1、微生物的遗传变异和育种 遗传性：亲代具有把他所有的性状给子 代的特性 变异性：子代具有改变亲代遗传性状的 特征 遗传型（genotype）:生物的全部遗传因子及基因生物的全部遗传因子及基因 表型（phenotype）:遗传型遗传型 + 环境条件环境条件生长发育生长发育形态等生物学特征的总和形态等生物学特征的总和 表型是由遗传型所决定，但也和环境有关表型是由遗传型所决定，但也和环境有关 变异（varition）:遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 饰变（modification）:表型的差异只与环境有关表
2、型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为第一节 遗传变异的物质基础三个经典实验 转化试验 噬菌体感染试验 病毒的重建试验朊病毒的发现和思考蛋白质是否是遗传的物质基础Prpsc（具有传染性的蛋白质致病因子）蛋白质折叠磷酸碱基核糖碱基有四种： 腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G） 胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C） AT， C = GGC含量如GC含量为40，则G：C：A：T 0.2：0.2：0.3：0.3大沟，小沟都是由于碱基对堆积和糖-磷酸骨架扭转造成的。 DNA大沟所带遗传信息比小沟多；沟的宽窄深浅直接影响到调控蛋白对DNA遗传信息的识别
3、。 大沟是蛋白质识别DNA的碱基序列发生相互作用的基础,使蛋白质和DNA可结合而发生作用。 l基因是一个特定的遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位原核生物原核生物: :1）染色体为双链环状）染色体为双链环状 的的DNA分子（单倍体）分子（单倍体）2）基因组上遗传信息）基因组上遗传信息 具有连续性具有连续性3）功能相关的结构基因）功能相关的结构基因 组成操纵子结构组成操纵子结构操纵子操纵子（operonoperon）：）：功能相关的几个基因前后相连，再加一组共同功能相关的几个基因前后相连，再加一组共同的控制位点（启动子、操作子等）构成操纵子的控制位点（启动子、操作子等）构成操纵子在调节
4、基因协同作用下，实现基因表达在调节基因协同作用下，实现基因表达真核微生物（啤酒酵母）的基因组真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）没有明显的操纵子结构）没有明显的操纵子结构2）有间隔区（即非编码区）有间隔区（即非编码区）（内含子序列）（内含子序列）l基因的多样性重叠基因（在原核生物中多见）断裂基因（真核生物）可移动基因（转座因子）重迭基因有三种重叠方式：重迭基因有三种重叠方式：*一个基因完全在另一个基因内部一个基因完全在另一个基因内部*部分重叠部分重叠*两个基因共用少数碱基对两个基因共用少数碱基对 *一个基因完全在另一个一个基因完全在另一个基因内部基因内部如：如：B和和A， E和和D 其读码结构互
5、不相同其读码结构互不相同 -ATG-/-AATGCC -/-ATAACG-/-TAA-A*BATGCCG-GGATAA*部分重叠部分重叠 如：如： K和和C *两个基因共用少数两个基因共用少数碱基对碱基对 如：如： D和和J-TAATG-D 终止密码子终止密码子J 起始密码子起始密码子断裂基因：断裂基因： 基因的不连续性基因的不连续性Intron 和和Exon: 大多数真核生物蛋白质基大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序因的编码顺序(Exon)都被都被或长或短的非编码顺序或长或短的非编码顺序（间隔顺序）（间隔顺序）(Intron)隔开隔开基因突变（gene mutation） 细胞的遗传物质的分
6、子结构或数量发生可遗传的变化v 遗传物质DNA并不像人们想像的那么稳定，它在细胞各种内外环境因素影响下，可不断地出现损伤(damage) DNA碱基序列及组成的变化 。营养缺陷型（auxotroph）抗性突变型（resistant mutant）条件致死突变型（conditional lethal mutant） 形态突变型（morphological mutant）抗原突变型（antigenic mutant）产量突变型（metabolite quantitative mutant）l营养缺陷型菌株 野生型菌株发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，从而不能在基本培养基上生长的变异菌
