1、 药学科学药学科学 分析化学分析化学 药物分析学药物分析学 药物分析学药物分析学 生物体内药物分析生物体内药物分析 生物体内药物分析生物体内药物分析前前 言言12体内药物分析基本概念体内药物分析基本概念生物样品的种类与采集生物样品的种类与采集生物样品分析的前处理生物样品分析的前处理体内药物分析方法验证体内药物分析方法验证体内药物分析应用示例体内药物分析应用示例3 体内药物分析体内药物分析（Biopharmaceutical Analysis; Biomedical Analysis）是随着临床药理学、生是随着临床药理学、生物药剂学和生物医学等学科的发展和需要而物药剂学和生物医学等学科的发展和需
2、要而建立起来的一门药物分析学的建立起来的一门药物分析学的分支学科分支学科，是，是一门研究生物机体中一门研究生物机体中药物药物及其及其代谢物代谢物和和内源内源性物质性物质的量变与质变规律的分析方法学。的量变与质变规律的分析方法学。体内药物分析的性质体内药物分析的性质体内药物分析体内药物分析基本概念基本概念4通过现代分析技术的各种手段，了解药物进通过现代分析技术的各种手段，了解药物进入体内后在数量与质量上的变化，获得药物入体内后在数量与质量上的变化，获得药物动力学动力学特征、药物特征、药物相互作用相互作用规律、体内规律、体内生物生物转化与代谢途径转化与代谢途径等动态信息；等动态信息；探索涉及药物体
3、内分析的探索涉及药物体内分析的新技术和新方法新技术和新方法；为新药研制、药品生产和临床应用等方面的为新药研制、药品生产和临床应用等方面的研究提供必要的实验研究手段、作出科学的研究提供必要的实验研究手段、作出科学的估计与评价。估计与评价。5药药物物进进入入体体内内药物相互作用药物相互作用药物动力学特征药物动力学特征体内生物转化及代谢体内生物转化及代谢测定生物样本中测定生物样本中药物及代谢物药物及代谢物样品前处理样品前处理纯化富集待测组分纯化富集待测组分定量分析定量分析现代分析技术现代分析技术LC/MS量变量变质变质变61. 1. 研究药物体内过程的重要性研究药物体内过程的重要性2. 2. 与与新
4、药新药研究、临床研究、临床合理用药合理用药、药物药物 滥用滥用、兴奋剂检测兴奋剂检测等密切相关等密切相关体内药物分析的意义体内药物分析的意义体内药物分析体内药物分析基本概念基本概念7示例：水杨酸血药浓度与疗效毒性关系示例：水杨酸血药浓度与疗效毒性关系 药理作用药理作用 有效血药浓度（有效血药浓度（ g/ml） 镇痛镇痛 50 50100100 抗风湿抗风湿 250250 抗炎抗炎 350 350400400 中毒中毒 550550 致死致死 1600 1600180018008兴奋剂检测兴奋剂检测Doping control琼斯承认服用兴奋琼斯承认服用兴奋剂类固醇剂类固醇THG；尿样检查尿样检
5、查Tetrahydrogestrinone，学名为“四氢乙基羟基二降孕三烯炔酮”。 9 1. 体内药物分析方法的研究体内药物分析方法的研究进行生物样品进行生物样品预处理预处理(pretreatment)方法、方法、分离分析实验条件的分离分析实验条件的优化优化选择，考察体内分选择，考察体内分析方法的析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范灵敏度、专属性、准确度、线性范围等围等，为临床药理学、临床药学等相关学科，为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。药物分析方法。体内药物分析的任务体内药物分析的任务体内药物分析体内药
6、物分析基本概念基本概念102. 在临床治疗药物监测在临床治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）中的应用中的应用治疗药物监测即测定血液中或其它体液中药治疗药物监测即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案效果，必要时根据药动学原理调整给药方案; ;方向是实现个体化给药，目的为临床合理用方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。药服务，达到最佳的药物治疗效果。11治疗药物监测治疗药物监测治疗范围治疗范围中毒范围中毒范围无效范围无效范围
