1、原核生物原核生物DNADNA复制复制过程过程第三节第三节一、复制的起始一、复制的起始二、复制的延长二、复制的延长三、复制的终止三、复制的终止 一、复制的起始一、复制的起始1. DNA解开成单链，形成复制叉，提供模板解开成单链，形成复制叉，提供模板3. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端末端2. 形成形成引发体引发体 复制的起始复制的起始（一）（一）DNA的的解链解链1、复制有固定起始点、复制有固定起始点2、DNA解链需多种蛋白质参与解链需多种蛋白质参与3、解链过程中需要、解链过程中需要DNA拓扑异构酶拓扑异构酶3 3 5 5 5 5 3 3 DnaBDnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaCDn
2、aCSSBSSB含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA复复制起始区域的复合结构称为制起始区域的复合结构称为引发体引发体。 DnaGDnaG引物酶引物酶DNADNA拓扑拓扑异构酶异构酶（二）引发体形成和引物合成（二）引发体形成和引物合成引物的合成引物的合成3 5 5 3 DnaB解螺旋酶解螺旋酶DnaCSSBDNA拓扑拓扑异构酶异构酶合成引物合成引物 DnaG引物酶引物酶解链方向解链方向1、引物：短链、引物：短链RNA分子分子2、合成方向：、合成方向： 533、 提供提供3 -OH末端末端二、复制的延长二、复制的延长酶：酶：DNA-pol 原料：原料
3、：dNTP化学本质：磷酸二酯键的生成化学本质：磷酸二酯键的生成合成方向：合成方向： 53 领头链：连续领头链：连续随从链：不连续随从链：不连续半不连续复制半不连续复制 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol 目目 录录复制的延长复制的延长目目 录录1 1、前导链复制先于后随链、前导链复制先于后随链2 2、两链在同一酶催化下进行延、两链在同一酶催化下进行延长长DNA-pol 三、复制的终止三、复制的终止切除引物切除引物：RNA酶酶填补空缺填补空缺：DNA-Pol I连接切口连接切口：DNA连接酶连接酶 原核生物基因是环状原核生物基因是环状
4、DNA，双向复制的，双向复制的复制片段在复制的终止点复制片段在复制的终止点( (ter) )处汇合。处汇合。5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶后随链上不连续性片段的连接：后随链上不连续性片段的连接：切除引物切除引物填补空缺填补空缺连接切口连接切口复复制制过过程程简简图图真核生物真核生物DNADNA复制复制过程过程第第四四节节（一）复制的起始（一）复制的起始（二）复制的延长（二）复制的延长（三）复制的终止（三）复制的终止注意：原核生物注意：原核生物 E.Coli 的的DNADNA是环状双链；是环状双链；真核生物为线状双
5、链真核生物为线状双链DNADNA。 真核生物的真核生物的DNADNA生物合成生物合成 复制时间：分裂间期的复制时间：分裂间期的S S期期 打开双链形成复制叉打开双链形成复制叉 引发体引发体 RNA引物引物多染色体、多起始点、多复制子多染色体、多起始点、多复制子复制起始点：复制起始点：Oric短、富含短、富含AT序列序列复制有时序性复制有时序性特点特点一、真核生物复制的起始一、真核生物复制的起始 与原核生物基本相似与原核生物基本相似n 引物酶：引物酶：DNA-Pol n 解螺旋酶：解螺旋酶： DNA-Pol n 拓扑酶拓扑酶n 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（PCNA）n 复制因子复制因子（ RF
6、A SSB、RFC等）等）复制起始需要的一些酶和因子复制起始需要的一些酶和因子 PCNA为同源三聚体，可形成闭合环形的为同源三聚体，可形成闭合环形的“DNA夹子夹子” (与与DNA-Pol的的-亚基亚基有相同的功能和相似的构象有相同的功能和相似的构象。)u PCNA是是Pol 的的可滑动的夹子可滑动的夹子： 在在RFA的作用下的作用下 PCNA结合于引物结合于引物-模板链上模板链上，使使Pol 获得获得持续合成能力。持续合成能力。u PCNA可与许多蛋白质分子结合，是协调可与许多蛋白质分子结合，是协调DNA复制、复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。损伤修复、表观遗传和细胞周期调控
7、的核心因子。增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（PCNA）引物引物核小体核小体二、真核生物复制的延长二、真核生物复制的延长353延长的主要酶：延长的主要酶： DNA-Pol 延长过程：延长过程：和和互换互换引物、冈崎片段引物、冈崎片段比原核生物短比原核生物短后随链后随链前导链前导链亲代亲代DNADNA35535复制延长的总结uDNA聚合酶聚合酶 / 转换：转换：在复制叉及引物形成后在复制叉及引物形成后， DNA-Pol通过通过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代DNA- Pol，在，在RNA引物的引物的3-OH上连续合成子链；上连续合成子链；u真核生物以复制子为单位进行复制，真核生物以复
