1、.1关于生物制药关于生物制药v性质：选修性质：选修v学时：学时：32 32 学分：学分：2 2v考核方式：闭卷考核方式：闭卷v参考教材：参考教材：v夏焕章、熊宗贵，生物技术制药（第夏焕章、熊宗贵，生物技术制药（第2 2版），版），高等教育出版社，高等教育出版社，20062006；v熊宗贵，生物技术制药，高等教育出版社，熊宗贵，生物技术制药，高等教育出版社，19991999.2前前 言言 当今世界当今世界七大高新技术七大高新技术分别是：分别是： 现代生物技术现代生物技术 航天技术航天技术 信息技术信息技术 激光技术激光技术 自动化技术自动化技术 新能源技术新能源技术 新材料技术新材料技术.3 现
2、代生物技术现代生物技术列在七大高新技术的首位。列在七大高新技术的首位。 它在解决人类所面临的诸如它在解决人类所面临的诸如食物短缺食物短缺、人类健康人类健康、环境污染环境污染和和资源匮乏资源匮乏等重大等重大问题上有着不可比拟的优越性。问题上有着不可比拟的优越性。.4v就学科内容来说就学科内容来说：v生物技术是以生物技术是以基因工程基因工程为主导；为主导；v以以发酵工程发酵工程为基础；为基础；v包括包括细胞工程细胞工程、酶工程酶工程、生化工程生化工程，随着生物科学的发展，又衍生出第随着生物科学的发展，又衍生出第二代、第三代的二代、第三代的蛋白质工程蛋白质工程、抗体抗体工程工程、海洋生物技术海洋生物
3、技术等。等。.5v就产业来说就产业来说：v生物技术涉及生物技术涉及制药工业制药工业、化学工业化学工业、食食品工业品工业、环境保护环境保护、农作物育种与病虫农作物育种与病虫害防治害防治、能源开发能源开发等。等。.6第一章第一章绪绪 论论.7本章主要内容v一、生物技术发展简史一、生物技术发展简史v二、生物制药的概念和内容二、生物制药的概念和内容 v三、新型生物药物研制的理论和方法三、新型生物药物研制的理论和方法v四、生物制药技术新进展四、生物制药技术新进展.8一、生物技术发展简史一、生物技术发展简史v生物技术是人类对生物资源（微生生物技术是人类对生物资源（微生物、动植物）的利用、改造并为人物、动植
4、物）的利用、改造并为人类服务的技术，它的发展已有几千类服务的技术，它的发展已有几千年的历史，将其发展过程按技术特年的历史，将其发展过程按技术特征可分为征可分为三个阶段三个阶段。.9v1 1、传统生物技术阶段、传统生物技术阶段v2 2、近代生物技术阶段、近代生物技术阶段v3 3、现代生物技术阶段、现代生物技术阶段.101 1、传统生物技术阶段、传统生物技术阶段v出现在公元前几千年，直到出现在公元前几千年，直到2020世纪世纪3030年代。年代。v主要是酿造技术主要是酿造技术，当时人们只知道酿造技，当时人们只知道酿造技术，但不知道这些技术的内在原因。术，但不知道这些技术的内在原因。v1680168
5、0年出现了显微镜。年出现了显微镜。v18571857年用实验方法证明了酒精发酵与酵母年用实验方法证明了酒精发酵与酵母菌有关。菌有关。v18971897年揭开发酵现象的奥秘。酶年揭开发酵现象的奥秘。酶.11v至至20世纪世纪30年代年代v该阶段的产品：乳酸、酒精、丙酮、丁该阶段的产品：乳酸、酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶。醇、柠檬酸、淀粉酶。v该阶段生产的特点该阶段生产的特点：过程简单，大多数：过程简单，大多数属于兼气发酵或表面培养，生产设备要属于兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构简单，求不高，产品化学结构简单，属于初级属于初级代谢产物。代谢产物。.122 2、近代生物技术阶段
6、、近代生物技术阶段v2020世纪世纪4040年代。年代。v第二次世界大战的爆发，急需疗效好、第二次世界大战的爆发，急需疗效好、毒副作用小的抗细菌感染药物，出现了毒副作用小的抗细菌感染药物，出现了青霉素。青霉素。v产品价格昂贵，随着发酵新技术的出现，产品价格昂贵，随着发酵新技术的出现，又相继发现了链霉素、红霉素、金霉素又相继发现了链霉素、红霉素、金霉素等药物。等药物。 .13v该阶段的主要产品：该阶段的主要产品：v医药医药：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；：抗生素、维生素、甾体、氨基酸；v食品工业食品工业：酶制剂、食用氨基酸、酵母、：酶制剂、食用氨基酸、酵母、啤酒；啤酒；v化工业化工业：酒精、丙酮
7、、丁醇、沼气；：酒精、丙酮、丁醇、沼气；v农林业农林业：农药；：农药；v环境保护业环境保护业：生物治理污染。：生物治理污染。 .14v（1 1）产品类型多，初级（氨基酸、酶、产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体）。（甾体）。（2 2）生物技术要求高，纯种、生物技术要求高，纯种、无菌、通气、产品质量要求也高。无菌、通气、产品质量要求也高。（3 3）生产设备规模大，常用生产设备规模大，常用500m500m3 3，最大，最大2000m2000m3 3。（4 4）技术发展速度快，如青霉技术发展速度快，如青霉素菌种，初期素菌种，初期20
8、0200单位单位/ml/ml，目前，目前8 8万单位万单位/ml/mlv形成了交叉学科形成了交叉学科生化工程。生化工程。 该阶段生物技术的特点该阶段生物技术的特点.153 3、现代生物技术阶段、现代生物技术阶段v标志，标志，19531953年美国年美国WatsonWatson和英国的和英国的CrickCrick共同提出了共同提出了DNADNA的双螺旋结构，的双螺旋结构，揭开了生命科学划时代的一页。揭开了生命科学划时代的一页。v此后，又相继出现了一系列新发现和此后，又相继出现了一系列新发现和新进展，遗传中心法则，破译遗传密新进展，遗传中心法则，破译遗传密码，基因重组，单克隆抗体，码，基因重组，单