7、C最大耐受浓度最大耐受浓度最小最小有效浓度有效浓度治疗药物监测对体内分析方法有特殊要求：治疗药物监测对体内分析方法有特殊要求：即分析方法快速、简便、准确，且血药浓度一般即分析方法快速、简便、准确，且血药浓度一般只需测定特定时间的一次数值只需测定特定时间的一次数值; ;常见方法有常见方法有免疫学、光谱学和色谱学方法。免疫学、光谱学和色谱学方法。12列为治疗监测药物的一般原则：列为治疗监测药物的一般原则：（1 1）有效血药浓度范围较窄、剂量小、毒性大的药物。有效血药浓度范围较窄、剂量小、毒性大的药物。 如地高辛、奎尼丁、庆大霉素等如地高辛、奎尼丁、庆大霉素等。（2 2）药代动力学个体差异大、药理作
8、用强、且难于通）药代动力学个体差异大、药理作用强、且难于通过剂量来控制的药物，过剂量来控制的药物，如三环类抗抑郁药、苯妥如三环类抗抑郁药、苯妥英等英等。（3 3）病理状态（）病理状态（如胃肠道疾病影响药物的吸收、肝脏如胃肠道疾病影响药物的吸收、肝脏疾病影响药物的代谢、肾脏疾病影响药物的排疾病影响药物的代谢、肾脏疾病影响药物的排泄泄），对某些药物进行血药浓度监测。），对某些药物进行血药浓度监测。（4 4）药物的毒副反应与疾病本身症状相似，如）药物的毒副反应与疾病本身症状相似，如地高地高辛辛房颤毒性反应房颤毒性反应，监测血药浓度，增减剂量。，监测血药浓度，增减剂量。133.在药代动力学在药代动力学
9、(Pharmacokinetics)研究中的应用研究中的应用药代动力学研究涉及药物在体内的药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分吸收、分布、代谢与排泄等布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药动态过程，需要研究血药浓度时间曲线的变化，探讨药物分布与药浓度时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系理作用的关系; ;其中生物样品中药物浓度高低差别大，且常其中生物样品中药物浓度高低差别大，且常需同时测定药物及其代谢产物，需同时测定药物及其代谢产物，因此要求体因此要求体内分析方法必须具有足够灵敏度和专属性。内分析方法必须具有足够灵敏度和专属性。14示例：单剂量口服格拉司琼片后人体相对生物利用度研究示例
10、：单剂量口服格拉司琼片后人体相对生物利用度研究 本品是一强效、高选择性的外周神经元和中枢神经系统内本品是一强效、高选择性的外周神经元和中枢神经系统内5-HT3受体拮抗剂。对因化疗、放疗及手术引起的恶心和呕吐具受体拮抗剂。对因化疗、放疗及手术引起的恶心和呕吐具有良好的预防和治疗作用。化疗、放疗及外科手术等因素可引有良好的预防和治疗作用。化疗、放疗及外科手术等因素可引起肠嗜铬细胞释放起肠嗜铬细胞释放5-HT， 5-HT可激活中枢或迷走神经的可激活中枢或迷走神经的5-HT3受体，触发呕吐反射。本品可选择性地阻断这一反射的触发。受体，触发呕吐反射。本品可选择性地阻断这一反射的触发。由于本品的高选择性作
11、用，因而不具有其他止吐药的副作用。由于本品的高选择性作用，因而不具有其他止吐药的副作用。15色谱条件色谱条件 色谱柱：色谱柱：Lichropspher C18柱，柱，50mm4.6mm5m； 流动相：乙腈流动相：乙腈-10MM乙酸铵（乙酸铵（0.5%乙酸）乙酸）=40:60 流速：流速：1.0ml/min，进样量，进样量 20l质谱条件质谱条件 ESI离子源，正离子模式检测；离子源，正离子模式检测； 毛细管电压：毛细管电压：30V 干燥气干燥气 ：氮气：氮气 380；碰撞气：氩气；碰撞气：氩气 MRM方式检测：格拉司琼方式检测：格拉司琼 m/z 313.4138；内标；内标 m/z 27020
12、1 CE电压：电压：16eV（格拉司琼）和（格拉司琼）和10eV（内标）（内标）16格拉司琼格拉司琼内标内标待测样品和内标的典型质谱图待测样品和内标的典型质谱图17血样处理血样处理 取血浆取血浆100l , 置于置于1.5ml EP管中，加入管中，加入50 l 氢氧化氢氧化钠碱化，混匀后加入钠碱化，混匀后加入1 ml乙酸乙酯涡旋乙酸乙酯涡旋2 min 液液萃取，液液萃取，于于3500 rpm离心离心10 min，取上清液，取上清液0.8ml 于于40 水浴下水浴下通氮吹干，残留物以通氮吹干，残留物以50 l 流动相溶解流动相溶解,取上清液取上清液20 l进进样分析。样分析。体内分析方法学评价体
