1、药品质量标准分析方法验证及检验知识培训1、分析方法的验证2、分析方法的确认3、分析方法的转移4、方法验证、方法确认和方法转移的文件管理第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证主要包括以下内容：主要包括以下内容：l第十二条 质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；l第一百三十九条 企业的厂房、设施、设备和检验仪器应当经过确认，应当采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。l第一百四十二条 当影响产品质量的主要因素，如原辅料、与药品直接接触的包装材料、生产设备、生产环境（或厂房）、生产工艺、检验方法等发生变更时，
2、应当进行确认或验证。必要时，还应当经药品监督管理部门批准。l第一百四十三条 清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范法规要求：药品生产质量管理规范l第一百四十七条 应当根据确认或验证的对象制定确认或验证方案，并经审核、批准。确认或验证方案应当明确职责。l第一百四十八条 确认或验证应当按照预先确定和批准的方案实施，并有记录。确认或验
3、证工作完成后，应当写出报告，并经审核、批准。确认或验证的结果和结论（包括评价和建议）应当有记录并存档。l第一百四十九条 应当根据验证的结果确认工艺规程和操作规程。l第一百六十二条 质量标准、工艺规程、操作规程、稳定性考察、确认、验证、变更等其他重要文件应当长期保存。l第二百二十三条 物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：l（一）企业应当确保药品按照注册批准的方法进行全项检验；l（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范法规要求：药品生产质量管理规范l1.采用新的检验方法；l2.
4、检验方法需变更的；l3.采用中华人民共和国药典及其他法定标准未收载的检验方法；l4.法规规定的其他需要验证的检验方法。l（三） 对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；l（ 四）检验应当有书面操作规程，规定所用方法、仪器和设备，检验操作规程的内容应当与经确认或验证的检验方法一致；l第二百三十条 产品的放行应当至少符合以下要求：l（一）在批准放行前，应当对每批药品进行质量评价，保证药品及其生产应当符合注册和本规范要求，并确认以下各项内容：l1.主要生产工艺和检验方法经过验证；第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药
5、品生产质量管理规范法规要求：药品生产质量管理规范l方法验证就是根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用分析方法是否符合检验项目的要求。 建立质量标准时，应对分析方法中的各检验项目进行完整的验证； 当药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法修订时，可根据变更的内容决定对分析方法进行部分验证还是完整的验证； 当原料药合成工艺发生变更时，可能引人新的杂质，杂质检査方法和含量测定方法的专属性就需要进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成分的含量测定应无干扰； 当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液
6、相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、定量限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后的分析方法的合理可行； 当变更达到一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变，则应按新方法进行完整的验证。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l方法验证的一般原则：方法验证的一般原则：l通常情况下，分析方法需进行方法验证。对于仅需按照实验室日常测试操作步骤即可测定的检验项目不需要进行验证，如外观、崩解时限、密度、重量、pH值、灰分、装量等。l方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。l同一分析方法用
7、于不同的检验项目会有不同的验证要求。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l需要验证的检验项目需要验证的检验项目l检验项目是为控制药品质量，保证药品安全有效而设定的测试项目。根据检验项目的设定目的和验证内容的不同要求，将需验证的检验项目分为四类： 鉴别试验； 杂质的限度检查； 杂质的定量测定； 含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。l除此之外还有一些物理项目的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其他检验项目有所不同，通常其分析方法验证应有不同的要求。l
8、鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其他物质。用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l杂质检査主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质、有机杂质等。杂质检查分为限度检査和定量测定两部分。用于限度检査的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性。l含量测定对准确度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性等要求。l中国药典2010年版中规定了不同的检验项目需要验证不同的内容，详见下表：第一部分：药
