1、第四章 植物组织器官培养技术 植物组织培养包括根、茎、叶、叶柄、花器、茎尖、植物组织培养包括根、茎、叶、叶柄、花器、茎尖、幼胚、花药、花粉、果实等的无菌培养。幼胚、花药、花粉、果实等的无菌培养。 1. 1. 植物快速繁殖及脱毒技术植物快速繁殖及脱毒技术 2. 2. 花药及小孢子培养花药及小孢子培养 3. 3. 植物胚胎培养植物胚胎培养 4. 4. 植物的离体受精植物的离体受精 5. 5. 组织培养常见问题及对策组织培养常见问题及对策1.1.植物快速繁殖及脱毒技术植物快速繁殖及脱毒技术n一、基本概念离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖
2、、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。是生产中广泛应用的职务细胞工程技术。n单株无性系或单芽无性系：用上述方法得到的植株群体来自一个单株或单芽，他们的遗传组成相同，称为单株无性系或单芽无性系芽（单芽、丛芽）芽（单芽、丛芽）n植物脱毒（virus elimination）：利用植）：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。的病毒，生产健康的繁殖材料。是生产实践中广泛应用的植
3、物细胞工程是生产实践中广泛应用的植物细胞工程技术。技术。n体细胞胚或胚状体（embryoid)：离体培：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。n其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，区别于体培养范围使用，区别于无融合生殖胚无融合生殖胚；n其二，体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合其二，体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；子胚；n其三，体细胞经过了胚胎发育过程，区别与离其
4、三，体细胞经过了胚胎发育过程，区别与离体培养中器官发生直接形成个体的途径。体培养中器官发生直接形成个体的途径。n繁殖系数繁殖系数（breeding coefficientbreeding coefficient）：）：也叫也叫增殖率增殖率，指每块外植体在一个培养，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数周期内增殖的倍数二二. .研究意义研究意义（1 1）繁殖速度快，经济效益高）繁殖速度快，经济效益高（2 2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗，）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗，（3 3）保持植物种性（保持其优良基因型）保持植物种性（保持其优良基因型）（4 4）繁殖各种珍稀、濒危、
5、名贵、突变物种。）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。三、离体无性繁殖的程序（1）无菌培养物制备（启动培养）（2）培养物的增殖（解决繁殖问题）（3）生根培养（为移栽作准备）（4）炼苗（为移栽作准备）和移栽（5）再生植株的鉴定（确保繁殖的个体没有发生变异/退化）芦荟的植物组织培养过程芦荟的植物组织培养过程1 2 3 4 56 7 8 910 11（1 1）无菌培养物的建立）无菌培养物的建立 无菌培养物的建立程序包括：外植体的选无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择外植体灭菌接种培养等基本过程。择外植体灭菌接种培养等基本过程。（2 2）培养物的增殖培养物的增殖腋芽增殖腋芽增殖；不定芽增殖不定芽增殖
6、；胚状体增殖胚状体增殖; ; 愈伤组织增殖；愈伤组织增殖；原球茎增殖原球茎增殖（比如兰花，类似的还可以用（比如兰花，类似的还可以用“试管试管薯薯”繁殖脱毒的马铃薯苗）繁殖脱毒的马铃薯苗）上述红色的三种方法繁殖比较稳定，不易产生变上述红色的三种方法繁殖比较稳定，不易产生变异。异。腋芽增殖腋芽增殖n特点特点：培养方法简单，：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性能高度保持遗传稳定性，能长，能长期继代繁殖。目前采用这一方式快速繁殖的植物有石期继代繁殖。目前采用这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。这一繁殖竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，
7、如果某些植物需要使方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。 （why?）体细胞无性系变异）体细胞无性系变异腋芽增殖腋芽增殖 特点特点：繁殖系数高，繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株。小植株。遗传稳定性较好。但继代次数有限。遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养培养物继代一定次数以后，
8、不定芽形成能力即减弱，需物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。行生根培养才能形成真正的植株。 诱导不定芽诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。多的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。不定芽增殖不定芽增殖分离分离