7、株his+his-l抗性菌株 野生型菌株发生基因突变而对某化学药物或致死物理因子产生抗性的菌株 strr条件致死突变型 菌株发生基因突变后,在某种条件下可正常生长，而在另一种条件下无法生长 例：温度敏感突变：例：温度敏感突变：（Temperaturesensitive， Ts ） E.coli 在在42下（原来可以在下（原来可以在42生活）致死生活）致死 在在37生活正常生活正常l形态突变型 菌株发生基因突变，而在个体形态或菌落形态上发生突变的菌株l抗原突变型菌株 菌株发生基因突变，而在细胞抗原结构上发生变异的菌株l产量突变型菌株 菌株发生基因突变，在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株正
8、变株（plus-mutant）负变株（minus-mutant）l突变热点 突变几率较高的碱基序列。 DNA分子上的甲基化， 甲基最常见的是加在胞嘧啶，从而形成5-甲基胞嘧啶； 它经脱氨基作用就转变成胸腺嘧啶，如果DNA 修复系统不完善，G：C就可能变成G：T 的错配。导致基因突变。DNA的损伤与修复的损伤与修复 DNA损伤的类型损伤的类型DNA损伤的修复损伤的修复 自发性损伤自发性损伤环境因素引起的环境因素引起的DNA损伤损伤DNA损伤的类型损伤的类型一、一、DNA的自发性损伤的自发性损伤(一一)DNA的复制错误的复制错误 复制错误引起损伤，在DNA损伤中最为多见。 复制错误最多见于尿嘧啶(
9、U)的渗入，另外偶有其它碱基的渗入。(二二)DNA的修复合成的修复合成 DNA的修复合成又称DNA非程序性合成 (unscheduled DNA Synthesis, UDS)。 DNA 修复合成的DNA聚合酶不同于DNA复制的 DNA聚合酶，它催化的DNA修复合成同样 可以发生碱基配对错误，造成DNA突变。(三三)碱基的自发改变碱基的自发改变1、脱氨基：、脱氨基：即胞嘧啶、腺嘌呤及鸟嘌呤的环外氨 基自发丢失。胞嘧啶尿嘧啶；腺嘌呤次黄 嘌呤；鸟嘌呤黄嘌呤。脱氨基所至的碱基转 变可影响DNA的复制，由此产生突变。2、碱基丢失：、碱基丢失：即脱嘌呤或脱嘧啶作用，是指DNA上丢掉了嘌呤碱或嘧啶碱，形
10、成无碱基位点，称为AP部位部位 (apyrimidine，apurine site , AP)。在生理状态下，脱嘌呤是脱嘧啶的20倍。(四四)正常代谢产物对正常代谢产物对DNA的损伤的损伤 细胞进行生物氧化时不断产生氧自由基，可引起 DNA的氧化损伤，造成DNA链的断裂。(五)互变异构体(六)背景辐射二、环境因素引起的二、环境因素引起的DNA损伤损伤1、化学物质：、化学物质：1）烷化剂：使DNA分子嘌呤碱基特别是鸟嘌呤烷基化，包括N7、N3、O6及磷酸骨架位置。2）羟胺类；3）亚硝酸盐；4）碱基类似物，如5-BU5）丫啶类染料2、物理因素：、物理因素： 紫外线与电离辐射等。NH2OH (Hyd
11、roxylamine HA 羟胺羟胺)OHHA 羟胺羟胺 碱基类似物（碱基类似物（Base analog）5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(BrU)5-Bromine Uracil 5-BrU: G: A 烯醇式烯醇式enolenolBrOHHOAGCTTCCTATCGAAGGATAGCTBCCTATCGAAGGAT酮式5-BrU的渗入AGCTBCCTATCGAAGGATAGCTCCCTATCGAGGGAT第二轮复制ATGC 转变转变AGCTBCCTATCGAGGGATAGCTTCCTATCGAAGGAT第一轮复制酮式到稀醇式的转变l丫啶类染料吖啶橙吖啶橙 (Acridine Orange (Acridi
12、ne Orange ，AO) ) -ATTTTTCG -TAAAAAGC-分子插入分子插入结果产生移码突变结果产生移码突变-AT AO TTTTCG-TA X AAAAGC-ATXTTTTCG-TAX AAAAGC-紫外线的致突变作用紫外线的致突变作用-嘧啶二聚体嘧啶二聚体 (TT dimer )U.V.C T T Al物理因素引起的损伤： 在长期的进化过程中，生物体演化出了一整套十分有效的修复系统，包括：光修复系统切除修复系统重组修复系统SOS修复系统一、光复活修复一、光复活修复光复活修复是一酶促反应过程，催化该反应的酶称光复活酶。UV光修复酶光修复酶NNOOCH3NNOOCH3RRPNNO