9、品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l检验项目和验证内容第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证验证内容检验项目鉴别杂质测定含量测定定量限度准确度否是否是精密度重复性否是否是中间精密度否是*否是*专属性*是是是是检测限否是*是否定量限否是否否线性否是否是范围否是否是耐用性是是是是备注：1. * : 已有重现性验证，不需验证中间精密度；2. * ：如一种方法不够专属，可由其他分析方法予以补充；3. * ：视具体情况予以验证；4. “是” 代表该项内容需要验证，“否” 代表该项内容不需要验证。l方法验证内容（本次主要介
10、绍方法验证内容（本次主要介绍HPLCHPLC法含量测定方法的验证过程）法含量测定方法的验证过程）l1 1、色谱方法开发流程主要包括以下步骤：、色谱方法开发流程主要包括以下步骤：l选择分离模式l选择色谱柱和填料规格l选择流动相溶剂l如果分离模式需要，调节流动相的pH值l进行等度或梯度初步实验，以确定边界条件l优化实验条件第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l模式选择模式选择l通常分离模式是由以上因素决定：目标物的类型和溶解度、目标物分子量（MW）、样品基质以及可使用的固定相和色谱柱。l如：分子量2000在有机相中选择正相、反相，在水相中选择反相、离
11、子对试剂反相或离子交换；分子量2000在有机相中可选择凝胶渗透，在水相中选择凝胶过滤、大孔填料的离子交换或大孔填料的反相色谱。l又如：在水相/有机相中单糖和二糖可采用正相氨基、离子交换，多环芳烃采用反相C18，有机酸采用配位相互作用反相离子对，碱性、极性化合物采用极性反相C8、C18或反相C18离子抑制，位置异构体采用反相C8，强极性化合物采用HILIC模式；在有机相非极性化合物采用正相Si，极性化合物采用正相氨基、氰基。在水相中合成的多分散性聚合物并限定分子量范围采用体积排阻，合成多肽采用反相，聚合物采用水相GPC，重组多肽和Pr采用反相、阴离子或阳离子交换；在有机相中合成的多分散性聚合物和
12、其它可溶于有机溶剂的聚合物采用凝胶渗透，低聚物采用反相。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l选择色谱柱和填料规格选择色谱柱和填料规格l通常我们需考虑色谱柱固定相孔径、填料的粒径、长度和内径。l要进行高通量分析可采用小粒径短柱（如亚2m）l若对包括多种组分的样品进行复杂的分离，可以选择小颗粒长柱。l若要进行高灵敏度分析可采用2.1mm内径的色谱柱。l填料的孔径非常用重要，因为待测分子必须与多孔结构“相匹配”，才能与固定相发生相互作用。较小孔径的填料（孔径80到120）适合分离分子量2000以下的小分子，对于分子量超过2000的较大分子，需要使用较
13、大孔填料；例如：分离Pr的常孔径是300。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l选择流动相溶剂（介绍反相）选择流动相溶剂（介绍反相）l流动相主要由两部分组成：l1、水：可含缓冲液，或用酸或碱调节pH值l2、可与水混溶的有机溶剂l反相色谱有多种用途，有时在同一色谱分析中就可以分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子。一般来说，对于可离子化的化合物，为了增加保留和改善峰形，我们会在流动相中加入改性剂，以抑制离子化，减弱其极性，使其保留更强。l一般来说，反相 LC 的流动相包括水（190nm）和作为改性剂的乙腈（190nm）或甲醇（205nm）,不太常
14、用的改性剂还有四氢呋喃（THF 212nm ）和异丙醇（205nm） 。l选择性差异和样品的保留都会因流动相不同而明显改变。样品溶解度也很可能不同，需要使用特殊的溶剂或多种溶剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化。在这类反相系统中，控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l用流动相改性剂控制用流动相改性剂控制pHpHl流
15、动相pH对色谱分离的影响有多种方式。根据所分析的化合物，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。l如果是酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能够有效地选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值的 +/-1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围从pH3.8-5.8。甲酸盐的酸性较大，缓冲范围为pH2.8-4.8。l对于碱性化合物而言，在高pH条件下才能得到其非离子化形态，但这对色谱柱不利。但许多碱性化合物在低pH条件下的保留就已经足够了。因此，虽
16、然非离子化形态能得到更高的保留，但这对与所有的碱性化合物并不是实用和必要的。lUV 检测器常用的缓冲液：磷酸及其盐类具有良好的低UV透光率（200nm），和乙腈（190nm）一起，成为许多方法开发工作者的首选。对碱的分离，可以选择 TEA（200nm）-磷酸盐。磷酸盐在有机相比例高的溶剂中溶解度较低，针对这一缺陷，建议磷酸盐缓冲液与有机溶剂混合时，有机相不要超过70%。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l优化反相色谱条件优化反相色谱条件l在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据最终目标决定
17、的。如果要开发质量控制方法，您可能会需要像等度分离这种可变因素较少的方法。如果目标是得到最高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱使所有组分都得到最大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多保留不同的目标化合物的复杂样品，用等度分离可能不能解决问题，应开发并优化梯度方法。l等度优化的一般方法是不断改变流动相强度（%B），直到获得适当的保留范围。这种方法有时也称为“溶剂筛查”。对于简单的分离，k 值应在 1 到 10 之间。如果 k 值太低（比如， 10），分析时间将变得过长，检测限会因峰展宽而提高。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验