9、特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子，artificial seed)，这一途径还没有用于快繁技术。胚状体增殖愈伤组织增殖愈伤组织增殖n所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一伤组织，再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织培养技术的所有过程途径经历了组织培养技术的所有过程( (愈伤组愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株植株) )，它，它属于真正意义上的组织培养属于真正意义上的组织培养。一切
10、。一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。过此途径获得组培苗。n特点：特点：成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差较差。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不。对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁采用这一途径快繁原球茎增殖原球茎增殖 细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分大部分兰花属于这一类型兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。原球茎能诱导形成原球茎，再经培养分化形
11、成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。茎的器官。 与原球茎繁殖相类似的还有马铃薯的与原球茎繁殖相类似的还有马铃薯的“试管薯试管薯”的的生产也是快繁的一种方式，是目前马铃薯脱毒苗繁殖生产也是快繁的一种方式，是目前马铃薯脱毒苗繁殖的主要方式。的主要方式。（3 3）生根培养）生根培养n生根是生根是获得完整植株的关键获得完整植株的关键。通过腋芽、不定芽、。通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。根才能移植。n促使试管苗生根的方法通常有两种。促使试管苗生
12、根的方法通常有两种。n一种是在固体培养基（生根培养基）上诱导生根。当试管苗长到23厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定） 。n另一种是激素浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。生根困难的处理办法n一些难生根的植物用生长素加黑暗处理效果好。糖含量、大量元素浓度减半，或用低盐培养基。另外也可以将无根小苗直接嫁接到根系良好的砧木上。或者培养基中放置滤纸桥，
13、使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。（4）炼苗和移栽）炼苗和移栽试管苗的生长环境无菌 异养 高温 弱光 恒温因此苗弱，要炼苗因此苗弱，要炼苗试管苗的特点（弱点）试管苗的特点（弱点）n1.1.形态解剖方面形态解剖方面（1 1）根：无根毛。根与茎的输导不相连。）根：无根毛。根与茎的输导不相连。（2 2）叶：叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。）叶：叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。无表皮毛，保水和反光能力差。叶细胞结构疏松。无表皮毛，保水和反光能力差。叶细胞结构疏松。叶气孔突出，张大。叶存在排水孔。叶气孔突出，张大。叶存在排水孔。 n2. 2. 生理功能方面生理功能方面
14、根的生理功能低。根的生理功能低。 叶片表面极易散失水分叶片表面极易散失水分 气孔不能关闭叶光和能力较低，气孔不能关闭叶光和能力较低，COCO2 2固定能力差。固定能力差。克服试管苗弱点，提高其移栽成活率的措施nA、移栽要抓三个关键 水分的平衡（不要失水过多） 温度和光照（不能太高） 光和能力逐步形成或加强 B、提高移栽成活率的技术措施 移栽前的工作 移栽时应注意的问题移栽前的工作a、培养瓶生壮苗 加入生长控制剂，如多效唑， B9（丁酰肼）， CCC（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。 b b、炼苗、炼苗 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，
15、使之形成新的功能强逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为的根和叶片。一般炼苗时间为101030d30d。移栽时应注意的问题 na、防止菌类滋生 苗底部培养基要洗干净 杀菌剂处理苗的根部 定时用杀菌剂处理种植基质 常用杀菌剂：KMnO4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1b b、保持小苗水分供给平衡、保持小苗水分供给平衡在移栽后在移栽后5-7d内，应给予较高的空气内，应给予较高的空气湿度条件（湿度条件（90%），使叶面的水分蒸），使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗小苗始终保持挺拔的状态。
16、保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当膜上有水珠出现。当57d后，发现后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促