13、OCH3NNCH3OOHHRRP嘧啶二聚体的形成与解聚嘧啶二聚体的形成与解聚二、切除修复二、切除修复v 切除修复是一酶促反应过程，主要包括三步反应：切除修复是一酶促反应过程，主要包括三步反应： DNA特异内切酶或糖苷酶识别DNA的损伤部位， 并在损伤位点的5端切断DNA链，然后在53外 切酶的作用下逐步切除损伤的DNA片段。 DNA修复聚合酶在缺口处催化DNA合成，使其取 代损伤的DNA片段。 在DNA连接酶的作用下，使新合成的DNA 片段与 原有的DNA片段连接，以恢复DNA原有的结构。 v 切除修复分为碱基切除修复和核苷酸切除修复( (一一) )碱基切除修复碱基切除修复碱基切除修复有三种情
14、况：1、当碱基因烷基化而损伤时，可在脱烷基酶作用下将碱基转移到一种受体蛋白上，以完成修复。2、碱基的其它损伤(多为自发性损伤)，需启动DNA糖苷酶糖苷酶修复系统修复系统。即在特异DNA糖苷酶的作用下，除去损伤碱基，此时产生了AP部位，又有两种修复方式。AP部位可在碱基插入酶的作用下，以完整链为模板，按碱基配对原则补回正确的碱基。AP部位也可在AP内切核酸酶的作用下，在损伤位点的5端切开，然后由53外切酶切除损伤的碱基片段，再由 DNA修复聚合酶在缺口处催化DNA合成，最后由DNA连接酶连接缺口，以完成修复。v AP内切核酸酶，也称为无碱基内切核酸酶。内切核酸酶，也称为无碱基内切核酸酶。A T
15、C G A G T C GT A G C T C A A CA T C G A G T C GT A G C T C A C糖苷酶糖苷酶A T C G A G T C GT A G C T C A G CA T C G A G T C GT A G C T C A CA T C G A G T C GT A G C T C A G CAP内切核酸酶内切核酸酶插入酶插入酶A T C G A G T C GT A G C T C A G C脱烷基酶脱烷基酶碱基切除修复碱基切除修复外切核酸酶、修复外切核酸酶、修复聚合酶、连接酶聚合酶、连接酶v DNA糖苷酶糖苷酶广泛存在于所有生物体内，对于生物体的生
16、存十分重要。如果这类酶的基因发生突变，细菌生长状况很差。DNA糖苷酶依其是否具有AP内切酶活性分两类：第一类：第一类：不具有AP内切酶活性，如尿嘧啶糖苷酶、次黄嘌呤糖苷酶、3-甲基腺嘌呤糖苷酶等；第二类第二类：具有AP内切酶活性，如嘧啶二聚体糖苷酶。尿嘧啶糖苷酶修复系统：尿嘧啶糖苷酶修复系统：对于纠正复制错误尤为重要。A T C G A G TT A G C U C AA T C G A G TT A G C C AA T C G A G TT A G C C AA T C G A G TT A G C T C A尿嘧啶糖苷酶尿嘧啶糖苷酶UAP内切酶内切酶连接酶连接酶外切酶外切酶修复聚合酶修复
17、聚合酶dUTP渗入渗入胞嘧啶脱氨胞嘧啶脱氨嘧啶二聚体糖苷酶修复系统：嘧啶二聚体糖苷酶修复系统： 嘧啶二聚体糖苷酶识别嘧啶二聚体部位嘧啶二聚体糖苷酶识别嘧啶二聚体部位 5 断开糖苷键断开糖苷键 形成一个形成一个AP位点位点自身自身AP内切酶内切酶 切开二酯键切开二酯键外切酶切去二聚体外切酶切去二聚体聚合酶合成聚合酶合成DNA链链 连接酶连接酶完成修复完成修复3、碱基丢失的修复：、碱基丢失的修复： 碱基丢失可产生AP位点，一方面利用AP内切酶、53外切酶、聚合酶和连接酶的修复作用；另一方面直接利用插入酶补回正确的碱基。关于碱基插入酶的生物学意义不十分清楚，它可能为修复AP位点提供了一条更为迅捷的途
18、径，当AP内切酶基因突变时，这一途径更为重要。(二二)核苷酸的切除修复核苷酸的切除修复DNA错配修复系统：错配修复系统： 大肠杆菌错配修复系统参与因素：大肠杆菌错配修复系统参与因素：三种错配修复基因的表达产物MutS、MutL和 MutH启动该系统。GATC内切核酸酶(错配矫正酶)与MutH蛋白一起 切开单链。DNA解螺旋酶解螺旋。双向外切核酸酶依次切除错配的核苷酸。DNApol填补空隙。DNA连接酶完成修复。错配修复过程：错配修复过程：MutS识别结合到错配部位，形成MutS-DNA错配复合物启动MutL与错配复合物结合，激活GATC核酸内切酶和MutH蛋白二者对含有错配碱基和GATC序列的