13、内分析方法学评价 线性范围：线性范围：0.02 20.00 ng.ml-1 最低检测限：最低检测限：0.02 ng.ml-1 方法回收率：方法回收率： 97% 基质效应：基质效应：127%133% 日内日间标准差：日内日间标准差：8.4%。18空白血浆空白血浆标准添加标准添加血浆血浆实测血浆实测血浆19受试制剂和参比受试制剂和参比制剂药代动力学制剂药代动力学曲线曲线20格拉司琼片相对生物利用度格拉司琼片相对生物利用度21 4.4.在生物体内内源性物质测定中的应用在生物体内内源性物质测定中的应用体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等胺、肌酐
14、、草酸、尿酸等 机体正常生理机体正常生理条件或机体发生病变条件或机体发生病变 测定体内内源性物测定体内内源性物质或疾病标志物的含量质或疾病标志物的含量 疾病的辅助诊断疾病的辅助诊断或及早预防。或及早预防。兴奋剂检测：兴奋剂检测：睾酮睾酮/表睾酮；去氢表雄酮表睾酮；去氢表雄酮 促红细胞生成素促红细胞生成素EPO22示例：尿液中多胺的气相色谱示例：尿液中多胺的气相色谱- -质谱法测定质谱法测定 多胺包括腐胺（多胺包括腐胺（putrescineputrescine，PutPut）、）、精脒（精脒（spetrmidinespetrmidine， SpdSpd）、）、精胺（精胺（sperminesper
15、mine，SpmSpm）和尸胺（和尸胺（cadaverinecadaverine，CadCad）。）。体液体液中多胺含量的增加，预示着某部分组织生长迅速，或者因恶性肿瘤而中多胺含量的增加，预示着某部分组织生长迅速，或者因恶性肿瘤而促成多胺的增加。因此，测定体液中多胺的含量可以作为临床生化诊促成多胺的增加。因此，测定体液中多胺的含量可以作为临床生化诊断恶性肿瘤的辅助方法。断恶性肿瘤的辅助方法。（1 1）色谱条件）色谱条件 HP-5HP-5（0.2mm0.2mm 25m25m）毛细管柱，毛细管初始柱温为毛细管柱，毛细管初始柱温为110110，以，以2020 minmin-1-1升温至升温至2802
16、80。气化室温度。气化室温度230230，接口温度，接口温度280280。以氦气为载气，流速。以氦气为载气，流速0.8 0.8 mlml minmin-1-1，无分流进样，分流阀切换无分流进样，分流阀切换时间时间0.8 0.8 minmin。电离方式：电子轰击（。电离方式：电子轰击（EIEI），），能量能量7070eVeV，倍增电压倍增电压20002000V V。选择离子检测（选择离子检测（SIMSIM）：）：1 1，3-3-丙二胺丙二胺226226、254254，腐胺（，腐胺（PutPut）226226、267267，精脒（精脒（SpdSpd）226226、254254、536536，精胺（
17、精胺（SpmSpm）226226、254254，尸尸胺（胺（CadCad）226226，内标内标1 1，6 6己二胺己二胺226226、254254。 23（2 2）尿样处理）尿样处理 收集收集2424小时尿样，加盐酸防腐，记总量，取小时尿样，加盐酸防腐，记总量，取5 5mlml于于- -2020冰箱保存待测。取尿样冰箱保存待测。取尿样0.30.3ml,ml,经酸化水解、碱液中和、树脂纯经酸化水解、碱液中和、树脂纯化，化，7070吹干，残留物加乙酸乙酯吹干，残留物加乙酸乙酯100100ll、七氟丁酸酐七氟丁酸酐2525ll，封口封口后后7070反应反应3030分钟。反应液中和后经正己烷分钟。反
18、应液中和后经正己烷二氯甲烷（二氯甲烷（4 4：1 1）提）提取，有机层分离挥干，残留物以取，有机层分离挥干，残留物以5050ll乙酸丁酯溶解乙酸丁酯溶解, ,取取1.01.0ll进样。进样。24（3 3）体内分析方法学评价体内分析方法学评价 线性范围：线性范围：2020 500 500 ngng 线性相关性：线性相关性：r r 0.99 0.99 回收率：回收率： 75%75% 日内日间标准差：日内日间标准差：8.0%8.0%。（4 4）尿样分析）尿样分析 30 30例正常人尿液中多胺含量统计结果（例正常人尿液中多胺含量统计结果（nmol/24hnmol/24h） 1 1，3 3丙二醇丙二醇