17、进小苗长得粗制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。壮。 c、移栽时选择合理的种植基质 基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。泥炭 珍珠岩 椰糠蛭石锯木屑d d、注意一定光照，温度条件、注意一定光照，温度条件n试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是温度是18182020 ，冬春季地温较低时，可用电热线来，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并
18、度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。强抗性，促其成活。红薯电热温红薯电热温床育苗圃床育苗圃（5）鉴定）鉴定再生植株的鉴定是指用细胞学或形态学等方法检查再生植株是否有遗
19、传变异。 （二）、应用领域n珍稀植物资源和育种原始材料，如工程植株、果树芽变分离n经济效益高，但难于繁殖的植物，如名贵花卉、n用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。n用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。n繁殖销量大，但用常规的方法难以满足数量上需要的植物，如草皮。四. 植物的脱毒技术基本原理n当前脱除植物病毒的方法有：1、茎尖培养脱毒法；2、热处理脱毒法；3、微体嫁接（主要用于果树）离体培养脱毒法；4、珠心组织培养法；5、愈伤组织脱毒n（一）、茎尖脱毒1、茎尖脱毒的依据。 病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生
20、长点（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。2 2、茎尖培养法脱除植、茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键物病毒的技术关键（1 1）、被脱毒植物携）、被脱毒植物携带病毒的诊断及其带病毒的诊断及其在体内的分布在体内的分布 在脱毒之前，应在脱毒之前，应了解植物携带何种了解植物携带何种病毒，病毒在体内病毒，病毒在体内的分布位置，以确的分布位置，以确定培养茎尖的大小定培养茎尖的大小（2）.母体植株的选择和预处理 母体的选择： 欲脱毒材料的品种典型性：关系到脱毒以后的脱毒苗是否保持原品种的特征特性 植体健康程度选择：应选感病轻、带毒量少的健康植株作为脱毒的外植体材
21、料，这样更容易获得脱毒株。 外植体预处理：外植体预处理：n香石竹在香石竹在38384040条件下经两个月处理可除去全部病毒。条件下经两个月处理可除去全部病毒。n菊花在菊花在35353838的条件下处理的条件下处理6060天可使病毒失活。天可使病毒失活。n马铃薯在马铃薯在3737条件下处理条件下处理10102020天能除去卷叶病毒。天能除去卷叶病毒。n 柑橘速衰病毒柑橘速衰病毒/ /黄化病毒黄化病毒40/3040/30条件下处理条件下处理7 71212周。周。 鳞皮病毒需要在鳞皮病毒需要在40/3040/30条件下处理条件下处理8 8周。周。 啐叶病毒需要在啐叶病毒需要在5050条件下处理条件下
22、处理3 32222小时。小时。 洲青果病毒在洲青果病毒在5050条件下处理条件下处理30304040分钟分钟。 （3）、茎尖的剥离在切取外植体之前茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠或升汞表面消毒10分钟。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（840840倍），一倍），一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶只手用镊子将其按
23、住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%90%酒精，并用火焰灼酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带提高成活率，可带1-21-2枚幼叶，然后将其接到培养基枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可
24、。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。 将接种好的茎尖置于将接种好的茎尖置于2525左右的温度下。每左右的温度下。每天以天以1616小时小时 2000-3000lx2000-3000lx的光照条件下培养。由的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎以较高的温度和充
25、足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。尖需数月才能成功。 继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。（4 4）. . 脱毒效果检测脱毒效果检测A 指示植物鉴定指示植物鉴定(indicator test plants)(indicator test plants) 所谓所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。的寄主植物。每种病毒都有自己敏感的植物每种病毒都有自己敏感的植物，例如：，例如：马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼佗罗毛