18、证方法验证方法验证l对于反相色谱中的等度方法开发是从流动相有机改性剂最高比例开始，然后逐渐降低。在降低流动相强度之前，先要确定所有组分都已从柱中洗出。如果组分保留在色谱柱中，以后可能在B相比例较低的流动相中洗脱，成为无法解释的“鬼峰”。通常，流动相以+/-10%（如，90%B、80%B、70%B等）或 +/-20%的幅度改变。l一旦建立优化条件，如果目标还没有得到完全分离，则需继续提高选择性 ()。如需分离两个相邻的色谱峰会涉及到许多实验参数的调节。温度可以作为一个变量。大多数现代仪器都具有某种类型的柱温控制器，大部分反相柱可以承受高达60的温度，有些甚至更高。一般来说，升高温度可以缩短所有峰
19、的保留时间，但对有些峰的影响可能与对其它峰不同，从而导致选择性发生变化。l其它用于改变选择性的变量如下：l1. pH（对于可离子化的化合物）l2. 缓冲液（离子）强度l3. 缓冲液类型（比如，磷酸盐、醋酸盐或甲酸盐，取决于需要的pH范围）l4. 流动相有机改性剂（比如，从乙腈变为甲醇或两者的混合液）l5. 流速（一般而言，较低的流速可能对分离略有改善）l6. 离子对试剂浓度（如果使用离子对 RPC）第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l如果调节这些参数还不能改善分离，那么最好的解决办法就是改变色谱柱或固定相。更长的色谱柱具有更多塔板数，因此有助于
20、分离，但切记，分离度只能增加长度的平方根。柱长加倍使分析时间和溶剂消耗加倍，而灵敏度降低，但只能使分离度提高约40%。l梯度优化 对于含各种组分的样品混合物来说，选择单一流动相组分可能得不到满意的解决方案。例如，某些样品组分，如强极性分析物，可能很快从反相柱上被洗脱下来，而疏水性组分可能在疏水性的C8或C18上吸附非常强，洗脱不下来。对这一问题的解决方案是随时间改变流动相组成（梯度洗脱）。在绝大多数例子中，初始流动相非常弱（比如，含水量高），随时间的推移，有机溶剂的百分比通常是以线性形式增加。如使用了宽范围的快速梯度（比如，10分钟内B由5%变到95%），确定目标化合物的最佳梯度范围。找到目标
21、峰洗脱的流动相比例，然后通过下一次梯度，调节k*范围，让梯度分离在合理的时间内完成。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l方法开发过程需满足条件： 理论板数：一般要求3000或4000 分离度：一般要求1.8，实际研究尽量2.0 托尾因子：一般要求0.951.05之间 待测物保留时间：最好调至20分钟左右（根据分离度）第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l2 2、供试品溶液制备：、供试品溶液制备：化药一般直接用水、相应的溶剂或流动相溶解即可；而中药一般过程相对复杂，现以中药的制备进行说明，包括以下过
22、程。l提取溶剂选择l提取方式l提取时间第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l提取溶剂选择提取溶剂选择l一般选择80%甲醇、50%甲醇、乙醇等（注意100%强溶剂的色谱峰过早洗脱现象）；l选择溶剂时，固定提取方式和提取时间（一般超声30分钟），看哪种溶剂提取含量高，证明效果好，为最佳提取溶剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l提取方式选择提取方式选择l一般回流提取1小时、超声30分钟、冷浸8小时等（各条件需验证）；l如：提取溶剂为80%甲醇，在以上三条件下确定最佳提取方式；l经验：一般回流提取1小
23、时与超声30分钟比较接近，由于超声比较方便，故一般选择超声提取（注意超声提取功率、频率、时间的选择）；l有些较坚硬的样品，如三七、郁金、莪术粉等，一般选择回流提取；l有些较难提取的样品可能需回流和超声提取配合使用；l有些化学药品超声后含量会降低（破坏分子结构）；l通常冷浸效果不好（现药典很少单独采用此法），有些样品需冷浸同超声或回流配合应用，以达到良好的提取效果；有些样品如母丁香等含易挥发的成分冷浸效果好，另外挥发油一般用冷浸。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l提取时间选择提取时间选择l在确定提取溶剂及提取方式后，通过实验确定提取时间；l如实
24、验设定：分别提取20分钟、30分钟、40分钟甚至50分钟，测定含量，通过含量多少确定最佳提取时间；l下图：提取20分钟与30分钟样品含量无较大差异，为了确保提取完全，选择30分钟（需考虑天气、制粒等因素的差异，故选择30分钟）。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l提取容器选择提取容器选择l一般选择用锥形瓶或容量瓶l锥形瓶：样品不完全溶解于提取溶剂l方法：取一定量样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量提取溶剂，称定重量，超声（或回流）提取一定时间，取出，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。l容量瓶：样品
25、全部溶解于提取溶剂l方法：取一定量样品，精密称定，置量瓶中，加入提取溶剂适量，超声（或回流）提取一定时间使样品溶解，放冷，用提取溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。l注意：若不完全溶解于提取溶剂的样品采用容量瓶法，则检测结果可能会偏高。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l3 3、方法验证内容、方法验证内容l专属性l检测限（LOD）与定量限（LOQ）：含量测定不用做此项，杂质定量需做此项；l线性l精密度：包括重复性试验及中间精密度试验，已有重现性不需再验证中间精密度；l准确度l范围l耐用性l含量测定第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部