9、克隆抗体，DNADNA测序，测序，动植物细胞培养技术。动植物细胞培养技术。.16DNADNA的双螺旋结构的双螺旋结构.17v根据实验研究表明，基因表达即遗传信根据实验研究表明，基因表达即遗传信息的传递路线是：息的传递路线是：vDNA RNADNA RNA（mRNAmRNA） 蛋白质蛋白质生物生物性状性状遗传的中心法则遗传的中心法则.18v（1 1）基因操作技术日新月异；基因操作技术日新月异；v（2 2）新技术、新方法迅速商品化；新技术、新方法迅速商品化；v（3 3）基因工程药物和疫苗研究；基因工程药物和疫苗研究；v（4 4）生物治疗制剂产业化；生物治疗制剂产业化；v（5 5）转基因动植物取得重
10、大突破；转基因动植物取得重大突破；v（6 6）现代生物技术应用于农业；现代生物技术应用于农业；v（7 7）阐明生物体基因组及其编码蛋白；阐明生物体基因组及其编码蛋白；v（8 8）基因治疗；基因治疗；v（9 9）蛋白质工程技术；蛋白质工程技术；v（1010）信息技术渗入生命科学信息技术渗入生命科学生物信息学。生物信息学。现代生物技术的发展趋势现代生物技术的发展趋势快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。1.3
11、.1 液闪计数 放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。亲和闪烁分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一种新的液闪分析法。该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪
12、烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。1.3.2 分光光度法 为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以Molecular Device公司的spectra 190为例，它采用8条光导
13、纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。1.3.3 化学发光检测 化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础
14、的发光反应。其发光时间较长且稳定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应，其发光时间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔多点喷射技术中，用于检测化学发光的光导纤维末端带有一喷头，用来加入反应性底物。反应性底物从100个小孔喷出，使反应性底物加入孔中后即可均匀混合。发光反应同时启动后，可立即进行测定，对于闪光性化学发光的测定更为有利。1.3.4 激发荧光检测 新型激发荧光检测仪在传统仪器的基础上，用连续的激发光谐和测定光谱取代固定光谱，使模型的建立更具备灵活性。荧光检测方法灵敏是因为多数荧
15、光基团都有短暂的半衰期，即使用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可采用的荧光模式，使得荧光检测技术成为高通量筛选必不可少的应用手段。荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中，包括荧光共振能量转移(FRET)，荧光偏振(FP)，时间分辨荧光(TRET)以及荧光相关谱(FCS)等技术。1.4 数据库管理系统高通量药物筛选的特点是对数以万计的化合物样品进行多模型的筛选。与高通量药物筛选相适应的数据库管理系统主要承担4个方面的功能。样品库的管理功能：化合物样品库对进行高通量药物筛选的化合物样品的各种理化性质进行存储管理。对每一个新入库的化合物进行新颖性分析，排除结构雷同的化合物，避免不
16、必要的筛选。由于高度反应性基团增加了假阳性出现的机率，样品库对新入库的化合物进行反应基因检测以去除这类化合物。生物活性信息的管理功能：生物活性库存贮每一化合物经过不同模型检测后的结果，并根据多个模型的检测结果对化合物的生物活性进行综合评价。对高通量药物筛选的服务功能：高通量药物筛选的工作量大，自动化程度高，也涉及到许多繁琐的工作。高通量药物筛选数据库管理系统对与药物筛选相关的业务往来通讯、档案管理以及各种样品标签的打印进行管理，使高通量药物筛选的各个环节程序化、标准化。药物设计与药物发现功能：高通量药物筛选产生大量的化合物结构信息，随着筛选的进行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量药物筛选数据
17、库管理系统通过对同一模型不同的呈现阳性反应的化合物结构进行分析，找出其构效关系，从而为药物设计提供参考。1.5 筛选模型是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高，常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。1.5.1 以酶为靶的高通量筛选 以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基
18、于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。基于放射性的方法多是将底物标记，测定放射性产物的生成。Taft等建立了(1,3)-葡聚糖合酶抑制剂(抗真菌)的高通量筛选方法。将含有酶的菌丝提取物、-淀粉酶和UDP-14-葡萄糖加入96孔板的孔中，温孵、反应。终止反应后，滤去未被合成进入的底物。闪烁计数检测滤器上保留的(1,3)-葡聚糖，指示酶活性大小。也有将酶标记，测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenomycin)结合于一种