26、叶曼佗罗大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠菊花病毒：矮牵牛、豇豆菊花病毒：矮牵牛、豇豆千日红千日红矮牵牛矮牵牛 指示植物鉴定病毒的方法指示植物鉴定病毒的方法a、摩擦接种法： 取培养植株的叶片置于研钵中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），磨成匀奖，将其涂抹在指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫网罩的温室内。然后视其病斑的有无，来判断是否脱除了病毒。例如：植物液接种后如使千日红叶片枯斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植
27、物体内具有马铃薯X病毒b b、嫁接法、嫁接法n有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病毒的鉴定，需特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植株的将培养植株的芽嫁接在敏感植物上，根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒病症来判断是否脱除了病毒B B 血清鉴定血清鉴定(serologic test)(serologic test) 试管沉淀反应；试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫
28、吸附测定免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)(ELISA)。病毒感染人工注射异体蛋白动物动物植物带该种病毒血清反应（抗体） （抗原）免疫球蛋白a a、试管沉淀反应、试管沉淀反应n 在抗原在抗原- -抗体最适比例的条件下，观察有无沉淀的产抗体最适比例的条件下，观察有无沉淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀反应操作简单，需注意的问题：单，需注意的问题：、叶绿体的自发凝聚、叶绿体的自发凝聚 可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去叶绿体，体，pH pH 保持在保持在6.5-8.56.5-8.5） 、
29、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回抑制、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回抑制沉淀的形成沉淀的形成b b、免疫双扩散、免疫双扩散 在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。 步骤：步骤： 倒胶，一般厚倒胶，一般厚2mm2mm 打孔，多打成梅花型打孔，多打成梅花型 加样，加血清和汁液。加样，加血清和汁液。一般加样后在一般加样后在3737恒温过夜，即可进行结果观察。有恒温过夜，即可进行结果观
30、察。有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株c c、酶连免疫吸附测定（、酶连免疫吸附测定（enzyme-linked enzyme-linked immunosorbentimmunosorbent assay,ELISAassay,ELISA） 它是将抗原、抗体的免役反应和酶的高效催化它是将抗原、抗体的免役反应和酶的高效催化反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免后将
31、它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同时测定多个样品。时测定多个样品。C 电镜检查法 采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。人T淋巴细胞电镜照片D DNAD DNA技术检测技术检测 例如例如RT-
32、PCRRT-PCR（Reverse Transcription-Reverse Transcription-Polymerase Chain Polymerase Chain ReationReation）将待测的样品的总）将待测的样品的总RNARNA与与cDNAcDNA合成的试剂盒进行反应，合成合成的试剂盒进行反应，合成cDNAcDNA，然后利，然后利用病毒用病毒DNADNA特有的序列设计引物进行特有的序列设计引物进行PCRPCR反应，即可反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达知道在寄主中是否有病毒基因的表达n脱毒苗的离体保存与繁殖脱毒苗的离体保存与繁殖: :一般是在实验室进行，一一般是
33、在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如如B9B9和矮壮剂可和矮壮剂可2-32-3个月继代一次，也可放到液氮或个月继代一次，也可放到液氮或44冰箱中保存冰箱中保存 n建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染 (5).(5)
