1、 起初上帝创造天地，起初上帝创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，地是空虚混沌，渊面黑暗，上帝的灵运行在水面上，上帝的灵运行在水面上，上帝说：上帝说：“要有光，就有了光。要有光，就有了光。” -旧约全书旧约全书创世纪创世纪 萤火虫的发光基因对烟草说：萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光要有光”，烟草就发光了。，烟草就发光了。第第 二二 节节 重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique 本节主要内容本节主要内容 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 重组重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤 PCR、核酸杂交、核酸杂交DNA克隆克隆工具酶工具酶
2、目的基因目的基因基因载体基因载体重组重组DNA技术技术应用酶学的方法，在应用酶学的方法，在体外体外将各种来源的将各种来源的遗传遗传物质物质DNA与载体与载体DNA接合成一具有接合成一具有自我复制能力自我复制能力的重组的重组DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通，继而通过过转化或转染转化或转染宿主细胞，宿主细胞，筛选筛选出含有目的基因的出含有目的基因的转化子细胞，再进行转化子细胞，再进行扩增提取扩增提取获得大量同一获得大量同一DNA分子，也分子，也称称分子克隆或重组分子克隆或重组DNA 技术技术 。 基因克隆的主要操作步骤基因克隆的主要操作步骤粘性末端粘性末端质粒质粒目的基因目的
3、基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端分分(分离分离)切切(切割切割)酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!筛筛(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大量生长大量生长提取大量质粒提取大量质粒酶切鉴定酶切鉴定基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤分：分：分离目的基因和载体分离目的基因和载体DNADNA。切：切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生用
4、合适的限制性内切酶切割上述两者，产生 匹配的末端。匹配的末端。接：接：连接酶将目的基因装入载体。连接酶将目的基因装入载体。转：转：转入宿主细胞。转入宿主细胞。筛：筛：筛选具有筛选具有重组重组DNADNA分子的阳性分子的阳性克隆。克隆。 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 连接酶连接酶 聚合酶聚合酶(Taq酶、末酶、末 端转移酶端转移酶) 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶合成双链合成双链cDNA分分子子5羟基末端羟基末端磷酸化磷酸化 切除末端切除末端磷酸基磷酸基一、工具酶一、工具酶1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, RE）
5、能能识别识别DNA的的特异序列特异序列，并在识别位点，并在识别位点或其周围或其周围切割切割双链双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。主要来源于主要来源于原核生物原核生物由于能限制外源由于能限制外源DNA的的“入侵入侵”而得名。与甲而得名。与甲基化酶共同构成细菌的基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外限制修饰系统，限制外源源DNA， 保护自身保护自身DNA第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗
6、马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶分类分类 、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型型）类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 舟行水面水行舟舟行水面水行舟A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary st
7、rand.In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite polarity.在在对称轴中心对称轴中心同时切割双链，产生同时切割双链，产生平末端平末端或或称称钝性末端（钝性末端（blunt end），如，如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 II型酶切割双链型酶切割双链DNA产生产生3种不同的切口种不同的切口切割：切割：以内切方式水解双链以内切方式水解双链DNA中的中的磷酸二酯键磷酸二酯键，产生的产生的DNA片段片段5
8、 端为磷酸基，端为磷酸基，3 端为羟基。端为羟基。 在在对称轴两侧相对位点对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从分别切割一条链。从 5端切割产生端切割产生5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端，如，如EcoR ： 从从3 端切割产生端切割产生3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端。如。如Pst ：5 GAATT C3 EcoR I 5 G 5 AATTC33 C TTAAG5 3 CTTA A 5 G 5 5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA 3 G33 GACGT C5 3 G 3 ACGTC 5 限制性内切酶作用过程 1在下述双链在下述双链DNA序列序列(仅列出其中一仅列出其中一链序
9、列链序列)中不属于完全回文结构的是中不属于完全回文结构的是 AAGAATTCT B. TGAATTCA CGGAATTCC DCGTTAAGC EAGATATCT 1某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5AGCTGAATTC3产生产生 2某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5CTGCAGAGTC3产生产生 3某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5AGGTTAACAG3产生产生5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端平末端平末端常用的载体按来源分为：常用的载体按来