19、腐胺腐胺 尸胺尸胺 精脒精脒 精胺精胺 男性（男性（n=15n=15） 6.076.074.05 39.374.05 39.3713.95 9.7913.95 9.798.818.81 （21-4821-48岁）岁） 女性（女性（n=15n=15） 4.454.453.37 28.933.37 28.938.85 11.458.85 11.4510.8610.86 （18-6018-60岁）岁）25体内药物分析的特点体内药物分析的特点 常规药物分析：常规药物分析：原料药物和药物制剂分析原料药物和药物制剂分析 真伪鉴别、纯度检查、含量测定真伪鉴别、纯度检查、含量测定 共存杂质、制剂辅料、复方药物
20、共存杂质、制剂辅料、复方药物体内药物分析：复杂生物样品的微量分析体内药物分析：复杂生物样品的微量分析 药物浓度低药物浓度低 样品采量少样品采量少 干扰成分多干扰成分多 体内药物分析体内药物分析基本概念基本概念26体内药物分析的特点体内药物分析的特点 1、生物样品中、生物样品中药物浓度低药物浓度低，浓度波动范围大浓度波动范围大，对分析方法灵敏度、线性范围要求高；对分析方法灵敏度、线性范围要求高；2、可供分析测定的、可供分析测定的样品量一般较少样品量一般较少，不易重新，不易重新获得，且具有易变化性，应选择合适方法获得，且具有易变化性，应选择合适方法储存并尽快分离检测；储存并尽快分离检测；3、生物、
21、生物样品中样品中干扰杂质多干扰杂质多，分析测定前一般需，分析测定前一般需经过分离、纯化处理；经过分离、纯化处理；体内药物分析体内药物分析基本概念基本概念27 4、选择进行体内分析的方法，在保证一定灵敏度的、选择进行体内分析的方法，在保证一定灵敏度的前提下，前提下，要求简便、快速要求简便、快速，以便迅速为临床用药，以便迅速为临床用药及中毒解救提供参考。及中毒解救提供参考。5、必须必须配备一定的仪器设备，配备一定的仪器设备，包括样品冷藏、萃取、包括样品冷藏、萃取、浓集等辅助设备以及高灵敏度、高专属性的分析浓集等辅助设备以及高灵敏度、高专属性的分析检测仪器。检测仪器。6 6、生物样品分析工作量相对较
22、大生物样品分析工作量相对较大，检测的实验数据，检测的实验数据处理和阐明有时比较困难，需要相关学科的合作处理和阐明有时比较困难，需要相关学科的合作和参与。和参与。28生物样品的种类与采集生物样品的种类与采集 体内药物分析研究体内药物分析研究药物在体内的药物在体内的“命命运（运（fate）”即药物的即药物的吸收、分布、代谢和吸收、分布、代谢和排泄排泄。因此，凡是体内药物到达之处，如。因此，凡是体内药物到达之处，如体液、器官、组织和排泄物等均是体液、器官、组织和排泄物等均是体内药体内药物分析的研究对象。物分析的研究对象。29具体考虑体内药物分析的研究对象即生物体内具体考虑体内药物分析的研究对象即生物
23、体内样品，则需要从生物样品来源、样品种类和检样品，则需要从生物样品来源、样品种类和检测组分三方面来讨论。测组分三方面来讨论。1. 生物样品来源：决定于研究的目的生物样品来源：决定于研究的目的 人体与动物人体与动物 2. 生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物等等3. 检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等30生物样品来源生物样品来源临床前临床前 吸收试验吸收试验 组织分布试验组织分布试验 代谢代谢 排泄排泄 毒代动力学毒代动力学临床临床 临床药代动力学临床药代动力学 制剂生物利用度及生物等效性制剂生物利用度及生
24、物等效性 生物样品的种生物样品的种类与采集类与采集31生物样品种类选取的一般原则：生物样品种类选取的一般原则： （1）必须是能够反映出浓度与药物效应之）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；间关系； （2）易于获得；）易于获得； （3）便于处理，适合于分析；）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。）根据不同目的与要求进行选取。生物样品的种生物样品的种类与采集类与采集32均匀生物样品：均匀生物样品：血液血液（血浆、血清、全血）、（血浆、血清、全血）、尿液尿液、唾液、胆汁、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液、呼出