19、单链进行内切DNA解螺旋酶(MutH蛋白)解螺旋双向性外切核酸酶依次切除错配的核苷酸DNApol以甲基化的亲代母链为模板填补空隙DNA连接酶连接切口完成修复CH3CH35 3 CH3CH35 3 MutLMutSMutHCH3CH35 3 解螺旋酶解螺旋酶外切核酸酶外切核酸酶CH3CH35 3 DNApolDNA连接酶连接酶三、重组修复三、重组修复v 这种修复是指DNA分子损伤范围较大，来不及修复就进行复制，复制后再进行切除修复，故又称复制后修复。3 5 5 复制3 5 3 5 3 5 3 5 3 诱导激活诱导激活RecA蛋白蛋白5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 损伤的损伤的DN
20、A分子分子切除修复切除修复 DNApolDNA连接酶连接酶RecA蛋蛋白脱落白脱落大肠杆菌的重组修复大肠杆菌的重组修复v recA基因的激活：基因的激活：recA基因基因损伤损伤DNA诱导激活诱导激活 DNA-RecA蛋白结合物蛋白结合物水解水解LexA蛋白蛋白recA基因基因 高浓度的mRNA和RecA蛋白低浓度的mRNA和RecA蛋白LexA 阻遏蛋白阻遏蛋白被降解的被降解的LexA蛋白蛋白v RecA蛋白(378KD)是一种多功能酶：重组DNA活性；单链DNA结合活性；蛋白酶活性，即能水解LexA阻遏蛋白中的丙氨酸残基与甘氨酸残基之间的肽键，破坏其阻遏作用。 一旦重组修复完成，诱导信号消
21、失， RecA蛋白不再活化，细胞内LexA阻遏蛋白重新增加，修复过程即被终止。四、四、SOS修复修复 SOS修复是50年代在大肠杆菌中发现的，也称错误倾向修复。与与SOS修复有关的基因主要是修复有关的基因主要是recA基因和基因和lexA基因。基因。 正常情况下，细胞SOS系统是关闭的，各基因均被LexA阻遏蛋白所封闭而没有活性，很少产生转录产物。所有SOS基因的操纵子都含有20个bp的LexA结合位点，高度保守，称为SOS框框(SOS box)。 LexA阻遏蛋白分子量22700，由lexA基因编码，在正常细胞内非常稳定，控制着许多操纵子、特别是各种修复基因的表达。 lexA基因也受其产物L
22、exA蛋白的控制，为自身负向控制，且lexA基因具有前后相连的两个SOS框。 当当DNA损伤时，损伤时，recA基因被激活，基因被激活，RecA蛋白表达增强并与蛋白表达增强并与单链单链DNA结合，激活蛋白酶活性，水解结合，激活蛋白酶活性，水解LexA阻遏蛋白，阻遏蛋白，SOS基因开放，修复酶及相关蛋白表达，急救修复损伤的基因开放，修复酶及相关蛋白表达，急救修复损伤的DNA。 同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子 错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变无
23、义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变 为蛋白合成的终止密码子为蛋白合成的终止密码子 自发突变与育种 Breeding by spontaneous mutation从生产中育种定向培育优良菌株维持原有的产物的合成水平(稳产)诱变后的菌株群体中表现出各种生理特性需要纯化诱变育种的几个方向提高产量改进产品质量产生新的生物活性物质表型延迟（phenotype lag） 遗传型虽已突变,但表型却要经染色体复制、分离和细胞的分裂后才表现出来 出发菌株诱变初筛复筛放大获得优良变异株两个主要的环节 诱变（induced mutation） 筛选（screening）诱变剂的选择：简便有效诱变剂的种类
24、物理诱变剂化学诱变剂拟辐射物质（radiomemetic chemical） l利用和创造形态、生理和产量之间的相关指标l设计高效的筛选方法 推理选育l抗药性突变株的筛选l营养缺陷型菌株的筛选l产量突变株的筛选 万古霉素分子由两个基本结构组成：糖基部分和肽基部分中心七肽核,七肽核主链中的非蛋白源氨基酸3，5-二羟基苯基甘氨酸由醋酸盐通过聚酮作用而生成，因此醋酸盐是万古霉素生物合成的重要前体。根据万古霉素生物合成途径选育醋酸钠耐性变株，获得高产变株。l青霉素：耐受缬氨酸 苯乙酸l螺旋霉素的生物合成主要受到易利用碳源的调节、速用氮源的阻遏通过对2-脱氧葡萄糖、氨基乙酸 抗性变种的选育，得到解除反馈