10、源分为：质粒（质粒（plasmid）、噬菌体）、噬菌体(phage)和病毒和病毒(virus)按得到的产物，载体可分为：按得到的产物，载体可分为：克隆载体（克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增）主要用于基因片断的扩增表达载体（表达载体（expression vector）用于获得目的基因编）用于获得目的基因编码的蛋白质码的蛋白质（二）（二）载体的分类载体的分类载体的选择标准载体的选择标准复制起始点，能自主复制；复制起始点，能自主复制；具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DN
11、A插入点），常具有多插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。质粒（质粒（plasmid） 质粒是存在于细菌染色体外的质粒是存在于细菌染色体外的小型小型环状双链环状双链DNA分子分子，能在宿主，能在宿主细胞细胞独立自主地进行复制独立自主地进行复制，并在细胞，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些粒带有某些遗传信息遗传信息，会赋予宿主细，会赋予宿主细胞胞新的遗传性状新的遗传性状。因为质粒因为质粒DNA有自我复制功能及携有自我复制功能及携带遗传信息等特性，
12、可作为重组带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。操作的载体。目目 录录氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素抗四环素抗性基因性基因多克隆位点多克隆位点ori噬菌体噬菌体 噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和外壳蛋白和-DNA组成组成 。噬菌体（噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链，为线性双链DNA，它的两端各有它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。DNA在体
13、外可包装在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。 Sal BamHEcoRSal BamHEcoRlacZ基因基因: 编码编码 -半乳半乳 糖苷酶的糖苷酶的 -片段片段 M13噬菌体载体噬菌体载体pUC18和和pUC19载体载体多克隆位点多克隆位点r酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录
14、病毒）病毒）其其 他他三、重组三、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤基本原理基本原理目的基因目的基因的获取的获取重组重组DNA导入导入受体菌受体菌 外源基因与载体的外源基因与载体的连接连接克隆克隆载体载体的选择和构建的选择和构建重组体的重组体的筛选筛选克隆基因的克隆基因的表达表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列序列 。2.2.基因组基因组DNADNA文库文库(
15、genomic DNA library)(genomic DNA library)3. 3. cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)4. 4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)(polymerase chain reaction, PCR) （见第（见第2020章）章） * 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、 胰岛素原、胰岛素原、 脑啡肽、干扰素基
16、因等。脑啡肽、干扰素基因等。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库 P441(genomic DNA library)mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录cD
17、NA文库的特点文库的特点代表了取材当时所表达基因的总和，不包括代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。那些未表达的基因。mRNA分子中分子中不包括内含子及调控序列不包括内含子及调控序列，所，所以以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。文库的复杂性要比基因组文库低的多。 体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNADNA片段的技术。片段的技术。 其原理类似于其原理类似于DNADNA的体内复制的体内复制，只是在试管中给，只是在试管中给DNADNA的体外合成提供一的体外合成提供一种合适条件种合适条件模板模板DNADNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物
18、， dNTPs ,DNAdNTPs ,DNA聚合酶，合适聚合酶，合适的缓冲液系统的缓冲液系统(Mg(Mg2+2+) )和和DNADNA变性、复性变性、复性( (退火退火) )及延伸的温度与时间及延伸的温度与时间等，等，使目的使目的DNADNA得以迅速扩增得以迅速扩增 . .聚合酶链式反应聚合酶链式反应 P407（Polymerase Chain Reaction , PCR）5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR技术的工作原理技术的工作原理目目 录录DNA变性变性 复性复性 延伸
19、延伸Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录DNA片段片段Cycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle n理论上可达理论上可达2n个拷贝个拷贝原料原料（pg） 产物产物(g)体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异 地扩增地扩增DNA片段片段g mg g ng pg（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接 粘性末端连接粘性末端连接 平端连接平端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建粘性末端连接粘性末端连接 外源外