25、气体液、呼出气体非均匀生物样品：非均匀生物样品：心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织、粪便排泄物脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织、粪便排泄物生物样品种类生物样品种类生物样品的种生物样品的种类与采集类与采集33血液血液自然自然凝结凝结加抗加抗凝剂凝剂离心离心离心离心全血全血上层：上层：血清血清（比血浆少纤维（比血浆少纤维 蛋白原）（蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）下层：血细胞（凝块）上层：上层：血浆血浆 （50%）下层：血细胞下层：血细胞示图全血、血浆和血清之间的关系及其制备示图全血、血浆和血清之间的关系及其制备血
26、样血样Blood34血浆血浆plasma/血清血清serum： 直接与组织液接触并达到平衡，直接反直接与组织液接触并达到平衡，直接反映作用部位药浓变化，血浆的使用频率高于映作用部位药浓变化，血浆的使用频率高于血清血清;全血：全血： 血浆血浆/血清中的药物浓度血清中的药物浓度 + 血细胞血细胞(贮存贮存库，一般无药理作用）中的药物浓度。库，一般无药理作用）中的药物浓度。35特点特点1：尿药浓度通常变化较大；：尿药浓度通常变化较大；特点特点2：尿药大多呈结合状态；：尿药大多呈结合状态；优点优点1：易得，且样品量多；：易得，且样品量多；优点优点2：正常尿液仅含微量蛋白；：正常尿液仅含微量蛋白；缺点缺
27、点1：尿液是一种良好的细菌培养基；：尿液是一种良好的细菌培养基；缺点缺点2：尿液中多具有紫外吸收的化合物。：尿液中多具有紫外吸收的化合物。 尿样尿样Urine36优点优点1：非伤害性采样，且不受时间地：非伤害性采样，且不受时间地 点限制；点限制；缺点缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓；：唾液药浓一般低于血浆药浓；缺点缺点2：某些药物的唾液药浓（：某些药物的唾液药浓（S）与血）与血浆游离药浓（浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相）十分接近，但两者相关系数不明确；关系数不明确；缺点缺点3：pH改变会影响弱酸性和弱碱性改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药浓药物在唾液中的药浓 唾液唾液Saliva3
28、7药物药物S/P值值药物药物S/UP值值卡马西平卡马西平0.37卡马西平卡马西平1.11.4地高辛地高辛0.78地高辛地高辛1.2苯妥英苯妥英0.090.11苯妥英苯妥英1.01.4扑米酮扑米酮0.971.08扑米酮扑米酮0.71.0茶碱茶碱0.500.52茶碱茶碱1.11.5苯巴比妥苯巴比妥0.30-0.38苯巴比妥苯巴比妥0.61.0氨基比林氨基比林0.80乙琥胺乙琥胺0.8安替比林安替比林0.831.0奎尼丁奎尼丁3.6锂盐锂盐2.22.3利多卡因利多卡因7.5S：唾液药浓，P：血浆药浓，UP：血浆游离药浓表表1一些药物的一些药物的S/P值与值与S/UP值值38表表2药物随唾液药物随唾液
29、pH变化的类型变化的类型药物类型药物类型实例实例解离度随唾液解离度随唾液pH变化的变化的苯巴比妥、奎尼丁等苯巴比妥、奎尼丁等解离度不随唾液解离度不随唾液pH变化，但变化，但S/UP值不恒定的值不恒定的锂盐、甲氨蝶呤等锂盐、甲氨蝶呤等解离度不随唾液解离度不随唾液pH变化，且变化，且S/UP值相对恒定的值相对恒定的苯妥英、卡马西平等苯妥英、卡马西平等39检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等 （1 1）原形药物的测定；）原形药物的测定； （2 2）游离药物的监测；）游离药物的监测； （3 3）活性代谢产物的监测；）活性代谢产物的监测； （4 4）药物对映体
