1、1天然药物活性成天然药物活性成分研究分研究 2活性成分：活性成分：是指植物、动物、微生物以及矿物等各种天然药物体内存在的对人体生理活性有影响的物质。如：植物中的黄酮、皂苷、生物碱等，动物体内的多肽、激素等。3第一节第一节 天然药物的研究开发程序天然药物的研究开发程序开发新药包括开发新药包括5 5种形式：种形式：1.1.经过文献资料或民间用药的调研并通过现代经过文献资料或民间用药的调研并通过现代药理学的筛选研究，发现某种天然药物具有药理学的筛选研究，发现某种天然药物具有药用价值，然后将其开发成新药。药用价值，然后将其开发成新药。42.已知某种成分或某类成分具有药用价值或已成为新药，根据动植物的亲
2、缘关系，寻找含有这种或这类成分的动植物，将其开发成新药。53.在不明确有效成分的基础上，将临床疗效明确的经典方、经验方或经药效学研究具有开发价值的复方中药开发成新药，或将现有的新药改变剂型。64.在基本搞清了有效成分和有效部位的基础上，将有效部位开发成新药，采用这种方法开发的新药具有药品的均一性较易控制、临床疗效稳定、质量得到保证等优点。75.通过天然药物中的有效成分或生物活性成分的研究，从中发现有药用价值的活性单体或潜在药用价值的活性单体，这些单体往往具有一定的生物活性，但因其活性不够显著或毒副作用大，无法将其开发成新药，但他们具有潜在的药用价值，称为先导化合物。通过先导化合物的研究进而发现
3、有药用价值的化合物。8第二节 天然药物中活性成分的研究方法一、调查研究1.临床调查2.药材调查3.文献查阅9中药创新药物的发现与研发中药创新药物的发现与研发 中药作为我国的传统医药，不仅为我国人民的健康事业做出了巨大贡献，而且也是我国医药产业的三大支柱之一，在经济发展中发挥了重要的作用。自从我国加入WTO以后，长期依赖于仿制的化学药物的发展受到了很大的冲击，而具有我国自主知识产权的中药迎来了新的发展机遇，特别是近年来西方国家包括美国、加拿大、欧盟、澳大利亚等对传统药物和植物药的普遍重视和注册政策的调整，给中药进入国际市场提供了一个良好的契机。 10 因此，中药将成为我国医药产业新的增长点，中药
4、新药研发也将成为我国创新药物研发的重要方向。自1985年实施药品管理法以来，中药新药的研发一直是新药研发中最活跃的领域，至今已有近3 000个中药新药获准上市。在这些品种中，以中药复方为主，占近60；改变剂型约占35；有效成分、有效部位新药不到5。分析目前中药新药研发的现状，主要存在着以下问题：11(1)低水平和高水平重复现象严重，缺少具有独立知识产权的高水平中药新药：目前我国药品法定标准包括中华人民共和国药典、中华人民共和国卫生部药品标准、国家食品药品监督管理局对地方标准和保健药品整顿后发布的国家中成药标准汇编以及国家药品标准等收载的中成药品种达一万多种，几乎覆盖了各种疾病用药。而目前申报的
5、中药复方新药即中药、天然药物注册分类的第六类新药，几乎都在原来处方的基础上进行加减，其疗效、制剂和质量控制水平都没有明显的提高，被业内人士称为低水平重复。 12v所谓高水平重复，即新药的研发水平很高，如有效成分新药或有效部位新药，但每个新药的申报单位有很多家，如丹参总酚酸及其制剂、红花总黄色素及其制剂、羟基红花黄色素A及其制剂等，每个新药都有多家申报，有些甚至有十多家申报；人参中主要有效成为皂苷类，人参皂苷Rg3是第一个开发成为一类新药的皂苷，其他单位开发了Rh、Re 等皂苷，目前还有一些其他皂苷正在开发中。 13 诸如此类例子很多，造成这种现象的主要原因是缺乏创新，研究单位都从文献上找新药的
6、选题，发现文献报道某个中药的成分能够纯化到有效部位或有效成分，而且有一定的药效，很多机构都同时立项进行研发，造成大量资源的浪费，结果都没有知识产权保护，这是目前严重缺乏真正创新的、具有独立知识产权的高水平中药新药的重要原因。(2)疗效差、剂型落后、质量难以有效控制：目前申报的大部分新药，由于没有经过筛选过程，其疗效很差，或者与上市的中成药没有明显的差别。大部分新药研发单位不重视药物的疗效，只重视新药证书和生产文号，所以进入新药研发的品种，不管疗效如何，最终都取得新药证书和生产文号。 14v这固然与我国目前药品销售不重视疗效，只重视手段有关，但低水平重复也是造成这种现象的重要原因。目前中药的制剂