20、源DNA片段与载体用片段与载体用同一种限制性内切酶同一种限制性内切酶切割，切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶连接酶作用下，形成重组作用下，形成重组DNA分子。分子。DNA连接酶连接酶 “缝合缝合”基因的基因的 “分子针线分子针线”。DNA连接酶的作用过程Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCT
21、AGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切E
22、co R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐限制性内切酶切割产生的平末端的补齐目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA连接酶连接酶 15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用
23、下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。 如将如将poly（dA）加到双链）加到双链DNA片段片段3 羟基上，而将羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体）加到质粒载体3 羟羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。粘性末端连接。受体菌条件受体菌条件 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式 转化转化 (transformation) 将将质粒质粒或以它为载体构建的重或以它为载体构建
24、的重组分子导入受体细胞的过程称为组分子导入受体细胞的过程称为转化转化.转染转染(transfection) 将外源将外源DNA直接导入真核细胞直接导入真核细胞.感染感染 (infection) 以以噬菌体噬菌体和真核和真核病毒病毒作载体构建的重作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为感组分子导入受体细胞的过程称为感染染（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌感受态细胞的制备感受态细胞的制备基因片段（特别是纯化的基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在先加以处理，如在低温条低温条件件 下，用下，用CaCl
25、2（冰浴）（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这提高质粒的转化效率。这种经过预处理、种经过预处理、容易导入容易导入外源核酸分子外源核酸分子的受体细胞的受体细胞被称作被称作“感受态细胞感受态细胞”（competent cell）。（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选1. 载体遗传标记筛选载体遗传标记筛选(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救 (marker rescue)2.序列特异性筛选法序列特异性筛选法（1）RE酶切法酶切法(2) PCR法法（3）核酸分子杂交）核酸分子杂交3. 亲和筛选法亲和筛选法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学
26、方法及酶免检测分析等pBR322AmprTetr标志基因标志基因Tetr失活失活区别非转化菌与转化菌？区别非转化菌与转化菌？双抗生素双抗生素对照筛选对照筛选重组子重组子能在含有能在含有Ap的的培养板上生长培养板上生长但不能在含有但不能在含有Tet的培的培养板上生长养板上生长N2HAmpuc18LacZ基因基因 N端序列端序列插入外源片段插入外源片段（LacZ基因失活）基因失活）LacZ基因基因 C端序列端序列互补互补：单独存在的单独存在的及及 片段都没片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才
27、有宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（使特异性作用物（X-gal）变为）变为蓝色蓝色化合物。化合物。如果插入的外源基因是在如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影响基因内，就会影响lacZ的表达，的表达，利用利用lac- E.coli为转染或感染细胞，为转染或感染细胞，在含在含X-gal的培养基上生长时会的培养基上生长时会出现出现 白色菌落白色菌落；若无外源基因若无外源基因插入，则出现插入，则出现蓝色菌落。蓝色菌落。白色菌落白色菌落目目 录录 -互补：互补：通过蓝白通过蓝白斑筛选可斑筛选可以筛选、以筛选、鉴定重组鉴定重组子与非重子与非重组子载体组子载体-半乳糖苷
28、酶能半乳糖苷酶能分解分解X-gal，形，形成成蓝色菌落蓝色菌落。当外源基因插入后，当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完基因被破坏，不能合成完整的整的-半乳糖苷酶，因此半乳糖苷酶，因此不能分解底物不能分解底物X-gal，菌落菌落成白色。成白色。 指用指用探针探针检测样品中检测样品中未知核酸序列未知核酸序列，通过碱基互补配对原，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。列的位置或大小显示出来。核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理变性（变性（denaturation）复性（
29、复性（renaturation） 预杂交（预杂交（prehybridization）杂交（杂交（hybridization） 探针探针：带有可检测标记的已知序列的：带有可检测标记的已知序列的DNA或或RNA片段。片段。菌菌落落原原位位杂杂交交鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切割目的基因与载体限制酶切割目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 分分_分离出目的基因及分离出目的基因及载体载体DNADNA。
30、切切_利用限制性核酸内利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体。切酶分别切割目的基因和载体。接接_利用连接酶将目的利用连接酶将目的基因与载体基因与载体DNADNA共价连接形成共价连接形成重组重组DNADNA分子。分子。转转_重组重组DNADNA分子转化分子转化受体细胞。受体细胞。筛筛_筛选和鉴定含有重筛选和鉴定含有重组组DNADNA分子的受体细胞（阳性分子的受体细胞（阳性克隆）。克隆）。重组重组DNADNA的基本过的基本过程程重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工