26、分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l专属性专属性l专属性系指在其他成分（如：杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。通常，鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。l方法1：在杂质可获得的情况下，可向试样中加人杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。l方法2：在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检
27、测进行峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l专属性专属性l中药复方可做阴性对照样品：阴性对照色谱图中，在与对照品相应位置无色谱峰，则无干扰。l中药复方有阴性干扰是很常见的事，含测是只要阴性干扰不大于5的话，是可以接受的。具体做法是：将那个“小包”也通过积分，计算其峰面积，再根据你样品和阴性样品的取样量分别计算该成分的含量，阴性中该成分含量应低于样品含量的5；如果大于5说明专属性不强，实在没办法以别的成分定量的话，就只能做双阴性了，但法规上有一些矛盾。l色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说
28、明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法的分离度应符合要求。代表性图谱包括：阴性对照色谱图、对照品色谱图、供试品DAD图、对照品DAD图、质谱图及各条件下的破坏性实验图谱等。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l检测限（检测限（LODLOD或或DLDL ）：含量测定可不验证）：含量测定可不验证l检测限系指试样中的被测物能够被检测出的最低量。l药品的杂质测定，应通过测试确定方法的检测限。l方法1：非仪器分析目视法l用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。l方法2 :信噪比法l用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试
29、样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较（现仪器一般不需做空白样品，可直接计算出信噪比），计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。l数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l定量限（定量限（LOQLOQ或或QLQL）：含量测定可不验证）：含量测定可不验证l定量限系指试样中的被测物能够被定定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。l杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。l信噪比法：一般以信噪比为10:1时相应浓
30、度或注人仪器的量确定定量限。l数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l线性线性l线性系指在设计的测定范围内，检测结果与试样中被测物的浓度直接呈正比关系的程度。l线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。l验证方法l应在规定的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5 个浓度的供试样品，每个浓度各一份，每份供试样品检测3 次，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行
31、线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l线性线性l通常做法l（1）如上：取不同浓度的标准品溶液（不少于5个浓度），分别进样相同体积，然后计算进样量与峰面积之间的线性关系；l（2）取同一浓度的标准品溶液，分别进样不同体积（不少于5个体积），然后计算进样量与峰面积之间的线性关系。l个人认为：第（2）种更科学，包括样品量的变化，进样体积的变化，但从药审角度来看，更青睐于第一法 ，因为第一法是单因子考察。l一般情况：直线40%设为常量，最高量为常量的2.5倍，最低量为常的1/4倍，点数一般57个。
32、l如：分别精密量取标准品贮备液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，混匀l其中4ml配制的浓度为常量浓度第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l线性线性l通常做法l若为新药，常量浓度如何确定？l可通过3根不同填料色谱柱，确定尖峰（非平头）最大浓度，同时需综合考虑样品制备过程。l常量为最大浓度的40%l最小量为确定常量的1/4l进样量l常量：20ll故一般体积进样：则为5l、10l、20l、30l、40l、50ll常量：10ll故一般体积进样：则为2.5l、5l、10l、15l、20l、25l第一部分：药
33、品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l线性线性l线性范围要足够宽，含量测测至少80%120%，但药材有时特别低，所以药材要保证最低点在线性范围内。l不同分析方法的线性验证和准确度验证需涵盖的最低浓度范围l 第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l线性线性l数据要求l应列出回归方程、相关系数和线性图。l可接受标准：r值在0.9995以上，Y轴截距应在100响应值的2以内。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，
34、经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。l精密度与准确度不同，下图形象地描绘了精密度和准确度之间的差别。精密度体现了多次重复测定同一被分析物时各测定值之间的接近程度，但它不能表达与已建立的真实值或参考值之间的符合程度，后者由准确度来测定。通过一系列的测定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定与真实值或参考值相符，在这种状况下，需要修改方法以消除偏差。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l精密度与准确度关系图第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药
