1、Molecular luminescence analysis 较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量量受激受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法 采用高灵敏度的检测系统可大大提高采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低低24个数量级个数量级激发激发发射荧光发射荧光强强强强（一）（一） 激发过程激发过程电子基态电子基态第一电子激发态第一电子激发态转动能极跃迁转动能极跃迁振动能级跃迁振动能级跃迁电子能级跃迁电子能
2、级跃迁 、n分子能级分子能级=电子能级电子能级(Ee)+振动能级振动能级(Ev)+转动能级转动能级(Er)。S0S1 S0T1 n平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三重三重态能级比相应单重态能级低态能级比相应单重态能级低；n 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； S0S2S1T1Deactivation） 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射辐射跃迁跃迁(发光发光)和和无辐射跃迁无辐射跃迁等方式失去能量；等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光
3、磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发发光强度相对大。光强度相对大。当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重叠重叠时，时，S2 S1、T2-T1速率极大，速率极大， 10-14 10-12s 完成。完成。无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和振动弛豫，跃回振动弛豫，跃回第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光
4、吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃（ 多为多为 S1 S0跃迁跃迁），T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级基态基态( T1 S0跃迁跃迁）产生产生a. 电子由电子由S0 T1的可能过程：（的可能过程：（ 禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移S系间跨越系间跨越T振动弛豫振动弛豫 T1b.
5、光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间c. 磷磷 荧荧 激激 * 易产生荧光易产生荧光 n * 易产生磷光易产生磷光T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VRS2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫I固定固定固定测量波长为荧光（或磷光）固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长最大发射波长 ，然后改变激
6、，然后改变激发波长，根据激发光波长发波长，根据激发光波长对荧对荧光（磷光）强度光（磷光）强度I作图得作图得 激发光激发光谱曲线谱曲线。 激发：激发：excitated发射：发射：emission 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大n激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为经校正后二者完全相同！这是因为分子吸分子吸收光能的过程就是分子的激发过程收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱曲线：激发光谱曲线： 吸收曲线：吸收曲线： 两者在性质上是不同的两者在性质上是不同的I固定固定I固定固定固定激发光波长固定激发光波长
7、由于不同物质具有不同的特征由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质谱可用于鉴别荧光物质吸收峰荧光峰磷光峰200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 a. Stokesa. Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱
8、的形状与激发波长无关 不管激发波长如何，分子受激后可到达不同能层的激发态，不管激发波长如何，分子受激后可到达不同能层的激发态，但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。 c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 c. 镜像规则镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动
9、能级分布类似。动能级分布类似。激发：基态激发：基态第一激发态各振动能级，振动能级越第一激发态各振动能级，振动能级越 高，能级差越大，波长就越短。高，能级差越大，波长就越短。发射荧光：从第一激发态的最低振动能级发射荧光：从第一激发态的最低振动能级基态的各基态的各 振动能级，基态的振动能级越高，其能量振动能级，基态的振动能级越高，其能量 差越小，波长就越长。差越小，波长就越长。吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像高，波长越长。互为镜像 基态上的基态上的零振动能级与零振动能级与第一激发态的第一激发态的振动能级之间振动能级之间的
10、跃迁几率最的跃迁几率最大，相反跃迁大，相反跃迁也然也然。 n产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件： i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）； ii）量子效率足够大：）量子效率足够大：发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数ifffKKK1、跃迁类型、跃迁类型 具有具有*跃迁的量子效率比跃迁的量子效率比n*跃迁的要跃迁的要大得多（前者大得多（前者大、寿命短）大、寿命短）总之，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯
11、苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状线状环结构比非线状结构的荧光波长长结构的荧光波长长 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定 3，4 - 苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质反式：平面
12、构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体C=CHHC=CHHn溶液中若含有原子序数较高的重原子的分溶液中若含有原子序数较高的重原子的分子或离子，如溴化物、碘化物等，导致容子或离子，如溴化物、碘化物等，导致容易发生系间跨越效应称重原子效应。易发生系间跨越效应称重原子效应。n其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加。使单重态向多重态系间跨越的几率增加。n含重原子的化合物荧光很弱，甚至无荧光，含重原子的化合物荧光很弱，甚至无荧光，但磷光增强。但磷光增强。NOHNO
13、HMOHO_OHH+_例：例： 苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光例：例： 苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光OHO_另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性 自吸现象自吸现象：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波：内滤光中的一种，化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾；光，如色氨酸中的重铬酸钾；M 非辐射跃迁非辐射跃