25、的突变菌株，使积累更多的螺旋霉素。l阿卡波糖(acarbose)（a-葡萄糖苷酶抑制剂，用于口服降血糖）l其生物合成主要受到易利用的结构类似物麦芽糖(maltose)的阻遏和终产物的反馈抑制。通过诱变育种可部分解除其合成途径中的阻遏和抑制作用，促进产物合成。l获得抗高浓度麦芽糖突变株或解除前体生物合成途径中反馈抑制的突变株，以提高前体的生成速率，满足生物合成需要l：l原生质体融合通过人工的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，从而获得兼有两亲本遗传性状的重组子l原生质体技术的优越性去掉了细胞壁的障碍，亲株基因组可直接融合、交换，并为链霉菌实现基因转化创造了条件二亲株的基因组之间可发
26、生多次交换，得到多种类型的重组子，且参与融合的亲株不限于一个，可以多至3、4个重组频率高可用诱变的方法直接处理原生质体，提高突变率再生成细胞壁的过程常伴随治理的消除，使染色体发生改变以其简单，操作方便，不需要贵重药品 如何得到原生质体l菌体（菌丝）培养l细胞壁的去除原生质体的融合（再生）检出重组子l原生质体技术的应用利用原生质体形成及再生达到改良亲本的目的：大环内酯类抗生素利用原生质体诱变提高突变率：庆大霉素利用原生质体融合获得性的抗生素：Indolizomycinl基因组重排(Genome shuffling ) 多亲本基因组重组 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)合成泰
27、乐菌素是产量提高9倍 l基因工程(gene engineering): 人工的 离体的 分子水平上的遗传重组技术l基本操作获取目的基因优良载体的选择目的基因与载体DNA的体外重组重组载体导入受体细胞（转化）重组受体细胞的筛选和鉴定工程菌的表达限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶的命名：取微生物属名的第一个字母和种名的头取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoRI表示大肠
28、杆菌属名第一个字母表示大肠杆菌属名第一个字母E：表示种名头两个字母表示种名头两个字母co：表示株名表示株名R：表示该菌中第一个被分离出来的酶。表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：EcoRI：5 - G A A T T C - 33 - C T T A A G - 55 - G A A T T C - 33 - C T T A A G - 5l对质粒载体的要求是一个独立的复制子具用较多的单一限制性内切酶位点有方便的筛选标记具有外源DNA片段插入失活的附加标记高拷贝数常用的基因工程宿主常用的基因工程宿主1）大肠杆菌大肠杆菌3）酵母）酵母2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌特点：生长迅速、极易培养、能在廉
29、价培养基中特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中 生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚4）动物细胞）动物细胞1）大肠杆菌：大肠杆菌：几乎所有的有关重组几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主a）条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株）条件致病菌，故存在潜在的致病性，即使非致病的菌株 仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。仍能产生内毒素，有可能污染表达产物。b）外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确）外源基因的表达产物，易被蛋白水解酶降解或不能正确 加工折叠加工折叠。不足