30、的监测；）药物对映体的监测； （5 5）作用部位药物浓度的测定；）作用部位药物浓度的测定； （6 6）体内内源性物质的测定。）体内内源性物质的测定。生物样品的种生物样品的种类与采集类与采集40种类种类样品组成样品组成采集采集贮藏贮藏优点优点缺点缺点 血血样样全全血血(血血等等)+药物及代谢药物及代谢物物+结合型结合型采 取 量 限采 取 量 限制制(1ml)、时间限制、时间限制、采 血 人 员采 血 人 员限制限制,根据根据药 物 动 力药 物 动 力学 要 求 确学 要 求 确定 采 样 间定 采 样 间隔及次数隔及次数及时分及时分离血浆、离血浆、血清血清,抗抗凝剂凝剂,短短期期 4 ,长
31、期长 期 -20可以测可以测定游离定游离型与结型与结合型，合型，与作用与作用部位处部位处的浓度的浓度较一致较一致 采 集 、采 集 、前 处 理前 处 理最复杂最复杂血血浆浆(血血等等)+药物及代谢药物及代谢物物+结合型结合型血血清清药物及代谢药物及代谢物物+结合型结合型唾液唾液粘蛋白、酶粘蛋白、酶等等+游离药游离药物物( 无 时 间 限无 时 间 限制制)，刺激少，刺激少的安静状态的安静状态采集采集一般现一般现用用采集最采集最不受限不受限制制仅反映游仅反映游离型离型,变动变动大大,浓度更浓度更低低尿液尿液尿素、盐类尿素、盐类+水溶性药物代水溶性药物代谢产物谢产物+结合结合型型自然排尿、自然排
32、尿、时间尿时间尿防腐剂防腐剂,短期、短期、长期长期量最多，量最多，反映药物反映药物代谢情况代谢情况不能直接不能直接反映血药反映血药浓度浓度41体内药物分析方法学研究体内药物分析方法学研究 血样血样尿液尿液唾液唾液胆汁胆汁组织器官组织器官前处理方法前处理方法 分离分离纯化纯化浓集浓集样品测定样品测定方法建立方法建立方法优化方法优化方法学研究方法学研究灵敏度灵敏度准确度准确度精密度精密度线性和范围线性和范围耐用性耐用性灵敏、准确、快速、简便灵敏、准确、快速、简便生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理42分析过程中的时间消耗分布6%Analysis6%Sample collection61%Sam
33、ple preparation27%Data processing生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理43生物样品的处理一般原则生物样品的处理一般原则生物样品贮存生物样品贮存生物样品均匀化生物样品均匀化结合物水解结合物水解生物基质的性质生物基质的性质测定对象的性质测定对象的性质44生物样品的贮存生物样品的贮存采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织血浆酯酶引起的水解血浆酯酶引起的水解血浆样品血浆样品加入酯酶抑制剂加入酯酶抑制剂微生物导致的腐败微生物导致的腐败尿液样品尿液样品加入防腐剂冷藏加入防腐剂冷藏储存条件储存条件2020：大部分药物：大部
34、分药物8080：阿莫西林等抗生素：阿莫西林等抗生素加稳定剂：卡托普利等加稳定剂：卡托普利等 立即测试：维生素立即测试：维生素C C等等生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理45生物样品均匀化生物样品均匀化体液样品：体液样品：尿液、血浆尿液、血浆涡旋混匀涡旋混匀固体样品：固体样品：组织、粪便组织、粪便加入适量溶剂进行高速匀浆加入适量溶剂进行高速匀浆生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理46结合物水解结合物水解相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物极性大、亲水性、不易于提取富集极性大、亲水性、不易于提取富集酸水解：酸水解：简便、快速，不具备专一
35、性，注意药物是否简便、快速，不具备专一性，注意药物是否被破坏被破坏酶水解：酶水解：- -葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间长，实验费用高间长，实验费用高生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理47酸水解酸水解无机酸，通常用盐酸。使用：酸浓度、酸化无机酸，通常用盐酸。使用：酸浓度、酸化时间、是否加热等因药物而异，需实验确定。时间、是否加热等因药物而异，需实验确定。酶水解酶水解常用的水解酶是常用的水解酶是- -葡萄糖苷酶、硫酸酯酶葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，或两者混合物。使用：控制或两者混合物。使用：控制pH（4.5-7.0），），厌氧温育厌氧温育16小时小时与酸水解
