1、PCR PCR(Polymerase Chain Reaction)Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.Peoples Choice ReactionThe PCR cyclel95 step to denature the duplex DNA,lAn annealing step of around 55 to allow the primers to bind,l72 polymerization step.lMg2+,dNTPs are required in addition to template,
2、primers,buffer and enzymePCR processPrinciple of PCRResult of PCR历史历史60s-70s：基因的体外分离技术。Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当 (1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能！KaryKary Mullis(1985) Mullis(1985)发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写
3、到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。PCRPCR发展速度发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 proceduresltemplate(DNA or RNA),template(DNA or R
4、NA),lprimers,primers,lTaqTaq enzyme, enzyme,l1010PCR buffer,PCR buffer,lMgMg+,+,l5mmol/L dNTPs5mmol/L dNTPslpre-denaturationpre-denaturation-denature completelydenature completelylDenaturationDenaturationlannealingannealinglElongationElongationlcycles:25-30cycles:25-30PCR reaction components and the
5、ir functionstemplate：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.DNA：very stableprimesIf the PCR product is to be cloned, it is sensible to
6、 include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5-ends of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthStore:纯化引物在25乙腈溶液中4；冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个月。不用时应-20保存。buffer10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20)。Mg2+：for Taq polymerase activityconc.:Low:low activity high: non-s
7、pecific amplificationdNTPs：贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20保存。4种dNTP浓度应相同。TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase：from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquaticus.other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.min
8、eral oilPCR optimization变性温度和时间92-95，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72，接近Taq酶的最适75时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理技术的原理(Real time Quantitative PCR)实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加
9、入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应扩增反应中中
10、每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标和标准曲线的分析对准曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分进行定量分析析实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 扩增曲扩增曲线线扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光
11、检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信
12、号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理在
13、扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域域值的循环数即值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量就可计算出样品中所含的模板量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模
14、板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Sample实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 绝对定量绝对定量25PCR技术的应用遗传性疾病遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病 临床检验肝炎 （甲肝、乙肝、丙肝。）性病肿瘤法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一
15、根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。植物遗传育种植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜畜 牧牧畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼植物保护植物保护杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分其他考古学植物分类学群体生态学