8、制子为单位进行复制，其引物和冈崎其引物和冈崎 片段都比原核生物的短片段都比原核生物的短；u真核生物冈崎片段的长度大致与一个核小体所含真核生物冈崎片段的长度大致与一个核小体所含 DNA的碱基数或其若干倍相等；的碱基数或其若干倍相等；u真核生物真核生物DNA-Pol的催化效率远比原核生物慢，但的催化效率远比原核生物慢，但 复制的整体速度不慢。复制的整体速度不慢。三、真核生物复制的终止三、真核生物复制的终止切除引物切除引物：RNA酶、核酸外切酶酶、核酸外切酶填补空隙：填补空隙：DNA-Pol / 片段连接：片段连接：连接酶连接酶( (冈崎片段、复制子）冈崎片段、复制子） DNA合成后，立即组装成核小
9、体合成后，立即组装成核小体问题？问题？ 线性染色体两端线性染色体两端DNA子链上，子链上，5 5端端RNA引物去除后留下空隙该如何填补？引物去除后留下空隙该如何填补？已知：已知：1 1、DNA-Pol 不能催化两个游离的不能催化两个游离的dNTP聚合聚合2 2、DNA单链的母链易被单链的母链易被DNase水解。水解。四、染色体末端复制四、染色体末端复制端粒酶端粒酶20092009年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。伊丽莎白伊丽莎白布莱克本布莱克本Elizabeth Blackburn卡罗尔卡罗尔-格雷德格雷德Ca
10、rol Greider杰克杰克绍斯塔克绍斯塔克Jack Szostak 端粒端粒(telomere)(telomere) 真核生物染色体线性真核生物染色体线性DNADNA分子末端膨大的特殊分子末端膨大的特殊的结构。的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性 结构特点结构特点 由末端由末端单链单链DNA序列和序列和蛋白质蛋白质构成。构成。 该序列是多次重复的富含该序列是多次重复的富含T、G碱基碱基 的短序列的短序列（TnGn）x。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶 ( (telomerase) ) 端粒酶端粒酶RNA（An、Cn）x
11、( hTR) AAAACCCCAAAACCCC. 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白 ( hTP1) 端粒酶端粒酶逆转录酶逆转录酶 ( hTRT) 功能：提供功能：提供RNA模板、催化逆转录模板、催化逆转录端粒酶通过端粒酶通过爬行模型爬行模型的机制维持染色体的完整的机制维持染色体的完整组成组成5端粒酶的端粒酶的RNARNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC353GTTTTGGGTTTTGG3OH端粒端粒DNADNA末端末端TGGTTTG3OH内在模板内在模板RNARNATGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNARNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGTTT
12、GGGGGGGGGTTTTGGTTTT5端粒酶的端粒酶的RNARNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol端粒酶靠其端粒酶靠其hTR（AnCn）x 辨认及结合母链辨认及结合母链DNA（TnGn）x的的重复序列并结合至其重复序列并结合至其3 3端，开始以逆转录的方式复制延伸母链。端，开始以逆转录的方式复制延伸母链。复制一段后，复制一段后，hTR（AnCn）x 爬行移位至新合成的母链爬
13、行移位至新合成的母链3 3端再以端再以逆转录的方式继续复制延伸母链。逆转录的方式继续复制延伸母链。延伸至足够长度后，端粒酶脱离母链，代之以延伸至足够长度后，端粒酶脱离母链，代之以DNA-pol，此时母，此时母链形成非标准的链形成非标准的G-G发夹结构允许其发夹结构允许其3-OH反折，同时起引物和反折，同时起引物和模板的作用，在模板的作用，在DNA-pol的作用下完成末端双链的复制。的作用下完成末端双链的复制。逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 第五节第五节逆转录逆转录( ( reverse transcription ) ) 逆转录逆转录酶酶 一、逆转录病毒和逆转录一、逆转录病毒和逆转录
14、 u 逆逆转录转录：就是以：就是以RNA为模板，由逆转录酶催化为模板，由逆转录酶催化4种种dNTP聚合、产生聚合、产生DNA的过程，又称的过程，又称RNA指导的指导的DNA合成。合成。u 逆转录病毒：含有逆转录酶的逆转录病毒：含有逆转录酶的RNA病毒。病毒。是多功能酶，有三种酶活性：是多功能酶，有三种酶活性：RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性 RNase H活性活性DNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性逆转录酶逆转录酶( ( reverse transcriptase ) )全称：依赖全称：依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶 逆转录的过程逆转录的过程 RNA 模板模板逆转录酶逆转
