1、胶原蛋白传统提取方法的问题国内外重组胶原蛋白概况类人胶原蛋白研发背景类人胶原蛋白研发背景胶原蛋白传统提取方式和面临的问题1 He|cke TGelatin，The food technologists friend or foeInternational Food Ingredients20001，6-8病毒病毒隐患隐患动物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人体传染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的传染危险2 排异排异反应反应异种或异体排斥反应, 导致植入部位无菌性炎症以及细胞数量和形态改变细胞细胞毒性毒性不溶于水，加工过程中所用的酸、碱、盐溶剂很难脱除完全, 产生细胞毒性，并降低细胞粘附性制备方法
2、：制备方法：酸水解法碱水解法酶解法 原料来源：原料来源：猪/牛/驴/鱼等动物的结缔组织1 12 23 3类类人人胶胶原原FDA、欧盟对 动物源胶原蛋白医学应用的限制234Cooperman, L. and Michaeli, D., 1984, The immunogenicity of injectable collagen. I. A 1-year prospective study. J Am Acad Dermatol, 10:638-646. Lee, C.H., Singla, A. and Lee, Y., 2001, Biomedical applications of col
3、lagen. Int J Pharm, 221:1-22.Olsen, D., Yang, C.L., Bodo, M., Chang, R., Leigh, S., Baez, J., Carmichael, D., Perl, M., Hmlinen, E.R., Jarvinen, M. and Polarek, J., 2003, Recombinant collagen and gelatin for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev, 55:1547-1567.寻找一种安全、有效并具有良好生物功效的胶原蛋白类材料在组织工程、医药美容等领域受到越来越
4、广泛的关注国外重组胶原蛋白的研究现状l2000年Myllyharju J等人使用甲基酵母表达生产准人纤维胶原蛋白，型5l1998年Nokelainen M等用两种杆状病毒转染昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原II型6l2001年Nokelainen M等使用四种人类基因报道了使用甲基酵母高水平表达I型前胶原7lUitto J等从人皮肤细胞体外培养中得到了，型前胶原8lVaughn PR等在啤酒酵母中表达出了携带有羟基化片断的类人型胶原蛋白9由于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养成本高, 周期长,重组胶原蛋白表达量极低(1%左右)，培养只能限于实验规模, 不可能满足产业化、大批量的需求5Myllyharju
5、 J，Nokelainen M，Vuorela人Kividkko KIExpression of recombinant human type I-III collagens in the yeast pichia pastorisBiochem Soc Trans200028(4)，353-76Nokelainen M，Tu H，VuorelaNotbohm H，Kivirikko KI,Myllyharju JHigh-level production of human type I collagen in the yeast Pichia pastoris Yeast2001 J蚰301
6、8(9)797-8067Nokelainen M，Helaakoski T，Myllyharju J，Notbohm H，Pihlajaniemi TFietzek PP，Kivirikko KIExpression and characterization of recombinant human type II collagens with low and high contents of hydroxylysine and its glycosylated formsMatrix Bi011998 Jan16(6)，329-388Uitto J，Booth BPolak KLCollag
7、en biosynthesis by human skin fibroblasts II Isolation and further characterization of type I and type III procoUagens synthesized in cultureBiochim Biophys Acta1980 Aug 21624(2)，545619Vaughn PR，Galanis M，Richards KM，Tebb TA，Ramshaw JA，Werkmeister JAProduction of recombinant hydroxylated human type