19、小球上，制成混悬液，加入96孔板，然后加入3标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合物，孵育、过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其影响。另外，基于放射性而无需过滤分离的SPA也有应用。Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法，用以研究其抑制剂。用3标记的肽底物，通过生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA闪烁球相连。酶解使3随肽的断裂而离开闪烁球。测定3放射性作用于闪烁球产生的闪烁信号的丢失量，即指示酶活性大小。基于比色、荧光等的方法有一些报道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制剂的筛选方法。酸性条件下，脂的过
20、氧化物能把Fe2+氧化为Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenol orange)，产物在可见光区620nm有强烈吸收。在96孔板上测定。Zhang等建立了HIV逆转录酶抑制剂(抗病毒药物)的高通量筛选方法。方法使用了“同质时间分辨荧光”(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技术，既实现了非分离操作(同质)，又避免了放射性同位素的使用。该方法基于逆转录酶能很容易地将核苷酸类似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA链。在96或384孔板上，将生物素化的引物/模板与抗生蛋白链菌素-铕在板孔中混合孵育，加入逆转录酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP
21、混合物启动反应。反应60min后，加入链亲和素-别藻蓝蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析仪读取数据。该法也可用于多种其他的核酸聚合酶。1.5.2 以受体为靶的高通量筛选 以受体为作用靶的高通量筛选方法，包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低，而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量，既高效且节省成本。检测第二信使或下游机制如磷酸化，传统方法也比较麻烦，不适于高通量检测，但将这些机制与报告基因相偶联则能克服。1.5.3 以离子通道为靶
22、的高通量筛选 Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。1.5.4 以核酸为靶的高通量筛选 Hamasaki等建立了以16S rRNA编码区结构和HIV-RRE RNA结构为靶的抑制剂的高通量筛选方法。寻找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更高或作用于相同核酸的其他位点的新化合物，以及不易被代谢失活的新化合物。方法基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时，芘的荧光被淬灭的原理。
23、在96孔板上，将芘碳酰巴龙霉素(PCP)，RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中，用荧光读板器考察荧光恢复的程度。1.5.5 以细胞功能为基础的高通量筛选1.5.5.1 内皮细胞激活 内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要的组成环节。Rice等以选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受试化合物等操作，能保持细胞完整，不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。适用化合物范围很宽，并且方法用细胞作为检测对象，使能够较早地发现细胞
24、对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。1.5.5.2 细胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型细胞凋亡调节物的高通量筛选方法。细胞预先用3 胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。1.5.5.3 抗肿瘤活性 Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素及类维生素相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿
25、瘤来源。细胞暴露于受试化合物5后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLa TK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。1.5.5.4 G2检查点(G
26、2 checkpoint) Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7m p53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。1.5.5.5 信号转导通路 Su等建立了TGF3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGF高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。1.5.5.