34、.脱毒苗的保存与繁殖脱毒苗的保存与繁殖 （6） 影响脱毒效果的因素n母体材料病毒侵染的程度:单一病毒感染的植株脱毒较容易,而复合浸染的植株脱毒较难n外植体的生理状态:顶芽的脱毒效果比侧芽好,生长旺盛的芽比休眠芽或快进入休眠的芽好n起始培养的茎尖大小:不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好,带1-2个可获得40%脱毒苗茎尖长茎尖长(mm)(mm)叶原基叶原基数数小植株小植株数数脱毒植株脱毒植株数数脱毒率脱毒率（）（）0.120.121 15050242448480.270.272 24242181842.942.90.60.64 464640 00 0茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响茎尖大小对马铃薯脱
35、毒效果的影响 (二)热处理脱毒法1、原理病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热处理不能杀死病毒。只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力。热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。存活，
36、并加快分裂和生长。2 2、热处理方法、热处理方法 （1 1）温水浸渍处理）温水浸渍处理 适用于休眠器官、适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在剪下的接穗或种植的材料，在5050左右的温左右的温水中浸渍水中浸渍1010分钟至数小时，方法简便易行，分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。（利用较早，二十世纪二但易使材料受伤。（利用较早，二十世纪二十年代对甘薯一种病毒脱除效果较好。十年代对甘薯一种病毒脱除效果较好。50505252温水浸渍温水浸渍3030分钟）分钟） （2）热空气处理）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽
37、植株移入温热治疗室（箱）内，一般在植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35-40。处理时。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于38下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结合养结合36处理处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒，亦可采用变温法，如马铃薯每天轻型黄斑病毒，亦可采用变温法，如马铃薯每天40处处理理4小时，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而
38、且保持小时，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持了芽眼的活力。了芽眼的活力。热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效；状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效；对杆状和线状病毒的作用不大。因此热处理对杆状和线状病毒的作用不大。因此热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。 （三）（三）微体嫁接微体嫁接离体培养脱毒法离体培养脱毒法
39、 木本植物茎尖培养难以生根形成植株，可以采用木本植物茎尖培养难以生根形成植株，可以采用此法。将极小的茎尖（此法。将极小的茎尖（0.14mm-1.0mm0.14mm-1.0mm）作为接穗嫁接）作为接穗嫁接到种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养到种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。接穗在砧木上易成活，且去除病毒几率大，基上培养。接穗在砧木上易成活，且去除病毒几率大，故有可能获得无病毒苗。故有可能获得无病毒苗。点接法的具体操作：点接法的具体操作：（1 1）砧木苗的培养：采集充实无病的种子，漂洗晾）砧木苗的培养：采集充实无病的种子，漂洗晾干低温处理后进行表面灭菌，在无菌条件下
40、接入固体干低温处理后进行表面灭菌，在无菌条件下接入固体培养基中，每试管培养基中，每试管2-32-3粒种子，粒种子，2727恒温暗培养恒温暗培养10-1410-14天的白化苗，即可作为小砧木天的白化苗，即可作为小砧木（2 2）接穗的准备与嫁接：摘去叶片促使枝条）接穗的准备与嫁接：摘去叶片促使枝条绽发新芽，待芽长到绽发新芽，待芽长到0.5-1cm0.5-1cm时即可做接穗。时即可做接穗。表面灭菌后，在无菌条件下借助解剖镜切取表面灭菌后，在无菌条件下借助解剖镜切取0.1-0.2mm0.1-0.2mm的茎尖作接穗；切去砧木苗的顶端，的茎尖作接穗；切去砧木苗的顶端，以根部和以根部和1cm1cm的上胚轴做
41、砧木，在其顶端用刀的上胚轴做砧木，在其顶端用刀尖切尖切1-2mm1-2mm的切口，将接穗垂直而无损的镶进的切口，将接穗垂直而无损的镶进小切口，然后将其移入适合接穗生长的液体培小切口，然后将其移入适合接穗生长的液体培养基中培养养基中培养 （四）珠心组织培养法柑橘类除合子胚外还有多个珠心胚。珠心组织与维管系统没有直接联系，而病毒一般认为是通过维管组织传播的，因此珠心组织培养可获得无病毒植株 （五）愈伤组织脱毒（五）愈伤组织脱毒植物各种器官和部位组织经诱导可产生愈伤组织，植物各种器官和部位组织经诱导可产生愈伤组织，再分化培养产生芽，最后产生小植株，其中有可能再分化培养产生芽，最后产生小植株，其中有可
