1、形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端识别双链识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中序列，并且使每一条链中特定部位特定部位的两的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的一的一种酶。能将外来的种酶。能将外来的DNA切断切断，由于这种，由于这种切割作用是在切割作用是在DNA分子内部进行的，故分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。名限制性核酸内切酶。约约4000种。种。 限制酶切割限制酶切割DNA后形后形成的末端成的末端黏性末端、黏性末端、平末端是如何形成的？
2、平末端是如何形成的？重播重播要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。 会产生相同的黏性末端会产生相同的黏性末端切断的切断的DNA片段要与运载体的片段要与运载体的DNA连接，连接，你觉得可以用什么酶？你觉得可以用什么酶？ 限制酶切割后有两种不同的结限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用末端。那么恢复它们的连接时，所用DNADNA连接酶是否可以不加选择？连接酶是否可以不加选择？EcoliDNA连接酶：连接黏性末端连接酶：连接黏性末端T T4 4DNADNA连接酶：连接黏性末端和平末端连接酶：
3、连接黏性末端和平末端DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链连接部位连接部位DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶有何聚合酶有何相同点和不同点？相同点和不同点？双链双链单链单链在两在两DNA片段之片段之间形成磷酸二酯间形成磷酸二酯键键将单个核苷酸加到将单个核苷酸加到已存在的核酸片段已存在的核酸片段的的3末端的羟基上，末端的羟基上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键载体需要的条件：载体需要的条件：有一个至多有一个至多个限制酶切点个限制酶切点对受体细胞无害对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于有某些标记基因，便于筛选筛选 (5)(5)
4、结构简单，大小适结构简单，大小适中。中。常常用载体种类：用载体种类： 质质粒粒 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 某某些动植物病毒些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？会怎样？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 常用常用： 注注意：真正用意：真正用
5、作载作载体的质粒体的质粒都是在天然质粒的基都是在天然质粒的基础上进行过人础上进行过人工改工改造的造的。 质粒是染色体外能够进质粒是染色体外能够进行行自主复制自主复制的遗传单位，包的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的细胞中核区外的DNADNA分子。分子。现在习惯上用来专指细菌、现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中酵母菌和放线菌等生物中核核以外的以外的DNADNA分子。分子。 绝大多数细菌质粒都是绝大多数细菌质粒都是闭合环状闭合环状DNADNA分子分子。有的一。有的一个细菌中有一个，有的一个个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。细菌中有多个。小结小
6、结基因工程基因工程的工具的工具限限制酶制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类EcoliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工具工具具备的具备的条件条件结构结构简单，大简单，大小适中小适中能在宿主细胞中能在宿主细胞中自我自我复复制并稳定存在制并稳定存在具一个多个限制酶切位具一个多个限制酶切位点点具标记基因具标记基因质粒、质粒、 噬菌体衍生物噬菌体衍生物 、动植物病毒、动植物病毒一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程是指按照人
7、们的愿望，进行严格的设计，基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外通过体外 和和 等技术，赋予生等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出符合人们需要的新物以新的遗传特性，创造出符合人们需要的新的的 和和 。又叫做。又叫做DNADNA的重组的重组技术。技术。二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀” ” (1) (1)主要来源：从主要来源：从_生物中分离出来的。生物中分离出来的。 (2) (2)特点：能够识别特点：能够识别DNADNA特定的核苷酸序列切开特定的核苷酸序列切开 DNADNA重组重组转基因转基因
8、生物类型生物类型生物产品生物产品原核原核核苷酸核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端平末端平末端缝合缝合磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端复制复制环状环状噬菌体噬菌体动植物病毒动植物病毒自我复制自我复制限制酶限制酶标记标记n在基因工程中，切割运载体和含在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的有目的基因的DNADNA片段，需使用片段，需使用（ ）A.A.同种限制酶同种限制酶 B. B. 两种限制酶两种限制酶C.C.同种连接酶同种连接酶 D. D. 两种连接酶两种连接酶A不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （
9、） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA3) 基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上进行设计施分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用 n原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的
10、入侵，但是，的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制侵入时，会利用限制酶将外源酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之、使之失效，从而达到保护自身的目的。失效，从而达到保护自身的目的。n含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。其切开。