36、相比：酶水解温和、专属性强，一与酸水解相比：酶水解温和、专属性强，一般不会引起药物分解；但试剂较贵、耗时长、般不会引起药物分解；但试剂较贵、耗时长、引入黏液蛋白等杂质，可能导致乳化或堵塞引入黏液蛋白等杂质，可能导致乳化或堵塞生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理48前处理的目的：前处理的目的： 去蛋白，释放药物去蛋白，释放药物 样品纯化和富集样品纯化和富集 满足分析方法灵敏度的需要满足分析方法灵敏度的需要 防止分析仪器的污染和劣化防止分析仪器的污染和劣化 满足大量样品分析的需要满足大量样品分析的需要 微量、快速微量、快速生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理49(碱性药物碱性药物)全血全血
37、/血浆血浆/组织组织(1)蛋白沉淀蛋白沉淀(2)调节调节pH选择性溶剂提取选择性溶剂提取净化净化残渣残渣碱回提物碱回提物酸回提物酸回提物(酸性药物酸性药物)衍生物衍生物化学衍生化化学衍生化(提取烃基化提取烃基化)RIAHPLCUV/荧光荧光/电化学电化学滤液滤液NPRP原型药物原型药物衍生物衍生物GCTLC(FID/ECD/NPD/MS)(光密度法检测或洗提后其它法分析光密度法检测或洗提后其它法分析)示图样品处理步骤与分析方法的选择示图样品处理步骤与分析方法的选择生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理50生物样品前处理方法生物样品前处理方法常用的生物样品预处理方法常用的生物样品预处理方法 沉
38、淀蛋白沉淀蛋白 液液萃取液液萃取 液固提取液固提取51生物样品分析的前处理生物样品分析的前处理沉淀蛋白沉淀蛋白操作：操作： 5050l l血浆血浆150 150 l l甲醇甲醇涡旋涡旋1min1min3500rpm3500rpm离心离心10min10min取上清液进样分析取上清液进样分析常用沉淀剂：常用沉淀剂：与水能混溶的有机溶剂与水能混溶的有机溶剂甲醇、乙腈甲醇、乙腈酸性沉淀剂酸性沉淀剂三氯醋酸、高氯酸三氯醋酸、高氯酸52应用中注意问题：应用中注意问题：去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪器的影响柱和仪器的影响v 色谱峰形色谱峰形v 液质联用分析
39、中的基质效应液质联用分析中的基质效应检测灵敏度是否足够检测灵敏度是否足够生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理53方法方法原理原理常用试剂常用试剂特点特点备注备注有机有机溶剂溶剂蛋白质氢键发蛋白质氢键发生变化而使蛋生变化而使蛋白质凝聚白质凝聚乙腈、甲醇、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醇、丙酮、四氢呋喃等四氢呋喃等两法并用时，两法并用时，药物的回收率药物的回收率高高超速超速离心离心中中性性盐盐蛋白质脱水而蛋白质脱水而沉淀沉淀饱和硫酸铵、硫酸饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐及枸橼酸盐超速超速离心离心强强酸酸强酸可与蛋白质强酸可与蛋白质阳离子形成不溶阳离子形成不溶住盐而沉淀住
40、盐而沉淀三氯醋酸、高氯酸、三氯醋酸、高氯酸、硫酸硫酸-钨酸混合液、钨酸混合液、偏磷酸等偏磷酸等在酸性下分解在酸性下分解的药物不宜的药物不宜超速超速离心离心锌锌盐盐铜铜盐盐金属阳离子与蛋金属阳离子与蛋白质的羧基形成白质的羧基形成不溶性盐而沉淀不溶性盐而沉淀CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等等 超速超速离心离心酶酶解解法法组织酶解，药组织酶解，药物析出物析出蛋白水解酶中蛋白水解酶中的枯草菌溶素的枯草菌溶素酸不稳定及蛋白结酸不稳定及蛋白结合牢的药物；不适合牢的药物；不适于碱性水解药物于碱性水解药物无需无需离心离心54沉淀剂沉淀剂每每1容积血浆加入沉淀剂容积容积血浆加入沉淀剂容积0.21.