35、品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l验证方法l精密度可从重复性、中间精密度、重现性三个层次考察。l重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。l重复性需考察以下两方面：仪器精密度和方法精密度l仪器精密度：考察仪器（包括进样器）、色谱柱、流动相、样品与色谱条件之间是否符合要求。l考察方法：取同一标准品溶液，连续进样6针，测得峰面积或峰高，计算RSD%值。l可接受标准：RSD%2.0 n6 第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l方法精密度：在考察仪器精密度的基础上，考察所拟定的方法是否符合精密度要求，包
36、括称量，制备及测定过程。l考察方法：取同一样品，在规定范围内，至少用9 个测定结果进行评价。例如：设计3 个不同浓度，每个浓度各分别制备3 份供试品溶液或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6 次的结果进行评价。l可接受标准：RSD%2.0 n6 第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员、用不同设备测定结果之间的精密度。l验证方法：为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。取同一批样品，采用同一根色谱柱，于不
37、同日期、由不同分析人员、在不同设备上考察含量结果。l可接受标准：RSD%2.0 n4第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l精密度精密度l重现性：在不同实验室之间由不同分析人员测定结果之间的精密度。l验证方法：法定标准采用的分析方法或在不同实验室之间进行方法转移时，应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果。协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中，应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。l可接受标准：RSD%2.0 n4第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分
38、：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l准确度准确度l准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率表示。准确度应在规定的范围内测试。l准确度是定量测定的必要条件，因此含量测定、杂质定量测定均需验证准确度。l验证方法l准确度应在规定的范围内建立，至少用9个测定结果进行评价。例如：测定含量的准确度，按标示量的80%，100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。l原料药含量测定准确度验证方法：l方法1：用已知纯度的对照品或供试品进行测定l方法2：用本法所得结果与已知准确度的另一方
39、法测定的结果进行比较第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l准确度准确度l制剂含量测定准确度验证方法：l方法1 : 用含已知量被测物的各组分混合物进行测定l方法2 : 如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加人已知量的被测物进行测定。（加样回收试验，一般用于中药）l方法3 : 用本法所得结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较l特别说明一下中药的加样回收试验：l用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试
40、验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之各必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l准确度准确度l加样回收计算公式第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l准确度准确度l数据要求：l在规定的范围内，取同一浓度（100%）的供试品，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度（80%、100%、120%），每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所
41、取供试品含量之比控制在11左右。应报告供试品的取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差或可信限。l可接受标准：l回收率（%）平均值在98.0%102.0%之间lRSD%2.0 n9（或n6）l浓度与回收率关系-美国官方分析化学师协会（AOAC）.gif第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l范围范围l范围系指能够达到一定的精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。l范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。l对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范
