1、Unravelling biologicalmacromolecules with cryo-electron microscopy第六组成员（徐小虎，曾伟杰，第六组成员（徐小虎，曾伟杰，王建，刘腾飞，杨琦琦，苏婷，王建，刘腾飞，杨琦琦，苏婷，温寒炎）温寒炎）2018.10.132018.10.13目 录可编辑21.背景及简介2.样品制备3.优势4.展望2022-5-211.背景及简介可编辑3冷冻电镜（Cryo-microscopy）通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却后用于观测蛋白、生物切片的设备。2022-5-21可编辑42022-5-211.背景-发展历史 雅克迪波什（Ja
2、cques Dubochet）约阿希姆弗兰克(Joachim Frank) 查理德亨德森(Richard Henderson)发展了冷冻电子显微镜技术，以高分辨率确定了溶液里的生物分子结构2022-5-5可编辑6当你冷冻水的时候，它常常形成冰晶；有时候，这是六边形的晶体；有时，是立方的晶体（不透亮）；但是，如果你非常迅速地冷冻液态水，它可以形成无定形的冰（玻璃态冰）。起初，他们尝试了液氮，但是液氮温度通常都处于沸点附近，冷却表面形成大量气体，冷却速度极慢，这会导致冷却之后常常得到冰晶。他设计了一个巧妙的方法，利用吸附的方式形成薄的水膜，然后快速插入到冷却液体（处于液氮环境的液体乙烷，冷却至和液
3、氮相当的温度）（注：乙烷熔点约-183C，液氮沸点约196C）。速度：10000 C /S2022-5-21图像处理技术可编辑7可以把电镜下模糊的二维图像进行分析合并，从而显示出一个清晰的三维图像和三维结构2022-5-211.背景及简介可编辑82022-5-21冷冻电镜技术-让人类看的更细可编辑9主要应用：生物大分子及其复合物结构解析 细胞或者组织的超微结构解析人眼分辨率 0.2mm(十分之一头发丝）光学显微镜 1000倍电子显微镜 100倍冷冻电镜 近原子级2022-5-211.背景及简介可编辑10X衍射衍射晶体学晶体学 同一种蛋白质的多个拷贝排列成一个3D晶体时，可以通过X射线衍射实验获
4、得关于蛋白质的原子结构的信息核磁共振核磁共振光谱光谱（NMR） 测量原子之间的距离依赖相互作用。可以用来推断相对小的蛋白质的结构，并且它提供了关于蛋白质动力学及其与其他分子相互作用的独特信息。冷冻电子显微冷冻电子显微技技术术 蛋白质散射电子的强度比X射线大一万倍，而电子可以通过几十万伏的电场加速到比蛋白质结构中原子间距离短得多的波长。此外，电子的电荷使得相对容易用电磁透镜聚焦它们。2022-5-21一般电镜技术在生物领域应用制约因素可编辑111.生物样品含有丰富的水分，而投射电镜工作的条件是高度真空环境2.高能电子束会对样品造成破坏（电压一般为300kV,200kV,120kV)3.生物样品主
5、要组分是碳、氢、氧等轻元素，对电子的反射和散射作用与背景相比效果相似，所获图像衬度低，4.观察过程中蛋白质与电子发生相互作用或者由于温度变化而发生漂移，导致模糊2022-5-21可编辑12辐射损伤意味着穿过样品的电子将破坏其化学键，改变原有结构信息（比如蛋白、脂等等），将它们“烧掉”。所以，氢键会被破坏，变成了气体，留下的只有一些结构残骸由于辐射损伤的存在，无法测定单个分子的结构。所以他提出使用晶体，通过这种方式，你可以弄清楚电子是如何和这些结构相互作用。这种情况下，你就拥有数十万个规则排列的分子。即使其中的一部分子结构被破坏，你也可以从中得到目标分子的结构信息2022-5-21膜蛋白可编辑1
6、3去除糖基化，长环和柔性区域洗涤剂优化2022-5-212022-5-2114gua可编辑15谷氨酸脱氢酶2022-5-212.样品的制备可编辑16 将几微升纯化的蛋白质溶液施加到由多孔碳膜组成的网格上，并将多余的液体吸干。 栅格插入液体乙烷，瞬间冻结样品和嵌入颗粒玻璃冰。电网储存在液氮中直到它被转移到透射电子显微镜。 网格孔内各种方向的蛋白质的二维图像然后被显微镜的检测器捕获。 处理数据以将相同蛋白质的图像组合成蛋白质结构的3D重建。 2022-5-213.3D重建可编辑173D重建最简单的一种方法 “单颗粒”法。以核糖体为例，核糖体冷冻在一个很薄的水膜中，我们可以从各个不同方向看到的核糖体
7、的二维投影图。从照片中挑选出一个一个核糖体的“单颗粒”；如果数量足够，比如目前大约需要1-2万个，你就可以将这些各个不同方向的核糖体信息组合，模拟得到三维结构。2022-5-21采集过程可编辑18“分子随机冷冻在某个状态”“单颗粒冷冻”“分辨率达到2.9 =0.29nm2022-5-21可编辑192022-5-21优势1.不需要结晶2.样品保存在天然环境3.可以研究亚稳态结构4.样品量少（1 L)蛋白分子需要120kd以上，二聚体的话60kd也可以考虑）2022-5-20可编辑212022-5-21冷冻电镜在动力学中的应用可编辑22“ATP合成酶”包含不同构象的 大分子混合物2022-5-21
8、展望可编辑231.引进云计算：冷冻电镜需要采集大量数据。以核糖体为例，我们将核糖体冻在一个很薄的水膜中，能从各个不同方向看到的核糖体的二维投影，从照片中挑出一个一个核糖体的“单颗粒”，按之前我们说的要获得它的一个三维结构，目前需要1-2万个。2.用于揭示某些疾病的生理过程。2022-5-21神经变性疾病为例 PHDD疾病基因+加上绿色荧光蛋白基因，然后将这个报告基因转染细胞系，通过绿色荧光蛋白确定致病蛋白。 利用冷冻电镜观察致病蛋白的结构，发现其是一个表面带有刺状结构的蛋白。 与正常的蛋白比较发现神经元内的内质网的一个膜破碎没有了，从这种结构性变化角度去认识神经细胞的死亡过程。2022-5-242022-5-25可编辑26亚稳态:如果体系能量高于平衡态时的自由能,则是一种非平 衡状态。2022-5-212022-5-2127
