1、基因SNP检测技术比较1PPT课件基因多态性检测技术：一 DNA测序技术（DNA sequence）二 基因芯片（gene microarray）技术三 实时定量PCR（Real time PCR，RT-PCR）技术2PPT课件一 DNA测序技术 从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法），发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。下面我们就一一介绍前三代测序技术。3PPT课件第一代测序技术第一代测序技术Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中
2、断DNA合成反应。4PPT课件第二代测序技术 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，但其测序成本高，通量低严重影响了真正大规模的应用。而经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。5PPT课件1. Illumina(1)DNA待测文库 构建(2)Flowcell(3)桥式PCR扩增 与变性(4)测序6PPT课件7PPT课件2. Roche 454(1)DNA文库制备(2) Emulsion PCR(3)焦磷酸测序8PPT课件9PPT课件第三代测序技术以PacBi
3、o公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。10PPT课件PacBio SMRT技术基本原理：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。11PPT课件Oxford Nanopore Technologies当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。12PPT课件二 基因芯片技术 基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一
4、组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。13PPT课件PCRT7 promoterT7 promoter体内转录片段化1.5 小时杂交、冲洗ACGT扫描分析1 小时荧光素图 2 样品处理与检测过程简图14PPT课件三 实时定量PCR技术 由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；也不能做多重PCR检
5、测（Multiplex）。15PPT课件TaqMan 技术FwdRevSpecific Target Amplification(if necessary) YAllele-Specific GenotypingReactionTaqMan ProbesFwdRev Y TCTaqMan 技术 T YC1. Probe hybridization2. Target amplification Y T T Y3. Probe displacement & cleavage4. PCR & cleavage productsMGB技术技术原理原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，3端采用
6、了非荧光性的淬灭基因，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交, 而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个15bp的MGB 探针的信噪比大于6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。18PPT课件FRET技术技术 原理原理：探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离15bp），上游探针的3端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5端标记Red 640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，
7、供体基团和受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测。两个单标记探针的长短不影响信号的传递，而探针间的距离通常为1-5bp。19PPT课件分子信标技术分子信标技术分子信标（ Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。 20PPT课件Thanks!21PPT课件
