1、蛋白质蛋白质- -材料表面相互作用材料表面相互作用 哈尔滨工业大学哈尔滨工业大学材料物理与化学系材料物理与化学系蛋白质蛋白质- -材料表面相互作用材料表面相互作用蛋白质和材料的表面性能蛋白质吸附与脱附蛋白质构象的变化多元溶液中的相互作用蛋白质在材料表面的行为对于确定组织植入物界面的性质起着非常重要的作用表面吸附的蛋白质影响凝血、补体激活、细菌及细胞黏附表面吸附的蛋白质也影响材料的表面性能与降解性介绍蛋白质吸附的基本原理以及蛋白质和材料表面性质对固体表面的蛋白质行为的影响分子和底物的性质在决定蛋白质表面相互作用时的重要作用示意 一、蛋白质和材料的表面性能 影晌与材料表面相互作用的蛋白质性能影响材
2、料表面活性的蛋白质性能与蛋白质的一级结构有关，即氨基酸的序列影响蛋白质-材料表面的相互作用较大的分子易于与材料表面发生相互作用，因为它们可以有更多的位点与材料表面接触蛋白质的尺寸对蛋白质与材料表面相互作用的影响蛋白质尺寸的影响例如白蛋白分子(67kDa)与氧化硅底物形成77个接触点，而每个纤维蛋白原(340kDa)分子则形成703个接触点然而，尺寸并不是决定性的，球蛋白(65kDa)较其尺寸大得多的纤维蛋白原显示出更大的表面活性。蛋白质的尺寸对蛋白质与材料表面相互作用的影响蛋白质电荷的影响带电荷的氨基酸具有亲水性，通常位于蛋白质的外面，并易于与表面发生作用这种电荷及其在蛋白质表面分布能够在很大
3、程度上影响蛋白质的吸附然而类似于尺寸的影响，电荷也不是惟一的决定因素有趣的是蛋白质常在近等电位点表现出很大的活性(蛋白质分子显示出零净电荷时介质的pH计为pI)。与蛋白质伸展有关的性能也会影响其在材料表面的吸附蛋白质的伸展倾向于暴露更多与材料表面接触的位点增加伸展的程度和速率都可导致更大的表面活性蛋白质的伸展对蛋白质与材料表面相互作用的影响 蛋白质伸展的影响蛋白质结构稳定性的影响稳定性差的蛋白质或分子间交联较少的蛋白质倾向于伸展更多或更快,表面活性大例如，血红蛋白中的谷氨酸被疏水的缬氨酸替代使S血红蛋白稳定性降低，不稳定的蛋白质因而溶解较少，导致纤维性析出而使红血细胞破坏。 蛋白质的双歧性分子
4、性质及其氨基酸的极性、非极性、荷电性也对材料的表面活性有影响亲水的、极性的和荷电的氨基酸位于分子外部而疏水的残基在分子内部并不是绝对的，疏水的氨基酸也可位于蛋白质分子外部以与表面进行相互作用另外，蛋白质的伸展可暴露疏水区域而与表面发生相互作用。 分子和底物的性质在决定蛋白质表面相互作用时的重要作用示意 影响与蛋白质相互作用的材料表面性能 材料表面性能几何因数 底物的表面具有较多的形貌特征，可在与蛋白质的相互作用时暴露更多的表面区域例如与平整的表面相比，有沟槽和坑的表面具有更大的表面积，其他的表面特征如加工痕迹可为与蛋白质的相互作用提供额外位置化学成分 表面化学成分将决定何种功能基团适合于与生物
5、分子相互作用金属生物材料氧化的(钝化的)表面暴露金属离子与氧离子。类似地，陶瓷和某些玻璃表面包含金属离子和非金属离子不同的功能基团，如氨基、羧基、羰基和原子团均可存在于聚合物生物材料表面生物分子(或甚至分子的部分区域)对不同表面有不同亲和性取决于暴露何种基团。例如，疏水表面倾向于结合更多蛋白质而使结合更牢固。 微观组织结构在微观尺度上，生物材料表面可以是不均匀的生物材料表面可存在不同功能性的微畴，这些微畴可以与生物分子进行不同的作用例如，许多金属生物材料至少有两相，如Ti-6A1-4V中的相和相，不仅不同的相与生物分子作用的行为可以不同，而且晶界和晶内与生物分子的作用行为也不同对聚合物而言，大
6、分子链的折叠引起的分聚提供了不同的微畴结构。蛋白质对这些畴有不同的亲和性取决于不同畴内存在不同的化学物质。 二、吸附与脱附 吸附是分子黏附到固体表面的过程，蛋白质-表面相互作用导致局部蛋白质的高浓度，可较均匀溶液高1000倍这种蛋白质的聚集，尤其是特定的蛋白质在材料表面的聚集，在组织-植入体界面相互作用中起着决定性的作用。除上面所述材料的表面性能和蛋白质性能之外，吸附也取决于分子与底物作用的效率分子被吸附到表面可由4种传输机理中的一种或多种起作用。扩散；热对流；流动；互传输，如对流和扩散的相结合浓度、速度和分子尺寸对决定到达材料表面的蛋白质分子是重要的 以考虑扩散的影响为例，简单的扩散可由以下