8、1II collagen fragment inSaccharomyces cerevisiaeDNA Cell Bi011998 Jun17(6)，5118中国巨子生物在中国,西北大学的范代娣等10, 11采用PCR(聚合酶链式反应)扩增，得到数段人胶原蛋白基因段，接着进行拼接重复,转化E.coli(大肠杆菌)，并通过高密度发酵培养生产人源性胶原白，所得重组胶原蛋白表达量高达29.4%1210Adaehi T. , et al. Generation of hybrid trans genicsilkworms that express Bombyxmori Prolyl- hy-droxy
9、lase a- subunits and human collagens in posterior silk glands: Production of cocoons that contained collagens with hy-droxylated praline residues J . Journal of Biotechnology 2006, 126( 2) : 205 21911骆艳娥, 范代娣, 花秀夫, 张兮. 重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程研究. 西北大学学报2005, 35( 2) : 18018312胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展 陈光 徐珍珍 吴铭
10、 明胶科学与技术 第31卷第1期 2011 年3 月Vol. 31. No. 1Mar. 2011.科科技技部部对对类类人人世界首创世界首创全球唯一全球唯一国际领先国际领先类人胶原蛋白的来源和制备类人胶原蛋白的创新性类人胶原蛋白的实验研究类人胶原蛋白介绍类人胶原蛋白介绍质粒载体人胶原蛋白基因构建原始菌(不具胶原合成能力)重组菌(胶原蛋白生产菌)基因工程菌的构建反馈补料压力脉冲饥饿胁迫定向调控高密度发酵离心除杂除杂蛋白除内毒素类人胶原蛋白蛋白质分离纯化类人胶原蛋白的基本生物学功能l通过基因重组和生物工程技术得到的，一种水溶性高分子生物胶原蛋白l在结构、特性方面与人类胶原蛋白极为相似，命名它为类人
11、胶原蛋白ECM示意图类人胶原蛋白的创新性无细胞毒性基因工程单细胞蛋白-从根本上杜绝隐患-保证医学应用安全低排异反应无病毒隐患来源于人类基因-结构最大程度相似-修饰过程去除端肽溶于水-没有酸碱溶剂残留-避免影响细胞代谢类人胶原蛋白的创新性单螺旋线性结构pH值6.5-7.5-保持皮肤酸碱平衡-维持细胞粘附性变性温度高酸碱度中性变性温度72-动物胶原37-40-易于储运保存使用分子量90kD-利于皮肤渗透利用-均质结构稳定性强类人胶原蛋白的安全性评价实验全身毒性实验细胞毒性实验皮肤刺激实验眼部刺激实验皮肤过敏实验亚慢性毒性实验遗传毒性实验皮下植入实验由“中国食品药品检定研究院”完成的生物学评价试验植
12、入实验评价:小鼠、家兔皮下植入，90天无不良反应类人胶原蛋白透皮与吸收实验小白鼠背部去毛清洁后，涂抹荧光染料(tritc)标记过的明胶和类人胶原蛋白类人胶原蛋白溶液；于4h，8h分别在涂抹试样区域取1cm2cm大小的皮肤，进行冰冻切片，采用荧光显微镜观察；结果表明：类人胶原蛋白具有较强的透皮吸收行为，而明胶的透皮吸收较差。1414 The Transdermal Absorption Study of Human-Like Collagen. Advanced Materials Research, 415-417: 1781-1985明胶涂抹8h后明胶涂抹4h后类人涂抹8h后类人涂抹4h后皮
13、下 真皮 表皮 皮下 真皮 表皮 类人胶原蛋白促细胞生长实验15程宁,范代娣 类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)， 35(5):581-584, 20050.1%类人胶原蛋白可促进成纤维细胞和上皮细胞的生长，其作用明显优于0.1%的维生素C和0.1%的明胶，其促进细胞生长的速度，是对照组的1.4-1.6倍。类人胶原蛋白促细胞生长实验15程宁,范代娣 类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)， 35(5):581-584, 2005结果显示：结果显示：应用类人胶原蛋白溶液培养细胞，细胞数量有大幅度增加，细胞形态正常、透亮饱满。类人胶原
14、蛋白细胞亲和性实验结果显示：14天时成纤维细胞大量贴附在类人胶原蛋白海绵表面，且生长良好。反映了类人胶原蛋白具有良好的细胞亲和性和相容性。类人胶原蛋白海绵表面类人胶原蛋白海绵表面2BS2BS培养培养1414天后扫描电镜观察天后扫描电镜观察 15程宁,范代娣 类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)， 35(5):581-584, 2005类人胶原蛋白组织相容性实验试验方法：试验方法：将类人胶原蛋白类人胶原蛋白海绵海绵、动物胶原蛋白海绵和可吸收明胶海绵分别植入兔子肝脏，4周后开腹观察植入处的肝组织。16类人胶原蛋白生物相容性实验研究西北大学学报（自然科学版）2004年
