1、细菌的革兰氏染色 一、目的：一、目的： 学习细菌的革兰氏染色法。学习细菌的革兰氏染色法。二、原 理 革兰氏染色法革兰氏染色法：是是18841884年由丹麦病理学家所创立的。革兰年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G G+ +）和革和革兰氏阴性菌兰氏阴性菌（G G）两大类，该染色法所以能将细菌分为两大类，该染色法所以能将细菌分为G G+ +菌和菌和G G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。定的。肽聚糖（肽聚糖（15-50层）层）细胞膜（双层脂质细胞膜（双层脂质 蛋
2、白嵌镶）蛋白嵌镶）脂质脂质蛋白质蛋白质-1,4-1,4糖苷键糖苷键N-乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸四肽链四肽链五肽桥五肽桥外膜外膜肽聚糖（肽聚糖（1-3层）层）细胞膜细胞膜脂质脂质蛋白质蛋白质脂质双层脂质双层脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖 区别要点区别要点 革兰阳性菌革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌 肽聚糖组成肽聚糖组成 聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 聚糖骨架、四肽侧聚糖骨架、四肽侧链链 肽聚糖层数肽聚糖层数 可多达可多达50层层 仅仅1-2层层 肽聚糖含量肽聚糖含量 占细胞壁干重占细胞壁干重50%-80% 占细胞壁干重占细胞壁干重5%-10% 强
3、度强度 较坚韧，三维立体结构较坚韧，三维立体结构 较疏松，二维平面结构较疏松，二维平面结构 磷壁酸磷壁酸 有有 无无 外膜外膜 无无 有有 青霉素、溶菌酶青霉素、溶菌酶 敏感敏感 不敏感不敏感 G G+ +菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫晶紫- -碘复合物的逸出，还是原来的颜色；碘复合物的逸出，还是原来的颜色；G G 细菌的细菌的细胞壁肽聚糖层较薄，含量
4、较少，而脂类含量高，当细胞壁肽聚糖层较薄，含量较少，而脂类含量高，当酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，结晶酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，结晶紫紫- -碘复合物也随之被抽提出来，故碘复合物也随之被抽提出来，故G G 细菌细菌菌体细菌细菌菌体呈复染液的红色。呈复染液的红色。1234？结晶紫结晶紫碘液碘液酒精酒精复红复红三、实验器材三、实验器材 1 1、活材料活材料：培养：培养2424小时的大肠杆菌和葡萄小时的大肠杆菌和葡萄球菌。球菌。 2 2、染色液和试剂染色液和试剂：结晶紫、碘液、：结晶紫、碘液、95%95%酒酒精、石炭酸复红精、石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚、蒸馏水、乙醚- -
5、乙醇混乙醇混合液、香柏油。合液、香柏油。 3 3、器材器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。酒精灯、擦镜纸、显微镜。 （1 1）涂片涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按央加一滴蒸馏水，按无菌操作法无菌操作法取大肠杆菌取大肠杆菌涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。 （2 2）晾干晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。焰上方文火烘干。 （3 3）固定固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰过火
6、焰2-32-3次固定（以不烫手为宜）。次固定（以不烫手为宜）。四、实验方法：四、实验方法：（4 4）结晶紫染色结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色晶紫染色液染色1 1分钟分钟；水洗：倾去染色液，；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。用水小心地冲洗。（5 5）媒染媒染：碘液，媒染：碘液，媒染1min1min；水洗：用水；水洗：用水洗去碘液。洗去碘液。 （6 6）脱色脱色：将玻片倾斜，连续滴加：将玻片倾斜，连续滴加95%95%乙醇乙醇脱色脱色202025s25s至流出液无色，立即水洗。至流出液无色
7、，立即水洗。 （7 7）复染复染：滴加复红复染：滴加复红复染3-5min3-5min；水洗：；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。用水洗去涂片上的复红染色液。 （8 8）晾干晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。：将染好的涂片用吸水纸吸干。 （9 9）镜检镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。色反应性。 革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌（10)实验完毕后的处理：实验完毕后的处理： 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.a.先用擦镜纸将油镜头
8、上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.b.用擦镜纸沾少许用擦镜纸沾少许乙醚乙醚- -乙醇混合液（二甲乙醇混合液（二甲苯）苯）将镜头擦将镜头擦2-32-3次。次。 c.c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦2-32-3次。注意次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。轻拿，按号放入显微镜柜中。 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。净，放入回收容器内。五、注意事项 1 1. .革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色。如脱色过。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。量多少等因素的影响，难以严格规定。 2.2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。释而影响染色效果。