15、录酶DNA-RNA杂化双链杂化双链逆转录酶逆转录酶( RNaseH )单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA38基因重组瞬时表达稳定表达整合（integration）：某些情况下，前病毒基因组通过基因重组，插入到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。39真核生物线粒体DNA按D环方式复制 D-环复制（D-loop replication)复制起点不在双链DNA同一位点，内外环复制有时序差别。dNTPDNA-pol 40l有特异的复制起点；有特异的复制起点；l环形线粒体环形线粒体DNA两条链（两条链（H和和L）的复制不同步）的复制不同步D环或取代环（环或取代环（displacement
16、 loop）：线粒体）：线粒体DNA复制开始以复制开始以H链作为模板合成新的链作为模板合成新的L链，取链，取代原来的代原来的L链并和链并和H链互补，而原来的链互补，而原来的L链则保持链则保持单链状态，形成类似英文字母单链状态，形成类似英文字母D的区域；的区域；l两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；l线粒体线粒体DNA复制也需要复制也需要RNA引物引物。线粒体线粒体DNA复制特点：复制特点：41临床意义 线粒体DNA（mtDNA）；37基因（13个mtDNA基因；22个tRNA；2个rRNA） mtDNA易突变，损伤修复较困难，因此mtDNA与衰老
17、、癌症等基因发生密切相关。 小小 结结复制特点：复制特点： (3(3个个) )1.1. 半保留复制半保留复制 2. 2. 双向复制双向复制3. 3. 半不连续复制半不连续复制原核生物与真核生物参与复制的关键酶原核生物与真核生物参与复制的关键酶原核生物原核生物 真核生物真核生物拓扑异构酶拓扑异构酶SSBDnaCDnaB（解螺旋酶）、（解螺旋酶）、DnaA、引物酶引物酶连接酶连接酶DNA pol 、拓扑异构酶拓扑异构酶RFA解螺旋酶解螺旋酶: DNA-Pol 引物酶引物酶: DNA-Pol 连接酶连接酶DNA pol 、 、 、 、 DNA聚合酶活性（作用）（聚合酶活性（作用）（2 2方面）方面）
18、 1 1、聚合活性：、聚合活性： 5 5 3 3 方向，方向，催化四种催化四种dNTPdNTP一个一个地连接到一个一个地连接到DNADNA子子链上去。链上去。 2 2、核酸外切酶活性（两种情况）、核酸外切酶活性（两种情况） 3 3 5 5 外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 5 3 3 外切酶活性，能切除突变的外切酶活性，能切除突变的 DNADNA片段。片段。原核生物与真核生物的原核生物与真核生物的DNA聚合酶聚合酶原核生物原核生物 真核生物真核生物DNA pol 核心酶：聚合、校正核心酶：聚合、校正-复合物复合物DNA夹子夹子DNA-
19、pol 、 DNA-pol DNA-pol ：校读、修复和填补缺口校读、修复和填补缺口复制引发和延伸过程中发生复制引发和延伸过程中发生 DNA聚合酶聚合酶 / 转换转换DNA-pol ：DNA pol ：校读、修复和填补缺口校读、修复和填补缺口参与参与DNA损伤的应急修复损伤的应急修复DNA-pol （）：）：参与应急修复参与应急修复原核生物：原核生物： DNA-pol 真核生物真核生物： DNA-pol和和复制中起主要作用的复制中起主要作用的DNA聚合酶聚合酶DNA生物合成过程生物合成过程起始：解螺旋、形成复制叉、引发体、引物起始：解螺旋、形成复制叉、引发体、引物延长：半不连续复制、冈崎片段
20、延长：半不连续复制、冈崎片段终止：切除引物、填补空缺、连接切口终止：切除引物、填补空缺、连接切口原核生物与真核生物复制起始的比较原核生物与真核生物复制起始的比较原核生物原核生物 真核生物真核生物拓扑异构酶拓扑异构酶SSBDnaCDnaB（解螺旋酶）、（解螺旋酶）、DnaA、引物酶引物酶拓扑异构酶拓扑异构酶 解旋酶（多种）解旋酶（多种）RPA SSB Pol /引物酶引物酶只有一个复制起始点；只有一个复制起始点；打开双链形成复制叉打开双链形成复制叉, , 形成引发形成引发体，合成体，合成RNARNA引物引物多复制起始点多复制起始点, ,且起始片段较短；且起始片段较短；打开双链形成复制叉打开双链形
21、成复制叉, , 形成引发形成引发体，合成引物体，合成引物原核生物与真核生物复制延长的比较原核生物与真核生物复制延长的比较原核生物原核生物 真核生物真核生物DNA pol 核心酶：聚合、校正核心酶：聚合、校正-复合物复合物DNA夹子夹子DNA聚合酶聚合酶 / 复制因子复制因子C（RFC)增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）复制引发和延伸过程中发生复制引发和延伸过程中发生DNA聚合酶聚合酶 / 转换；转换；多复制子复制，引物和冈崎多复制子复制，引物和冈崎片段都比原核生物短。片段都比原核生物短。半不连续复制，一个半不连续复制，一个DNA聚合酶聚合酶能够同时合成前导链和后随链能够同时合成前导链和后随链原核生物与真核生物复制终止的比较原核生物与真核生物复制终止的比较原核生物原核生物 真核生物真核生物切除引物切除引物： RNA酶酶填补空缺填补空缺：DNA-Pol I连接切口连接切口：DNA连接酶连接酶切除引物切除引物：RNA酶、核酸外切酶酶、核酸外切酶填补空缺填补空缺：DNA-Pol / 片段连接片段连接：DNA连接酶连接酶DNA合成后，立即组装成核小体；合成后，立即组装成核小体；端粒酶确保端粒酶确保染色体末端复制完整染色体末端复制完整环状环状DNA，双向复制，在终止点上，双向复制，在终止点上汇合汇合