27、6 细菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。1.5.5.7 细菌生长 Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。用96孔板的形式，1d内可以测试数千个样品。2生药活性成分的高通量筛选样品是高通量药物筛选的物质基础，样品库来源的化学多样性是决定高通量筛选技术能否成功
28、的关键因素之一。前面我们谈到，化合物样品主要有常规化学合成、组合化学合成和从天然产物中分离纯化几个来源。而从天然产物中分离出来的化合物，由于其母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。我国拥有非常丰富的药材资源，几十年来，我们应用药理学手段，对我国的传统药物进行了大规模的研究和筛选，取得了巨大成就。但是，仅仅依靠传统的药理实验方法，既耗时，劳动强度又大，还需要使用大量实验动物，显然不能适应大量样品的同时筛选。虽然经过努力，已从生药中分离、提取、纯化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分离出的化合物得不到
29、充分的利用，造成了化合物资源的极大浪费。因此，将高通量筛选技术应用于生药的活性成分研究，既是对高通量筛选技术的不断完善，又是将这一技术应用于中药现代化研究的有益尝试。如何对生药的活性成分进行高通量筛选呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选基本一致，区别主要在于筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进行适当的分离和化学多样性的评价。相同的就不再赘述，这里主要谈一下提取、分离和多样性评价的问题。2.1 提取 由于高通量筛选需要大量的样品来源，所以常规的提取方法显然不能满足这一要求。寻找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提取技术是近年来发展起来的一个新的提取技术，在准备
30、好样品和对提取方法（或程序）进行设定后，自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品的提取和提取液的收集，简单方便。应用这一技术，可以得到大量的生药的提取物。2.2 分离及化学多样性评价 我们都知道，生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。分离完成后还需要对分离的物质进行化学多样性的评价，以提高高通量筛选的效率。以前，这种评价多是基于物种的地理分布、生物学分类、化学分类以及基源等关系，近年来，随着科技的进步，多种
31、现代化手段开始应用于化学多样性的评价。其中，色谱-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）技术在这方面做出了有力的尝试。首先，它做出成分的离子信号（m/z）对保留时间的平面图，然后对这些数据进行统计学的相似度评估从而对样品的多样性进行定量的评价。接着，三维的HPLC数据被转换为CDF文件格式并传输到UNIX工作站。数据文件中的每一个离子（包括保留时间、质量、离子强度等数据）被定位在一个二维图谱中，保留时间和质量分占一个轴，离子强度数据储存在位点中。滤除噪声以后，离子的中心时间和中心质量被计算出来。根据对LCMS的数据处理，混合物间的相似度被定量地计算出来。这种数据处理基于以下的一种关系，这种关
32、系表征了样品1中的离子i和样品2中的离子j的“化学空间”距离。其中，ti表示离子i的色谱保留时间，mi表示离子i的质荷比（m/z），wt是保留时间的权重系数，wm是质量的权重系数。dij是离子i和离子j的欧几里的距离，n1和n2分别是样品1和样品2中确认的离子数。sij是离子i和离子j之间的相似度（0-1），相似度值为1表明是相同样品，相反，相似度值接近0则表明样品具有很高的化学多样性。通过这种方法，可以很好的解决样品化学多样性的评价问题。3问题及展望当然，高通量筛选作为药物筛选的一种方法，它并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。首先，高通量筛选所采用的主要是分子