30、之处不足之处：2）枯草芽孢杆菌：）枯草芽孢杆菌：不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。且已有合适的质粒载体用于转化。不足之处：不足之处：质粒往往不稳定质粒往往不稳定3）酵母：）酵母：基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等真核生物；真核生物；具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行大量宿主安全试验。大量宿主安全试验。4）动物细胞：）动物细胞：有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生
31、理学的许多研究均有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均需在动物细胞特别是哺乳动物细胞中进行需在动物细胞特别是哺乳动物细胞中进行。细胞培养费用昂贵、难于操作；细胞培养费用昂贵、难于操作；克隆基因的表达水平极低；克隆基因的表达水平极低；l离体定向诱变与蛋白质工程蛋白质工程：通过对蛋白质结构和功能间规律的详细了解，按照人们预定的模式，人为地改变蛋白质结构，从而创造出有新奇性质蛋白质的过程主要对关键性的氨基酸作人为的更改以某个典型的折叠进行“从头设计”1. 从预期的蛋白质功能出发从预期的蛋白质功能出发2. 设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构3. 推测应用的氨基酸序列推测应用的氨基酸
32、序列4. 找到相应的脱氧核苷酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列l设计分成三类 l1.小范围改造:对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，来研究和改善蛋白质的性质和功能l2. 较大程度的改造:对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，期望转移相应的功能l3.蛋白质从头设计 (de novo or abinitio protein design)l给定一个目标三维结构，要求找出与已知顺序无明显同源，能折叠成目标结构的氨基酸顺序来。 l离体定向诱变技术缺失突变插入突变碱基置换突变寡聚核苷酸参入（位点定向诱变）l最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在19821985年间对酪氨酰tRNA合成酶的分子改造
33、工作。l根据X衍射,实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。l佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高l显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。l1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH6时的活力提高10倍l工业用酶最佳pH的改变预示可带来巨大经济效益。提高提高葡萄糖异构酶的稳定性的稳定性
34、l第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸l体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高1012；酶比活相同。lPro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。蛋白质活性的改变蛋白质活性的改变l胰岛素在高浓度（大于105mol/L）时以二聚体形式存在，低浓度时（小于109mol/L）时主要以单体形式存在。l类胰岛素生长因子I(IGFI)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGFI不形成二聚体。lIGFI的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28ProB29Lys氨基酸序列与胰岛素B链的B28B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28LysB29Pro，获得单体速效胰岛素。胰岛素的一级结构及不同动物胰岛素在A链中的差异