42、能得到无病毒小苗。这一脱毒途径已在马铃薯、天竺得到无病毒小苗。这一脱毒途径已在马铃薯、天竺葵、大蒜、草莓等植物上获得了成功。通过愈伤组葵、大蒜、草莓等植物上获得了成功。通过愈伤组织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能：织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能：（1）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。如烟草、康乃馨产生的就是获得无病毒苗的基础。如烟草、康乃馨产生的愈伤带病毒和不带病毒的愈伤组织颜色不同愈伤带病毒和不带病毒的愈伤组
43、织颜色不同（2 2）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰退或丢失退或丢失（3 3）愈伤组织产生抗性变异细胞。）愈伤组织产生抗性变异细胞。2.2.花药及花粉培养花药及花粉培养一一. . 花药培养（花药培养（anther cultureanther culture）二二. . 花粉及小孢子培养花粉及小孢子培养(microspore (microspore culture)culture)一、花药培养一、花药培养1 1概念概念花药培养花药培养(anther culture):(a
44、nther culture):把发育到一定把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上阶段的花药接种在人工培养基上, ,使其发使其发育和分化成为植株育和分化成为植株( (有单倍体植株有单倍体植株) )的过程的过程. .Tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore2 2、花药培养、花药培养的基本程序是：的基本程序是：外植体选择外植体选择外植体外植体( (花蕾花蕾) )预处理预处理外植外植体消毒体消毒剥取剥取花药花药接种接种诱导培养诱导培养分分化培养化培养- -移栽移栽 （1 1）外植体的选择）
45、外植体的选择 基因型的选择（品种的选择）基因型的选择（品种的选择） 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。也是不同的。 因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。养成功的材料来做。 n供试材料的生理状态供试材料的生理状态 在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花
46、药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。足的植株花药培养的诱导频率低。 n花粉的发育时期花粉的发育时期四分体四分体 小孢子小孢子 单核花粉单核花粉 双核花粉双核花粉 最适期最适期涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。小麦已单核中、
47、晚期效果最好。药为好。小麦已单核中、晚期效果最好。在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育时期观察是很不方便的，一般是在试验之前，对花时期观察是很不方便的，一般是在试验之前，对花药的发育时期和其相对直观的生长发育特点进行相药的发育时期和其相对直观的生长发育特点进行相关研究，通过直观的对应性状来确定花粉的发育时关研究，通过直观的对应性状来确定花粉的发育时期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然后根据这些直观特征判断
48、花粉发育时期，取材。例后根据这些直观特征判断花粉发育时期，取材。例如：如： 柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期烟草则在花冠漏出烟草则在花冠漏出1/3-1/2，花冠和花萼等长时为，花冠和花萼等长时为花药培养的最佳时间。花药培养的最佳时间。小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下1厘米之间。厘米之间。花粉发育时期的镜检方法a、醋酸洋红法 将花药放在载玻片上，加一滴1%的醋酸洋红（于100ml煮沸的45%醋酸中缓慢加入1g洋红，回流煮沸8h于5
49、0下过滤即得），用镊子把花药捣碎，加盖玻片后在显微镜下检查。茄科、禾本科的大多数植物的花药均可用此法，但水稻、番茄、芸苔属和许多木本植物的花药细胞核不易着色，可采用桔花青-铬矾法b b、桔花青、桔花青- -铬矾法铬矾法 将花药先在卡诺固定液固定将花药先在卡诺固定液固定20min20min，然后取出放，然后取出放载玻片上，加桔花青载玻片上，加桔花青- -铬矾染色液制片和镜检。细铬矾染色液制片和镜检。细胞核染成黑色。胞核染成黑色。桔花青桔花青- -铬矾染色液的配方：铬矾染色液的配方： 将将5g5g铬明矾（铬明矾（K K2 2SOSO4 4. Cr. Cr2 2（SO4SO4）3 3.24H.24H
50、2 2O O）加）加入入100ml100ml蒸馏水中后加蒸馏水中后加1g1g桔花青混匀，加温至沸腾，桔花青混匀，加温至沸腾，并煮沸并煮沸5min5min，冷却至室温过滤，并加蒸馏水至，冷却至室温过滤，并加蒸馏水至100ml100ml。 (2)(2)花药预处理花药预处理为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验材料进行各种预处理，已经证明有效的预处理方法材料进行各种预处理，已经证明有效的预处理方法有：有：A A 低温预处理低温预处理低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率。但各低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率。但各种植物要求的温度和处理时间有差异