33、、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。但我们应该相信，任何技术的进步，都将为科学的发展起到促进作用。随着我们对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的研究和发现以及对筛选模型的新颖性和实用性的统一，高通量筛选这一药物筛选新技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。.34生物技术制药的特性生物技术制药的特性v高技术高技术v高投入高投入v长周期长周期v高风险高风险v高收益高收益.35三、新型生物药物研制的理论
34、和方法三、新型生物药物研制的理论和方法（一）概述（一）概述（二）新药研究和开发的主要过程（二）新药研究和开发的主要过程（三）先导化合物的寻找（三）先导化合物的寻找.36（一）概述（一）概述v新型生物药物新型生物药物是指利用是指利用生物体或生物过程生物体或生物过程产生的产生的结构新颖结构新颖的药物。的药物。v结构新颖结构新颖是指与以前药物有着不同的化学是指与以前药物有着不同的化学结构，是一种新的化学实体结构，是一种新的化学实体(New chemical (New chemical entityentity，简称，简称NCE)NCE)。这类新型生物药物国家。这类新型生物药物国家认定为一类新药。国际
35、上所说的新药开发就认定为一类新药。国际上所说的新药开发就是指开发是指开发NCENCE药物。药物。.37生物药物分类生物药物分类v根据根据NCE来源分来源分v一类是一类是利用重组利用重组DNA技术技术，向大肠杆菌、酵母、动物、，向大肠杆菌、酵母、动物、植物细胞中导入目的基因，植物细胞中导入目的基因，构建重组细胞构建重组细胞，生产目的，生产目的基因编码的蛋白质类、多肽类药物或疫苗，或将一些基因编码的蛋白质类、多肽类药物或疫苗，或将一些特殊基因及基因片段导入宿主细胞后使宿主细胞产生特殊基因及基因片段导入宿主细胞后使宿主细胞产生原来不能产生的蛋白质，获得新功能，或阻遏宿主细原来不能产生的蛋白质，获得新
36、功能，或阻遏宿主细胞基因的复制、转录、翻译等，抑制其功能，甚至杀胞基因的复制、转录、翻译等，抑制其功能，甚至杀死宿主细胞，这就是常说的基因治疗。死宿主细胞，这就是常说的基因治疗。v另一类是另一类是利用微生物、动植物或酶生产利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，的非上述药品，通过通过筛选筛选可获得这类新药的可获得这类新药的NCE的的先异物先异物(Lead compound)。这类药物种类繁多，包括传统的利用发。这类药物种类繁多，包括传统的利用发酵工程生产的药物和直接从动植物中提取的天然药品酵工程生产的药物和直接从动植物中提取的天然药品等。等。.38（二）新药研究和开发的主要过程（二）新药研究和
37、开发的主要过程v(1) ) 确定研究计划确定研究计划 要综合考虑医疗、市场、化学的评估，文献状况，专利的检索，结构的选择，合成的前景等因素。v(2) 准备化合物准备化合物 文献研究，合成或分离，结构鉴定，标准化，专利申请，对研究目标的复核等。v 以上两个环节需占用l2年的时间，需准备60008000个化合物供筛选。.39v(3) 药理筛选药理筛选。v(4) 化学试验化学试验 活性成分的分析。v(5) 临床前临床前期期(Preclinical I) 进一步药理研究包括毒性(2种动物)及活性成分的稳定性。v(6) 临床前临床前期期(Preclinical ) 进一步药理研究包括亚急性毒性(2种动物
38、)、畸胎学研究、药物动力学、动物体内的吸收和排泄、剂型的研究与开发、包装与保存期的研究。v 以上几个环节占用23年的时间，化合物分别剩下大约20个、18个和12个。.40v(10) 注册申请上市注册申请上市 经政府药政部门批准后提供治疗应用。这一过程需23年。v(11 ) 售后监测售后监测(Postmarketing surveillance) v 根据情况进行药理试验、毒性试验、特殊试验和药物动力学试验；对副作用的报告进行收集、评价和鉴别；对药品生产进行质量控制，制剂的生产和包装。v 可见，一个新药的问世要提供6000 8000个化学物质经历9 13年的时间，耗资约2.3亿美元。系统性从纵的