42、围应大于被限定含量的区间。l可接受标准：l至少标示量（100%溶液）的80% 120%l不需另做测试，写出结论。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l耐用性耐用性l耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。l开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，则建议在方法中予以写明。l方法耐用性影响因素：l典型影响耐用性的变动因素：1、被测溶液的稳定性；2、样品的提取次数、时间等（
43、前面已讲过）；l液相色谱法（HPLC) 中的典型影响耐用性的变动因素：1、流动相的组成；2、流动相的pH值；3、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱；4、柱温；5、流速；6、其他第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l耐用性耐用性lHPLC含量方法耐用性考虑因素及变化范围示例：l流动相的组成：有机相的5%，例如方法规定流动相缓冲溶液与甲醇的比例为4555 ,那么允许使用4060至5050范围的比例；l流动相的pH值：0.5,如果巳知pH值为关键影响因素，变化范围会更小（ 0.2 ）；l色谱柱：3种不同填料的色谱柱l柱温：5l检测波长： 5nml流速：
44、20%l一般对照及样品各一个，每个进2针；l可接受的标准为：l主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据的相对标准差应不大于2.0%。 第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l耐用性耐用性l溶液稳定性研究：l溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。l样品溶液和标准品溶液依据方法进行配制和分析。在室温或其他条件下（如冰箱28)储存适当的时间。每个间隔点，用新鲜配制的标准品溶液做对照，测定储存
45、的样品溶液和标准品溶液。测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。l方法：l标准品溶液稳定性考察：如上过程即可第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l耐用性耐用性l样品溶液稳定性考察：取供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、 16h、18h、24h进样测定峰面积或峰高，计算RSD%值， 要求RSD%2.0；l注意事项：l样品溶液稳定性考察时间要足够长，如测定三七总皂苷进样一针约需1.5小时，若溶液稳定性考察8小时，则配制的样品第7针数据即为无效数据。l有些样品，如
46、在4小时内峰面积发生较大变化，则样品需在避光或低温下测定（需考察）；若在避光或低温下8小时至少4小时稳定，则需在拟定的标准项下注明条件；若在避光或低温下4小时内仍不稳定，则需在拟定的标准项下注明配制后立即测定或临用新制。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l含量测定及限度的制定含量测定及限度的制定l含量测定要求：l（l）应首选处方中的君药（主药）、贵重药、毒性药制订含量测定项目。如有困难时则可选处方中其他药味的已知成份或具备能反映内在质量的指标成分建立含量测定。如因成品测定干扰较大并确证干扰无法排除而难以测定的，可测定与其化学结构母核相似，分子量
47、相近，总类成份的含量或暂将浸出物测定作为质量控制项目，但必须具有针对性和控制质量的意义。（2）含量测定方法可参考有关质量标准或有关文献，也可自行研究后建立，但均应作方法学考察试验。（3）含量限（幅）度指标，应根据实测数据（临床用样品至少有三批、6个数据，申报生产用样品至少有10批、20个数据）制订。含量限度一般规定低限，或按照其标示量制订含量测定用的百分限（幅）度。毒性成分的含量必须规定幅度。（4）含量限度低于万分之一者，应增加另一个含量测定指标或浸出物测定。（5）在建立化学成分的含量测定有困难时，可考虑建立生物测定等其它方法。 第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法
48、验证方法验证方法验证l含量测定及限度的制定含量测定及限度的制定l限度的制定：l各批次样品检测数据比较接近，则取其平均值下调15%；l各批次样品检测数据相差较大，则取80%的数据为低限； 80%的数据为20个数据中，最后4个较低数据不要，倒数第5个数据为限度（该方法一般用于药村或稳定性不好的制剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证方法验证l含量测定及限度的制定含量测定及限度的制定l另外说明：l做标准时药材检测及样品含量限度的复核：l投料药材均需留样检测，10批样品需有10批药材数据，药材检测后计算转移率。第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质
49、量标准分析方法验证方法验证方法验证l原则：l原药材直接粉碎投料的制剂：转移率应大于80%；（制剂10%、检验10%损失）l原药材经一步提取的制剂：转移率应大于60%70%；l原药材经多步提取的制剂：转移率应大于50%60%；l如复方丹参片中丹参酮A的转移率为22%也允许。l方法确认适用范围方法确认适用范围l适用于：物料和产品中不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定标准。通过方法确认来证明方法在本实验室条件下的适用性。l不适用于：实验室日常测试操作步骤不需要进行方法确认，例如（包括但不限于）干燥失重、炽灼残渣、各种湿法化学步骤如酸值和简单的仪器方法如pH计，除非有特殊要求。l确认
50、方式确认方式l通常采用以下两种方式：l方式一：由两名检验人员分别独立对同一批产品进行检验（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性。l方式二：根据验证目的和评估结果选择相关项目进行确认，如下表：第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法确认方法确认l检验项目确认内容示例（仅供参考）检验项目确认内容示例（仅供参考）第一部分：药品质量标准分析方法验证第一部分：药品质量标准分析方法验证方法确认方法确认l方法转移是在两个实验室之间进行，通过比较转出方和接受方两实验室的分析结果，以确认分析方法在接受方实验室条件下的适