15、2月第32卷第1期 作者：西北大学 范代娣，米钰，惠俊峰等类人胶原蛋白细胞核形态正常明胶海绵细胞核皱缩动物胶原海绵细胞核皱缩变形类人胶原蛋白组织相容性实验结果表明：结果表明：明胶海绵和动物胶明胶海绵和动物胶原蛋白海绵原蛋白海绵植入处造成细胞形态和数量改变，组织肿胀，大量炎性细胞浸润类人胶原蛋白海绵类人胶原蛋白海绵对植入处肝细胞形态几乎不造成影响，细胞器的形态较好；组织相容性好，优于供试的其他产品类人胶原蛋白植入处组织形态正常少量炎性细胞浸润明胶海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀动物胶原海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀16类人胶原蛋白生物相容性实验研究西北大学学报（自然科学
16、版）2004年2月第32卷第1期 作者：西北大学 范代娣，米钰，惠俊峰等皮肤美容止血材料骨修复材料人工血管皮下注射填充类人胶原蛋白的应用类人胶原蛋白的应用类人胶原蛋白在皮肤美容领域的应用皮肤美容:眼膜、面膜、喷雾、原液等系列；用于衰老性肌肤紧致抗衰；日常的肌肤养护；皮炎、痤疮、敏感肌肤等问题肌肤的修护。生产环境为万级条件下的局部百级，等同于手术室的洁净要求亲和层析+凝胶过滤层析+超滤 的纯化工艺，可满足体内植入的要求所采用的为注射用水，无菌、无内毒素真正不含防腐剂真正不含防腐剂类人胶原蛋白在皮肤美容领域的应用类人胶原蛋白在医学领域的应用研究可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血可吸收
17、明胶海绵动物胶原蛋白海绵进口可吸收纱布类人胶原蛋白止血海绵可降解止血海绵:主要用于腔内、颅内的外科手术止血马茂，范代娣 壳聚糖-类人胶原蛋白对兔肝创面的止血效果及组织相容性观察，第四军医大学学报，2007，28(12):1122-1124专利成果：p一种可生物降解止血海绵材料及其制备方法。专利号：ZL2006 1 0041913.3p一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法。申请号：200910218514.3类人胶原蛋白在医学领域的应用研究骨修复材料:仿生矿化，制备骨修复材料，用于骨缺损的修复类人胶原蛋白在医学领域的应用研究类人胶原蛋白在医学领域的应用研究人工血管：模拟人体血管结构，仿生制备，
18、用于血管修复类人胶原蛋白在医学领域的应用研究注射填充水凝胶应用领域应用领域采用皮下注射或填充，可用于去皱、丰唇、面部矫形、凹陷填充等。产品特点产品特点 生物相容性优异； 降解时间可控；1.产品可促进注射部位细胞活性和胶原蛋白纤维的再生 研发团队研发成果产业化之路类人胶原蛋白的科研和产业化类人胶原蛋白的科研和产业化类类人人胶胶原原范代娣：v新世纪“百千万人才工程”国家人选v获“中国青年女科学家”提名v享受“国务院特殊津贴”v博士生导师研发团队：v博士研究生20余人v硕士研究生50余人类人胶原蛋白的专业水准lXiaoxuan Ma, Daidi Fan, Long-an Shang, Qiang
19、Cai, Lei Chi, Chenhui Zhu, Yu Mi, Yan-e Luo. Oxygen transfer rate control in the production of human-like collagen by recombinant Escherichia coil. Biotechnology and Biochemistry. 2010,55,4：169-174 (SCI)lWenjiao Xue, Daidi Fan, Longan Shang. Effects of acetic acid and its assimilation in fed-batch c
20、ultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2010.109（3）：257-261 (SCI)lXiao-Jun Wang, Dai-Di Fan, Yan-E Luo. Breakthrough Model of Recombinant Human-Like collagen in Immobilized Metal Affinity Chromatography. Applied Biochemis
21、try and Biotechnology, 2009, 158(2),262-276. (SCI)lWen J Xue, Dai D Fan, Longan Shang, Chen H Zhu, Xiao X Ma, Yuan Y Yu. Production of biomass and recombinant human-like collagen in Escherichia coli processes with different CO2 pulses. Biotechnology Letters. 2009, 31: 221-226. (SCI)lDai D. Fan，L.-H.