39、方面看主要是若干个环节紧密的衔接和重叠，横的方向主要表现为多种学科相互之间的渗透性和协同性。.41（三）（三） 先导化合物的寻找先导化合物的寻找v 在整个新药的研究和开发中，先导化合在整个新药的研究和开发中，先导化合物的发现是决定以后研究与开发的首要因物的发现是决定以后研究与开发的首要因素，要找到一个好的先导化合物，需要建素，要找到一个好的先导化合物，需要建立好的立好的筛选模型筛选模型和和寻找尽可能多的化合物寻找尽可能多的化合物来源来源。先导化合物的筛选是一项复杂的系。先导化合物的筛选是一项复杂的系统工程，常需要对几个学科同时进行研究。统工程，常需要对几个学科同时进行研究。.42v先导化合物先
40、导化合物是指是指具有某种生物活性的化学结具有某种生物活性的化学结构构, ,由于其活性不强由于其活性不强, ,选择性低选择性低, ,吸收性差吸收性差, ,或或毒性较大等缺点毒性较大等缺点, ,不能直接药用。但作为新的不能直接药用。但作为新的结构类型和线索物质结构类型和线索物质, ,对其进行结构变换和修对其进行结构变换和修饰饰, ,可得到具有优良药理作用的药物。可得到具有优良药理作用的药物。 .43.44先导化合物的寻找先导化合物的寻找1筛选模型的确定筛选模型的确定2. 先导化合物来源先导化合物来源.45v 1筛选模型的确定筛选模型的确定v 筛选模型的筛选模型的核心核心是是药物作用靶药物作用靶，如
41、细菌、，如细菌、动物、酶和细胞表面受体等。动物、酶和细胞表面受体等。v(1)用动物细胞和组织建立的筛选模型用动物细胞和组织建立的筛选模型v(2)酶抑制剂的筛选酶抑制剂的筛选v(3)受体拮抗剂的筛选受体拮抗剂的筛选.46筛选模型筛选模型v(1) (1) 用动物细胞和组织建立的筛选模型用动物细胞和组织建立的筛选模型 其中其中包括下列物质的筛选包括下列物质的筛选：v 抗肿瘤活性物质抗肿瘤活性物质：观察细胞形态的变化，：观察细胞形态的变化，测定体外细胞毒性测定体外细胞毒性LCLC5050值。值。v 免疫抑制剂免疫抑制剂：测定对淋巴细胞增殖反应：测定对淋巴细胞增殖反应的抑制作用。的抑制作用。v 神经营养
42、因子样物质神经营养因子样物质：以神经细胞的分：以神经细胞的分化，如以神经轴突的伸长为指标。化，如以神经轴突的伸长为指标。v 血管生成抑制剂血管生成抑制剂：以鸡绒毛膜尿囊膜和：以鸡绒毛膜尿囊膜和动物角膜为材料，观察对新血管生成的抑制作动物角膜为材料，观察对新血管生成的抑制作用。用。.47筛选模型筛选模型v(2)(2)酶抑制剂的筛选酶抑制剂的筛选 v 已经建立了大量的酶抑制剂的筛选模型，已经建立了大量的酶抑制剂的筛选模型，主要有以下主要有以下6 6种：（种：（抗癌、抗病毒抗癌、抗病毒）v蛋白分解酶抑制剂蛋白分解酶抑制剂v细胞膜酶抑制剂细胞膜酶抑制剂v糖苷水解酶抑制剂糖苷水解酶抑制剂v儿茶酚胺合成酶
43、抑制剂儿茶酚胺合成酶抑制剂v胆固醇生物合成酶胆固醇生物合成酶HMGCoAHMGCoA还原酶抑制剂还原酶抑制剂v其他酶抑制剂。其他酶抑制剂。.48筛选模型筛选模型v(3)(3)受体拮抗剂的筛选受体拮抗剂的筛选 其中包括下列拮抗其中包括下列拮抗物质的筛选：物质的筛选：v速激肽速激肽(Tachykinin，TK)：以：以3H标记的物标记的物质与其受体结合的抑制率为指标。质与其受体结合的抑制率为指标。v内皮素内皮素(Endothelin，ET)：观察内皮素：观察内皮素使血使血管收缩管收缩与其受体结合的抑制率。与其受体结合的抑制率。心血管系统疾病心血管系统疾病v缩胆囊素缩胆囊素(Cholecystoki
44、nin，CCK)：以：以125I标记的标记的CCK与其受体结合的抑制率为指标。与其受体结合的抑制率为指标。v心房纳利尿肽心房纳利尿肽(ANP)：以：以125I标记的标记的ANP与与其受体结合的抑制率为指标。其受体结合的抑制率为指标。 .49筛选模型筛选模型v兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸(EAA)：观察：观察EAA与其受体与其受体结合的抑制率。结合的抑制率。v白三烯白三烯B4(LTB4)：以人多形核白细胞：以人多形核白细胞(PMN)为为LTB4的受体，观察其抑制率。的受体，观察其抑制率。v其他激素受体与其他激素受体与C5av 现今筛选靶已扩展到现今筛选靶已扩展到基因水平基因水平，开始考，开始考虑以基
