方的缺点与不足，使突变检出率提高到近缺点与不足，使突变检出率提高到近100。 缺点：缺点： 只能分离双链只能分离双链DNA；也只适合于小片段的分析。；也只适合于小片段的分析。Molecular Biology CourseSNP检测技术检测技术 实时荧光实时荧光PCR分析分析 原理：使用针对核酸中不同多态性序列的原理：使用针对核酸中不同多态性序列的荧光探针荧光探针，只有，只有与靶序列与靶序列完全匹配完全匹
18、配的探针才能被相应的的探针才能被相应的切割切割，它们在，它们在PCR扩扩增中被水解切割释放出增中被水解切割释放出荧光信号荧光信号，不同探针标记不同的荧光，不同探针标记不同的荧光报道信号。报道信号。 优点：操作方便简单，实验时间是现有方法中最短的，重优点：操作方便简单，实验时间是现有方法中最短的，重复性强，适合于复性强，适合于大量样本大量样本的检测；同时整个实验是在闭管的的检测；同时整个实验是在闭管的状态下完成，可以非常有效状态下完成，可以非常有效避免污染避免污染；结果判断借助仪器软；结果判断借助仪器软件自动判读，客观性强。件自动判读，客观性强。 缺点：只能对缺点：只能对已知的多态性位点已知的多
19、态性位点进行分析；需要专门的仪进行分析；需要专门的仪器、试剂。器、试剂。SNP检测技术检测技术 基因芯片法基因芯片法 (DNA chip) ： 原理：又称为原理：又称为DNA 微探针阵列（微探针阵列（Micro array）。它是集成）。它是集成了大量的密集排列的了大量的密集排列的已知序列探针已知序列探针，通过与被标记的若干靶，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片因芯片杂交图象杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。匹配的原理确定
20、靶基因的序列。 优点：快速简单、自动化程度高，使优点：快速简单、自动化程度高，使SNPs的分析更加便捷，的分析更加便捷，具有很大的发展潜力；还可用于基因定位、具有很大的发展潜力；还可用于基因定位、DNA测序、物理测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。图谱和遗传图谱的构建等。 缺点：需要专门的仪器、试剂，费用较高。缺点：需要专门的仪器、试剂，费用较高。 Molecular Biology Course 直接测序测定：直接测序测定： 是诊断是诊断未知未知突变基因最直接的方法，其方法是将突变基因最直接的方法，其方法是将PCR产产物在自动测序仪上直接测序。物在自动测序仪上直接测序。 优点：操作简便，测序时
21、间短。优点：操作简便，测序时间短。 缺点：费用昂贵，仅适合于小样本量分析。缺点：费用昂贵，仅适合于小样本量分析。SNP检测技术检测技术Molecular Biology Course思考思考 简述简述DNA遗传标记的种类？遗传标记的种类？Molecular Biology Course突变位点的检测技术突变位点的检测技术 变性梯度凝胶电泳法变性梯度凝胶电泳法（DGGE） 原理：当双链原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性变性湿度湿度一致的凝一致的凝胶位置时，胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降；当解链的发生部分解链，电泳迁移率下降；当解链的DNA链
22、中有链中有一一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度不个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度不同而被分离。同而被分离。 优点：检测片段可达优点：检测片段可达1kb，最适范围为，最适范围为100bp-500bp，如果突变发在，如果突变发在最先解链的最先解链的DNA区域，检出率可达区域，检出率可达100；检测结果无假阳性重复性好，；检测结果无假阳性重复性好，准确率高，可判断基因型；该法一经建立，操作也较便，适合于大样本的准确率高，可判断基因型；该法一经建立，操作也较便，适合于大样本的检测筛选。检测筛选。 缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测
23、，需要一套专的缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专的电泳装置，合成的电泳装置，合成的PCR引物最好在引物最好在5末端加一段末端加一段40bp-50bp的的GC夹，以夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。利于检测发生于高熔点区的突变。Molecular Biology Course突变位点的检测技术突变位点的检测技术 变性高效液相色谱检测变性高效液相色谱检测（DHPLC） 原理：含有突变位点的原理：含有突变位点的PCR 扩增产物经变性、退火，将形成同源和异扩增产物经变性、退火，将形成同源和异源双链两种源双链两种DNA 分子。在部分变性条件下，发生错配的异源双链分子。在部分变性
24、条件下，发生错配的异源双链DNA 更更易于解链为单链易于解链为单链DNA，与，与DNASep 柱结合力降低，比同源双链柱结合力降低，比同源双链DNA 分分子更易于被乙腈洗脱下来，从而与同源双链子更易于被乙腈洗脱下来，从而与同源双链DNA 分离。分离。 优点：分离优点：分离DNA分子快速，操作自动化、简便，经济；分子快速，操作自动化、简便，经济； PCR产物无产物无须须进行纯化处理即可用于突变检测；能准确测定进行纯化处理即可用于突变检测；能准确测定DNA片段大小，基因突变检片段大小，基因突变检出率高（达出率高（达95-100%） 。 缺点：缺点： DHPLC 检测的灵敏性、特异性受检测的灵敏性、
25、特异性受PCR引物、引物、PCR 体系及反体系及反应条件、检测温度、应条件、检测温度、DNASep柱质量以及流动相梯度等多重影响。柱质量以及流动相梯度等多重影响。Molecular Biology Course突变位点的检测技术突变位点的检测技术 蛋白截断技术蛋白截断技术（PTT） 由于基因的非缺失型突变多可能造成翻译过程的提前终止由于基因的非缺失型突变多可能造成翻译过程的提前终止(突出表现突出表现为点突变形成终止密码子为点突变形成终止密码子)，其蛋白质产物为截短肽链；在，其蛋白质产物为截短肽链；在SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳，这种突变杂合子电泳显示有两条带为全长肽链和截短的酰胺凝胶电泳，
26、这种突变杂合子电泳显示有两条带为全长肽链和截短的肽链。肽链。 优点：从蛋白水平上检测基因突变；对检测长片段缺失或插入引起的优点：从蛋白水平上检测基因突变；对检测长片段缺失或插入引起的移码突变有相当的敏感性；单次分析的基因片段可达移码突变有相当的敏感性；单次分析的基因片段可达2kb；研究报道显示；研究报道显示基因突变检出率达基因突变检出率达90以上。以上。 缺点：缺点： 主要检测由于导致主要检测由于导致ORF改变的突变；且该技术要求检测的标改变的突变；且该技术要求检测的标本来自活检组织，或抽提本来自活检组织，或抽提RNA获得目的基因的获得目的基因的cDNA经体外翻译为蛋白经体外翻译为蛋白再进行检测；所检测的蛋白需要分离纯化以及排除杂质条带的干扰，故再进行检测；所检测的蛋白需要分离纯化以及排除杂质条带的干扰，故在实际应用中受到限制。在实际应用中受到限制。