31、合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录大量生长大量生长克隆载体：拷贝大量克隆载体：拷贝大量目的基因目的基因表达载体：获得大量表达载体：获得大量目的蛋白目的蛋白表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆第三节、重组技术与医学的关
32、系第三节、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药（三）基因诊断（三）基因诊断（四）基因治疗（四）基因治疗 神话成现实神话成现实 绿叶变为鲜花绿叶变为鲜花基基 因因 武武 器器 2020克超级基因可使克超级基因可使6060亿人死于非命亿人死于非命 一旦基因武器运用于战争，将使一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发生巨大变化未来战争发生巨大变化。基因。基因武器使用者武器使用者再也不用兴师动众再也不用兴师动众，而只需要在临战前将经过基因工程，而只需要在临战前将经过基因工程培养的病菌投入他国，使敌方人畜在短时间患上一种培养的病菌投入他国，使敌方人畜在短时间患上一种无法治疗的疾无法治疗的疾病病
33、，从而，从而丧失战斗能力丧失战斗能力。 基因武器可根据需要基因武器可根据需要任意重组基因任意重组基因，可在一些生物中移入损伤，可在一些生物中移入损伤人类智力的基因人类智力的基因。当某一特定族群的人沾染上这种带有。当某一特定族群的人沾染上这种带有损伤智力基损伤智力基因因的病菌时，就会的病菌时，就会丧失正常智力丧失正常智力。另一方面，基因作为战术武器使。另一方面，基因作为战术武器使用时，将使对方用时，将使对方防不胜防，束手无策防不胜防，束手无策。基因武器的特有功能之一，。基因武器的特有功能之一，就是从武器的使用到发生作用都就是从武器的使用到发生作用都没有明显的征候没有明显的征候，即使，即使发现了发
34、现了也难也难以以破解遗传密码破解遗传密码和和实施控制实施控制。限制性内限制性内切酶切酶DNA连接酶连接酶大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录“非典非典” 可能是针对中国的基因武可能是针对中国的基因武器器 俄罗斯医学科学院院士俄罗斯医学科学院院士卡雷辛柯夫卡雷辛柯夫在非典疫情大规模爆发初期就断在非典疫情大规模爆发初期就断言，言，非典型肺炎是一种生物武器非典型肺炎是一种生物武器，极可能是从实验室里流出来的。他的，极可能是从实验室里流出来的。他的依据是：非典是依据是：非典是麻疹病毒麻疹病毒与与流行性腮腺炎病毒流行性腮腺炎病毒的混合体，而这种混合病的混合体，而这种混合病毒
35、毒只有在实验室里才可能培育出来只有在实验室里才可能培育出来，在自然环境中根本不可能发生。，在自然环境中根本不可能发生。 非典来自生化武器这一观非典来自生化武器这一观点提出来后，点提出来后，美国政府还曾两美国政府还曾两次否定非典是美国的生化武器次否定非典是美国的生化武器。基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。中，达到治疗疾病的目的。 取患者取患者骨髓骨髓分离干分离干细胞细胞病毒病毒正常基因正常基因并入正常基因并入正常基因的干细胞的干细胞注入患注入患者体内者体内基因治疗基因治疗(Gene Therapy)基因诊断基因诊断
36、(Genetic Diagnosis ): 利用现代分子生物利用现代分子生物学和分子遗传学的技术学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出正常，从而对疾病作出诊断的方法诊断的方法.DNA cloningPalindromeTarget geneCloning vectorPlasmidRestriction endonucleaseMolecular hybridizationPCRKey wordsGenomic DNA librarycDNA libraryDenaturationAnnealingExtensi
37、onExpression vectorSummary1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。何谓基因重组技术，简述其基本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？何谓目的基因，有哪些来源？3. 解释基因载体，哪些解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？可作为基因载体？ (质粒质粒)4. 基本概念基本概念 DNA重组技术重组技术, 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶, 回文结构回文结构, 目的基因目的基因, 基因组基因组DNA文库文库, cDNA文库文库, PCR,第二十一章第二十一章 DNA重组及重组重组及重组DNA技术技术实验结果Summary1. Recombinant DNA technolog
38、y builds on a few basic techniques: isolation of DNA, cleavage of DNA at particular sequences, ligation of DNA fragments, introduction of DNA into host cells, replication of DNA, and identification of host cells that contain recombinants.Summary2. A genomic library represents all the DNA of an organ
39、ism; A cDNA library contains DNA that is complementary to the mRNA from a particular cell or tissue.3. Fragments of DNA generated by restriction endonucleases are incorporated into vectors, which can be plasmids, bacteriophages, viruses, or artificial chromosomes.Summary4. Cells containing the desired recombinant are identified by screening.5. Specific DNA sequences can be amplified by the polymerase chain reaction (PCR).