22、 Wang，L.-A. Shang et al. A Microcalorimetric Method for Studying the Biological Effects of Mg2+ Ion on Recombinant Escherichia coli. Chemical Biochemical Engineering, 2008, 22(3): 363-368. (SCI)lDAI D FAN, LI H WANG, LONG A SHANG, HUI J SHI, XIAO X MA, YU MI, LI F GU, KANG Z XU. A microcalorimetric
23、method to study the effect of kanamycin on the metabolism of recombinant Escherichia coli Chemical Engineering Communications, 2007，194:1127-1137. (SCI)lYan E Luo, Dai D Fan, Long A Shang, Hui J Shi, Xiao X Ma, Yu Mi, Gui F Zhao. Analysis of metabolic flux in Escherichia coli expressing human-like c
24、ollagen in fed-batch culture, Biotechnology letters, 30(4): 637-643, 2008. (SCI, EI)lDai D Fan, Yane Luo, Yu Mi, Xiao X Ma, Longan Shang. Characteristics of fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA at different specific growth rates. Biotechnology Letter
25、s, 2005, 27: 865870. (SCI, EI)lLUO Yane, FAN Daidi, MA Xiaoxuan, WANG Dewei, MI Yu, HUA Xiufu and LI Wenhong. Process Control for Production of Human-like Collagen in Fed-batch Culture of Escherichia coli BL 21. Chinese J. Chem. Eng., 2005, 13(2):276-279. (SCI, EI)lHUA Xiufu, FAN Daidi, LUO Yane, HA
26、NG X I, SHI Huijuan, MI Yu, MA Xiaoxuan, SHANG Longan, ZHAO Guifang. Kinetics of High Cell Density Fed-batch Culture of Recombinant Escherichia coli Producing Human-like Collagen. Chinese J. Chem. Eng., 2006, 14(2): 242-247. (SCI, EI)l60余篇SCI文献报道类人胶原蛋白的专业水准l国家自然科学基金：工程控制策略有效解除大肠杆菌培养过程中乙酸抑制机理探索（21076
27、169）l国家自然科学基金：周期性饥饿协迫对重组大肠杆菌高密度培养的影响（31000019）l国家自然科学基金：重组类人胶原蛋白大肠杆菌表达体系高密度发酵的代谢调控及动力学（20606026）l国家自然科学基金：重组E. coli类人胶原蛋白表达体系多聚体现象研究(20476085)l国家高技术产业化示范工程发展计划：基因工程技术生产类人胶原蛋白生物材料高技术产业化示范工程发改高计(2004)2563l国家科技部863计划：重组类人胶原蛋白可降解材料制造关键技术及应用(2006AA02Z246)l国家科技部创新基金：重组基因工程菌生产类胶原蛋白(01C26216110599)l国家火炬计划：类
28、人胶原蛋白(2002EB021307）l利用重组类人胶原矿化仿生制备骨修复材料及应用(2007AA03Z456)l类人胶原蛋白人工血管体外构建过程的工程学（20776119）l新型有机无机杂化纳米生物功能材料复合制备及控制机理（21006079）l13项国家级科研项目类人胶原蛋白的专业水准l一种类人胶原蛋白及其生产方法。专利号：ZL 01 1 06757.8l胶原蛋白敷料。专利号：ZL 2011 2 0413968.9l一种可生物降解止血海绵材料及其制备方法。专利号：ZL2006 1 0041913.3l一种制备可生物降解的组织工程用支架材料的方法。专利号：ZL2006 1 0041912.9
29、l一种制备可生物降解的组织工程用血管内层支架材料的方法。专利号：ZL 2009 1 0022613.4l一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法。专利号：ZL 2009 1 0022614.9l一种提纯橄榄多酚初品中酪醇的方法。专利号：ZL 2009 1 0022997.Xl一种双歧杆菌微胶囊及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147416.2l一种胶原蛋白滴眼液及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147418.1l一种胶原蛋白温敏型水凝胶及其制备方法。专利号：ZL 2011 1 0147417.7l一种制备可生物降解组织工程用仿生人工骨材料的方法。申请号：200
30、910023001.7l一种制备可生物降解的组织工程用血管外层支架材料的方法。申请号：200910022612.Xl21项国家发明专利类人胶原蛋白的产业化之路可复美“II类医疗器械”上市第9次获国家自然科学基金支持1999-20012003-20052006-20092011国家5部委授“国家重点新产品”科技部火炬计划、中小企业创新基金项目发改委高技术产业化示范工程项目项目，建设生产研发基地2次纳入科技部“863”计划GMP建厂，可丽金上市SFDA的注册申报可复美范代娣博士从MIT归国开始研究类人胶原蛋白实验室研发取得突破成立西安巨子，申请国家发明专利类人胶原蛋白的产业化之路l 2011年11月29日，国家发改委授予生物材生物材料国家地方联合工程研究中心料国家地方联合工程研究中心，标志着巨子生物成为国家级科学研究机构的一员l 获2011年陕西省科学技术一等奖l 纳入国家十二五科学和技术发展规划西安巨子生物基因技术股份有限公司Human-like Collagen类人胶原蛋白