14、迁吸收hM发射荧光 hM M+热热 碰撞猝灭碰撞猝灭荧光池荧光强度检测器IIA0lg将上式展开! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff 当当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化 =2.3 当当A0.05时，时，与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角光源光源第一单色器第一单色器激发单色器激发单色器液池液池检测器检测器第二单色器第二单色器发射单色器发射单
15、色器检测器检测器放大器及记录器放大器及记录器应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变和固定能量差及可变波长三种：波长三种：1、固定波长差同步扫描荧光法、固定波长差同步扫描荧光法 ex- em常数常数2、固定能量差同步扫描荧光法固定能量差同步扫描荧光法 使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差3、可变波长同步
16、扫描荧光法、可变波长同步扫描荧光法 使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描常数710)11(emex 同步扫描技术可简化光谱，谱带变同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。窄，减少光谱重叠，提高分辨率。 合适的合适的可可减少光谱重叠：减少光谱重叠：酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但发射光谱严重重叠，但156060nmnm时，只显示时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分色氨酸的特征光谱，实现分别测定。别测定。磷光仪器在荧光仪磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光样品池上增加磷光配
17、件：配件：低温杜瓦瓶低温杜瓦瓶和斩光片和斩光片。如右图。如右图所示。斩光片的作所示。斩光片的作用是利用其分子受用是利用其分子受激所产生的荧光与激所产生的荧光与磷光的寿命不同获磷光的寿命不同获取磷光辐射取磷光辐射低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后年后发展了室温磷光（发展了室温磷光（RTP）。）。1）固体基质室温磷光）固体基质室温磷光 在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量
18、子效率。子效率。2）胶束增稳室温磷光）胶束增稳室温磷光 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。等去活化的几率，提高三重态的稳定性。3）敏化溶液室温磷光）敏化溶液室温磷光VB2 又称核黄素，是一种生又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中。生、蘑菇和海藻中。 在低浓度情况下，在低浓度情况下，I= KC，I与与C
19、呈线性关系，在呈线性关系，在pH67荧光最强荧光最强 在在430440nm蓝光照射下，蓝光照射下，发出绿色荧光，发出绿色荧光， em = 535 nm下测下测 I ，用标准曲线法，用标准曲线法测定测定CHHOHOHONNNNHCHCHCH OHCH22OOH CH C33缺VB2会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎维生素维生素B2激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射光子的分子数frCL激发态分子的化学效率化学效率激发态分子的发光效率发光效率取决于发光所依据的化学反应本身取决于发光所依据的化学反应本身dtdctICLCL)(对下列化学发光反应对下列化学发光反应
20、A +B C* +D C + h A + B C* +DnA为待测物质，为待测物质，C为发光物质，当反应物为发光物质，当反应物B的浓度的浓度远远过量于待测物浓度时，远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应数。因此，发光反应可视为一级反应Ackdtdc1nt 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比n化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用发光总强度来定量分析发光总强度来定量分析ACLCLCLcdtdtdcdtIS发光总强度ACLCLCLckdtdctI1)(NH
21、NHOONH22NHCOOCOO*OH-COOCOONH2+hvNHNHOONH22NHCOOCOO*OH-COOCOONH2+hv氧化剂氧化剂（ H2O2 ）425 nm 反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光 可检测低至可检测低至10-9 molL-1 的的H2O2n鲁米诺鲁米诺H2O2的化学反应，可以被一些的化学反应，可以被一些痕量的过渡痕量的过渡金属元素所催化金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可，使发出的光大大增强，由此可测定测定Co（）,Cu（）, Ni（）, Cr
22、（），），Fe（ ），），Ag（），），Au（ ），），Mn () ，Hg（ ）Os（ ），），Ru（），），V（），），Ir（）等金属离子，检测限由）等金属离子，检测限由0.0140 gmL-1不等不等n利用鲁米诺发光体系可以测定利用鲁米诺发光体系可以测定50余种元素和大量余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高有机和无机化合物，灵敏度都比较高n鲁米诺化学发光体系还可用于许多鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反生化反应研究应研究，常常涉及到，常常涉及到H2O2的产生或的产生或H2O2参参加反应，例如测定葡萄糖：加反应，例如测定葡萄糖：h222222邻苯二甲酸根离子鲁米诺葡萄糖酸葡萄糖葡
23、萄糖氧化酶OHOHOHOn在在刑侦学刑侦学中的鲁米诺反应（中的鲁米诺反应（ Luminol Test ），主），主要是指要是指 Luminol 跟双氧水和跟双氧水和 OH-离子间的反应，离子间的反应，血液中血红素的铁离子，是该反应的催化剂。血液中血红素的铁离子，是该反应的催化剂。n在凶案现场只要有血液溅出并沾到任何物体上，在凶案现场只要有血液溅出并沾到任何物体上，不管事后经过何种方式的清除，只要用鲁米诺试不管事后经过何种方式的清除，只要用鲁米诺试剂喷洒在其上并在暗环境下观察的话，原沾剂喷洒在其上并在暗环境下观察的话，原沾 有血有血迹的地方就会有因发生荧光反应而呈蓝白色的荧迹的地方就会有因发生荧
24、光反应而呈蓝白色的荧光。光。广泛应用于大气污染监测广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的、可监测空气中的O3；NO、NO2；SO2；H2S；CO；乙烯等。；乙烯等。n在气相中在气相中O3能氧化能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化能氧化NO、SO2、CO等产生化学发光。等产生化学发光。 例例1： NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 +h （ 600nm） 常温下产生化学发光，灵敏度可达常温下产生化学发光，灵敏度可达1ngmL-1测定范围测定范围0.0110000 gmL-1 例例1： CO + O（原子氧）（原子氧） CO2* CO2* CO2 +h （ =300500nm） 灵敏度为灵敏度为1ngmL-1（1）直接化学发光）直接化学发光A + B C* +D C* C + h 产物接受反应能被激发产物接受反应能被激发（2）间接化学发光）间接化学发光A + B C* +D C* +F F* + E F* F + h C*:能量给予体能量给予体 F:能量接收体能量接收体例：罗丹明例：罗丹明B-没食子酸的乙醇溶液测定大气中的没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3 没食子酸没食子酸+O3 A*+O2 A*+罗丹明罗丹明B 罗丹明罗丹明B*+B 罗丹明罗丹明B* 罗丹明罗丹明B + h max584nm