45、因复制、转录因子、凋亡基因为治疗虑以基因复制、转录因子、凋亡基因为治疗的对象。的对象。.502.先导化合物来源先导化合物来源v从化学库或天然产物中筛选从化学库或天然产物中筛选v 化学库化学库是指用特殊合成方式随机合成结是指用特殊合成方式随机合成结构多样的化合物群体，它的多样性可以得到构多样的化合物群体，它的多样性可以得到较充分的保证，但不能得到结构独特的化合较充分的保证，但不能得到结构独特的化合物。物。v与受体结合的结构设计（合理新药设计）与受体结合的结构设计（合理新药设计） 合理药物设计合理药物设计(理性的药设计理性的药设计)则是基于受则是基于受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分体三维立
46、体结构的认识，通过计算机辅助分子设计子设计(Computer aid molecular design)全程全程合成新分子。合成新分子。.51先导化合物来源先导化合物来源 现今从生物中现今从生物中筛选新药重点筛选新药重点放在放在微生物微生物。化合物的多样性与以下有关：化合物的多样性与以下有关：微生物的种：微生物的种：决定微生物合成的潜在能力；决定微生物合成的潜在能力；发酵条件：发酵条件：调整发酵参数可以巧妙地促进不同调整发酵参数可以巧妙地促进不同次级代谢产物的产生；次级代谢产物的产生；地理区域地理区域；生态学环境：生态学环境：最好收集新鲜的野生菌种。最好收集新鲜的野生菌种。.52先导化合物来源
47、先导化合物来源v 除了微生物外，现在人们也开始关注除了微生物外，现在人们也开始关注植物、动物和海洋生物。植物、动物和海洋生物。v 植物方面植物方面，寻找人们所使用的，寻找人们所使用的药用植物药用植物，增加新药发现的机会。增加新药发现的机会。v 在在人类和动物方面人类和动物方面，则关注自身免疫系，则关注自身免疫系统。已从人类和动物的吞噬细胞中分离得统。已从人类和动物的吞噬细胞中分离得到许多具潜在抗菌作用的蛋白质和多肽。到许多具潜在抗菌作用的蛋白质和多肽。它们有望用作抗菌药物。它们有望用作抗菌药物。 .53先导化合物来源先导化合物来源v 海洋生物海洋生物可为新化合物的筛选提供丰富可为新化合物的筛选
48、提供丰富的资源。目前，海洋天然产物的研究集中在的资源。目前，海洋天然产物的研究集中在大型固着大型固着无脊椎动物和藻类无脊椎动物和藻类上，因为这些生上，因为这些生物相对容易识别和采集。物相对容易识别和采集。v注意：新药的研究与开发不是先导物与新药注意：新药的研究与开发不是先导物与新药的一一对应关系。新药的研究与开发是一个的一一对应关系。新药的研究与开发是一个将将化学结构化学结构研究与研究与生物活性生物活性研究连接起来的研究连接起来的创造性过程，是不断地对初始治疗概念进行创造性过程，是不断地对初始治疗概念进行发展和完善的过程。发展和完善的过程。.54四、生物制药技术新进展四、生物制药技术新进展（一
49、）人类基因组研究与未来药学（一）人类基因组研究与未来药学（二）抗体工程（二）抗体工程（三）转基因技术（三）转基因技术（四）海洋药物（四）海洋药物 ( (五五) ) 生物技术制药工业发展动态生物技术制药工业发展动态.55（一）（一） 人类基因组研究与未来药学人类基因组研究与未来药学v人类现有的人类现有的20352035类，类，1800018000种疾病，都直接或间接与基种疾病，都直接或间接与基因有关。可分为三大类，因有关。可分为三大类，单基因疾病、多基因病、获得单基因疾病、多基因病、获得性基因病性基因病。人类基因组的研究成果、可以大大提高人类。人类基因组的研究成果、可以大大提高人类对基因受损和人
50、类疾病的关系的了解，从以下几方面促对基因受损和人类疾病的关系的了解，从以下几方面促进未来药学的发展。进未来药学的发展。v (1) (1) 基因诊断基因诊断 基因图谱的最大最直接用途当属医疗基因图谱的最大最直接用途当属医疗诊断，特别像心脏病等源于遗传基因变异的疾病。诊断，特别像心脏病等源于遗传基因变异的疾病。v (2(2） 基因治疗基因治疗 基因治疗是指将遗传物质导入载体或基因治疗是指将遗传物质导入载体或受体细胞，通过替代缺陷基因、修正错误基因，对抗异受体细胞，通过替代缺陷基因、修正错误基因，对抗异常基因，调节基因产物的表达方式以实现治疗疾病目的常基因，调节基因产物的表达方式以实现治疗疾病目的的