41、02.03.04.0甲醇甲醇17.673.498.798.999.2乙腈乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐钨酸盐-硫酸硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和饱和)硫酸铵硫酸铵21.353.498.3*CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定55示例示例 血浆样品中虎杖苷前处理方法血浆样品中虎杖苷前处理方法A A：虎杖苷
42、标准对照品：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供由海王集团技术中心天然药物室提供3 3，4 4，5-5-三羟基芪三羟基芪-3-D-3-D-葡萄糖苷葡萄糖苷 Mr390Mr390 B B：二苯乙烯苷化学对照品：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供由中国药品生物制品检定所提供 2 2，3 3，5 5，4 4- -四羟基二苯乙烯四羟基二苯乙烯-D-D-葡萄糖苷葡萄糖苷 Mr406Mr40656SDSD大鼠血浆样品：大鼠血浆样品：乙腈乙腈沉淀蛋白沉淀蛋白；操作简便快速，适用于大量样品；存在色谱柱污染和不；操作简便快速，适用于大量样品；存在色谱柱污染和不可逆堵塞可逆堵塞色谱柱
43、：色谱柱：DiamonsilDiamonsilTMTM C18 C18（5 5m m ，2002004.6mm4.6mm），），SupelcoSupelco保护柱保护柱流动相：甲醇流动相：甲醇- -水（水（35653565），流速：），流速：1.0ml/min1.0ml/min紫外检测波长：紫外检测波长：290nm(0.0005aufs)290nm(0.0005aufs)柱温：柱温：252511J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245 IFIF20092009 2.453 2.453蛋白沉
44、淀蛋白沉淀SDSD大鼠血浆大鼠血浆57示例：人血浆中福多司坦的高通量分析示例：人血浆中福多司坦的高通量分析福多司坦福多司坦内标内标色谱柱：色谱柱：50mm4.6mm i.d. CN柱柱流动相：甲醇流动相：甲醇-水水 =60/40(含含0.005甲酸甲酸)前处理方式：前处理方式：50 l血浆蛋白沉淀血浆蛋白沉淀 96孔板操作孔板操作 实现规模化的样品前处理实现规模化的样品前处理结果：福多司坦结果：福多司坦tR2.4min 每个样品分析周期每个样品分析周期3min LLOQ0.02g/mlJ Chromatogr B. 2008, 867:153-159. IF2009 2.777 58沉淀蛋白后
45、过滤96孔蛋白沉淀板生物样品分析生物样品分析的前处理的前处理59与传统的蛋白沉淀相比具有以下优点：与传统的蛋白沉淀相比具有以下优点：引起较小的紫外检测和质谱检测的干扰引起较小的紫外检测和质谱检测的干扰节约预处理时间，具有较大样品通量节约预处理时间，具有较大样品通量便于实现自动化，便于与便于实现自动化，便于与9696孔自动进样器匹配孔自动进样器匹配引起柱压的较小波动，保护色谱柱引起柱压的较小波动，保护色谱柱 过滤过滤 离心离心60示例：大鼠血浆中海洋环肽示例：大鼠血浆中海洋环肽PK13PK13的高通量分析的高通量分析色谱柱：色谱柱：Ultimate XB-C18，5m，50mm4.6mm i.d
46、流动相：甲醇流动相：甲醇:水（水（85:15，v/v），流速为），流速为0.3ml/min 进样量进样量20 l前处理方式：前处理方式：50 l血浆蛋白沉淀后过滤血浆蛋白沉淀后过滤 96孔蛋白沉淀板操作孔蛋白沉淀板操作 实现规模化的样品前处理实现规模化的样品前处理Anal Bioanal Chem 2009, 395:1461-1469. IF2009 3.48 HNHNNHNNHNNHOOOOOOONHH3CCH3H3COHPhakellistatin类化合物是从类化合物是从Phakellia属海属海绵中分离得到的一类富含脯氨酸残基的环绵中分离得到的一类富含脯氨酸残基的环肽类化合物。肽类化合物。61p不同操作方式同时对提高回收率减少基质效应起到良好作用p传统 50l血浆+200l甲醇（含内标20ng/ml）振摇5min 离心15min 取上清进样pSirocco 200l甲醇（含内标20ng/ml）+ 50l血浆振摇5min 真空抽滤直接进样62复习思考题复习思考题1、体内药物分析的性质与特点？、体内药物分析的性质与特点？2、常见生物样品有哪些？、常见生物样品有哪些？63