7、公式描述：n是蛋白质在材料表面的浓度；C0是蛋白质的体浓度；t是时间 C是浓度；D是扩散系数；x是距离；t是时间在短时间和吸收率与扩散率相等的条件下：上式表示高的体浓度和或高的扩散系数(与分子尺寸成反比)导致到达材料表面的分子数量大在对流也存在的情况下，导致对流扩散，这取决于界面的几何状态，数学处理变得复杂对于存在薄的通道流动的情况下：式中，是流动速度；x是在通道中的流动距离；y是在流动通道的高度范围内的位置；是壁的剪切率；b是通道的高度。采用适当的边界条件后，方程式可以用数值方法解出。蛋白质存在于材料表面，蛋白质分子可以分子间力的方式与底物发生相互作用，如离子键、疏水反应以及电荷传递反应氢键
8、在蛋白质-表面相互作用中不起主要作用由于水易形成氢键，它与表面形成氢键就像蛋白质分子中的氨基酸与材料表面形成氢键一样容易分子间力对蛋白质-表面相互作用的控制取决于特殊的蛋白质和表面 即使对于含单一蛋白质的溶液，蛋白质吸附层也似乎是不均匀的当分子吸附于清洁表面时，它们与底物的作用有少量限制，每一个分子可与表面形成许多种接触由于表面被占，适合于吸附随后的蛋白质的表面较少。继而分子可能以不同的取向结合到材料表面，即使是在较少蛋白质-材料接触情况下，不同的取向也可使蛋白质避免或减少对先结合的分子间排斥作用。 蛋白质占据材料表面对随后蛋白质分子吸附的影响 除适合的接触面积外，因为蛋白质分子和材料表面的非
9、均匀性，蛋白质可以不同取向存在于材料表面(图3-5)蛋白质在材料表面形成不同取向，使表面与蛋白质密切接触，可带来附加的相互作用例如，双歧性蛋白极化的、非极化的和带电荷的氨基酸可与具有不同显微结构和化学性质的生物材料表面发生不同的相互作用。由于蛋白质和材料表面的不均匀性使吸附的蛋白质具有不同的取向吸附蛋白质的不同取向不仅影响与材料表面结合的蛋白质数量，而且具有显著的功能区别考虑一种酶或一种蛋白质，例如，纤连蛋白吸附于生物材料，取决于分子的取向酶的催化活性所需要的活性位点可能无法“开启”，与材料的相互作用及活化位点的启动被相邻分子所阻止(空间立体阻碍)类似地，如果纤连蛋白含RGD(图2-19)的部
10、分不能与细胞发生相互作用，蛋白质就不能支持细胞的贴附。脱附是吸附的逆过程，是吸附的逆过程，已经结合于表面的分已经结合于表面的分子可脱离表面回到体子可脱离表面回到体相中相中当发生脱附时，蛋白当发生脱附时，蛋白质与材料表面的所有质与材料表面的所有接触必须同时断开接触必须同时断开(图图3-6)。 蛋白质的脱附需要蛋白质与表面所有的键合同时断裂 对小分子(如气体)的脱附已经被很好地表征，而蛋白质的脱附是缓慢的或不存在的，除非界面环境发生巨大的变化，例如增加离化强度、降低pH、使用清洁剂等蛋白质吸附在很大程度上是不可逆的，因为这需要在分子与表面之间的所有相互作用同时解离。对于大的蛋白质，所有的接触同时断
11、开很困难或不可能，因为大的蛋白质与材料的键合量很大考虑纤维蛋白原的吸附，如果纤维蛋白原要脱附，全部与材料的接触点必须同时断裂然而吸附的蛋白质可被相同的或不同的蛋白质所替代。三、构象的变化 蛋白质具有柔性的链，这些链卷绕、折叠、弯曲成一种特殊的构象(三维结构)微环境(如pH、离子化强度)的变化可改变蛋白分子的构象类似地，在与固体表面的相互作用过程中，蛋白质的结构也可改变蛋白质构象可能改变，尽管活性水平可能有所下降，但是吸附蛋白质通常至少保持它们的一些活性例如吸附的酶保持催化性能、吸附的抗体保持与抗原结合的能力发生构象变化的模型有两种:1.蛋白质分子可经历与时间相关的分子铺展(图37)开始，蛋白分
12、子可以蛋白质外的氨基酸与材料表面少量位点接触，随着时间延长，蛋白分子与表面接触部分增加，蛋白质伸展，暴露内部的功能团参与更多的位点结合蛋白质与表面间的接触位点随时间而增加因为已经形成了大量接触位点，脱附并不随时问增加而增加。 与时间相关的蛋白质在材料表面的铺展 2.体溶液浓度的变化可以造成构象的变化(图3-8)在低浓度条件下，每个蛋白质可有大量的表面区域可以接触，蛋白质之间不互相接触，分子铺展而与材料接触增多在高的体浓度状态，每个分子所拥有的材料表面面积降低，由于吸附物-吸附物相互作用，较少伸展，因而更多的蛋白质吸附于表面，每个分子与材料的接触较少。图3-8与蛋白质体溶液浓度有关的蛋白质构象变
13、化 四、多元溶液 上述蛋白质-表面相互作用的大量知识来源于单一蛋白质溶液，但多元溶液中吸附与组织-植入物界面更为相关体液包括血液、泪液和唾液，包含了很多种生物分子，例如血液包含了150种以上蛋白质，还不包括脂类化合物、碳氢化合物、激素等搞清楚哪种分子聚集在材料表面以及与溶液成分的关系是极为重要的当表面暴露于多元溶液中时，某些分子将优先地从溶液沉积到表面进而，表面吸附层可能发生与时间相关的成分变化，直至达到一个亚稳定状态材料表面活性和生物分子在材料表面的有效性变化对决定表面的分子状态有贡献，因而亲和性(如尺寸、电荷、构象稳定性)和动力学因素(如浓度和蛋白质尺寸)是重要的由于表面只能提供有限的面积
14、与蛋白质结合，到达表面的分子竞争结合位点，蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-表面相互作用是重要的在单一蛋白质溶液中分子间的排斥起重要作用，但是在多元系统中可能发生分子间的吸引考虑简单的界面由扩散控制的情况，方程式(3-2)表明如果溶液中蛋白质分子浓度高和或蛋白质的尺寸小(扩散系数大)，则蛋白质将迅速到达表面虽然与表面的亲和力可能不是最佳的，即使是暂时的，但由于存在大量位点的“裸”表面，吸附也可能发生随时间变化，虽与表面有较大亲和力，但由于蛋白质浓度低和或尺寸大，蛋白质将缓慢到达表面然而其表面可能已被一单层蛋白质占据，在这种情况下，只有开始吸附的分子发生脱离，新的分子才能与表面结合。 一般地，纯的
15、吸附是少见的吸附的分子可以被交换，已经吸附的蛋白质与从体溶液中到达表面的蛋白质对位点的竞争导致了交换(图3-9)一旦吸附的蛋白质与表面的结合被断开，新的蛋白质分子则可以占据结合位点，当原吸附的蛋白质的所有结合位点都被新的蛋白质占据时，这个蛋白质就成为第一个释放出的分子直到与表面有强的相互作用的蛋白质全部吸附在材料表面，蛋白质交换的过程才结束。 图3-9一个吸附的蛋白质被交换的过程上述逐级的碰撞、吸附、交换过程称为上述逐级的碰撞、吸附、交换过程称为Vroman效应效应(图图3-1 0) 吸附在材料表面的蛋白质顺序示意(Vroman）效应 实例血液蛋白-材料表面相互作用 血液含有150种以上的蛋白
16、质，可作为多元溶液中蛋白质与外物表面相互作用的一个很好实例。基于质量传输的考虑，具有最高浓度的蛋白质(表3-3)将首先到达表面。 表3-3 最高浓度的血桨蛋白根据最简单的传输形式、纯的扩散，蛋白质吸附的可行性见表3-4。由于白蛋白具有最高浓度和适当的尺寸(扩散系数)，在最初的反应中起决定作用。球蛋白由于其低的浓度和较大的尺寸，到达表面的速率低。 表3-4 表3-3列出的蛋白质的到达速率，基于方程式(3-1)所描述的扩散限制的传质过程以蛋白质分子撞击表面的机会，白蛋白是球蛋白的7倍，而低密度脂蛋白则是白蛋白的11500虽然球蛋白到达表面的速率低于白蛋白，但如果球蛋白分子与表面有较白蛋白更大的表面
17、亲和力，球蛋白也可以与已吸附的白蛋白交换类似地，其他到达表面速率较低的蛋白质，代替预先已经被吸附的分子取决于它们与材料表面的亲和力因而如纤维蛋白原，即使到达表面的速率比白蛋白的1/100还少，但由于比白蛋白与材料表面更大的亲和力最终也可以吸附在材料表面。 然而血浆蛋白在材料表面的分级反应较上述扩散限制的简化过程更复杂(表3-5)由于其亲和性或附加动力学因子(如对流)，不具有最高浓度的蛋白质也可结合于表面蛋白质的吸附可导致凝血，如纤维蛋白原和因子对于决定组织-植入物相互作用具有重要性 表3-5 血浆蛋白在玻璃和金属氧化物上的交换层次 总 结1蛋白质与生物材料的相互作用取决于生物分子与底物双方的性质 影响蛋白质与生物材料相互作用的因素包括蛋白质的尺寸、电荷和结构稳定性表面影响其与蛋白质相互作用的因素包括表面形貌、电荷、化学成分和显微结构蛋白质到达生物材料表面的速率在蛋白质的吸附中也起显著的作用 总 结2蛋白质存在于表面的多种状态取决于蛋白质的取向、表面区域的几何状态及蛋白质的构象变化 蛋白质的脱附需要同时断开蛋白质-表面的结合 蛋白质分子在表面存在的时间越长，越不容易脱附或被其他种类分子替换在多元溶液中，如在真体液中，蛋白质对表面结合位点的竞争导致材料表面蛋白质的碰撞、吸附、交换等一系列反应过程。