7、水平从剂型到制剂研发水平均非常落后，既使是一些先进的剂型，其研发水平也很落后。目前中药制剂学的研究基本上只停留在能够做成某种剂型的水平，很少研究其溶出度、体内的药代动力学。但近年来的研究表明，大部分中药的成分特别是传统认为生物利用度较好的水溶性成分，如大部分苷类成分，其生物利用度非常低，既使在复方中也一样。因此，进行中药新药的制剂学研究包括主要成分溶出度、药代动力学研究，对于提高中成药的疗效非常重要。目前中药新药的申报，对其质量标准基本上要求有1味药物成分的含量测定和13药味的定性鉴别，所以新药研发基本上都是按照这个原则进行，这对于中药复方制剂特别是处方较大的复方制剂是远远不够的，其他没有定性
8、鉴别的药味，可加可不v加，造成市场上出现劣质药品的局面。因此，目前大部分中药复方制剂的质量标准难以有效地控制药品的质量。15(3)仿制药充斥市场：专利到期后药品的仿制是世界各国都允许的，是降低药品价格的主要途径，我国放开药品仿制，本身无可非议，但在管理和实施上存在着很大的问题，促使药品生产企业不重视创新，只重视眼前利益，导致仿制药品充斥市场，严重影响了创新药物的发展。16(4)大部分新药品种未产业化，少数产业化，极少数形成“重磅炸弹”：我国1985年以来上市的近3 000个中药新药大部分未产业化，仅少数产业化，极少数形成产值过亿的所谓中国的“重磅炸弹”，如丹参滴丸、地奥心血康、步长脑心通、通心
9、络胶囊等。主要原因为：其一，研发的新药品种大部分为低水平重复，没有特色，缺乏市场竞争力；17 其二，企业研发或转让新药缺乏市场调研，很多新药取得文号后，就搁置在档案室里。药品作为预防、治疗和诊断疾病的物质基础，直接关系到人民的身体健康，追求更好、追求完美是药品发展的必然趋势。国际大型制药集团每年投入巨额资金进行新药研发，每个新药的上市都给企业带来巨额的利润，药品知识产权是各国知识产权谈判的重要内容之一，这些都说明创新药物对医药产业发展的重要性。因此，创新药物的研发今后也必将成为我国药品研发的主要方向。18v12 中药创新药物的定义v创新药物在国际上一般是指新的化学实体或者生物制品中新的物质。中
10、药是我国的特色，对于中药创新药物的定义至今没有定论，但国家科技部、发改委在创新药物项目评审中基本上有一个概念，主要是指有效成分新药和有效部位新药，SFDA药品审评中心在新药审评中也有一个创新药物概念，也是指一类新药和五类新药。因此，我们认为中药创新药物是指首次上市的从中药和天然药物中提取的有效物质，包括有效成分和有效部位及其组成的复方制剂。按照现行药品注册管理办法，即首次在我国上市的中药、天然药物中提取的有效成分及其制剂(一类新药)、首次在我国上市的中药、天然药物中提取的有效部位及其制剂(五类新药)。19v2 中药创新药物的发现v“安全、有效、稳定、可控”是药品的四大要素。药品的研发首先必须针
11、对某种疾病，从大量的化学物质、中药、天然药物中筛选出具备上述四大要素的物质，才能进人新药研发。中药尽管有两千多年的临床使用历史，但临床上基本都是以复方配伍使用，各种中药的疗效包括复方的疗效如何，没有确切的数据，作为药品进行开发，仍需要进行大量的筛选。因此，新药的发现是中药创新药物研发的必需过程。而我国目前中药新药的研发极少经过发现过程，这也是我国缺少疗效独特的中药创新药物的重要原因。20v21 新药发现的过程v根据国内外新药发现过程结合我国中药新药研发的特点，总结新药发现过程见图1。其发现过程详细介绍如下：v211 样品的选择与制备新药的发现从样品的收集开始。为了提高目标的命中率，可根据文献古
12、籍调研，从民族、民间药物、临床名方、老药和国外天然药物中选择筛选样品，收集样品，进行基原鉴定，也可选择天然产物进行大规模筛选。样品收集后进行提取，或采用溶剂粗分成几个部位，得到粗提物。21212 活性筛选根据拟开发药物的适应症，采用体外或体内的方法对提取物进行活性筛选，如果提取物有明显的活性，即进入下一程序；如果提取物没有明显的活性，先贮存在样品库中，供其他活性筛选。213 活性跟踪的化合物分离、结构鉴定以及有效部位、有效成分、活性先导化合物的发现采用溶剂方法或色谱方法对粗提物进行进一步分离，最好能够按化合物类型进行分离，有利于有效部位新药的发现； 22 对分离后的各个部分进行进一步的活性筛选
13、，发现活性部位；采用色谱方法对活性部位进行化合物的分离和结构鉴定；对分离的化合物进行活性筛选。在此筛选过程中，有时会发现某一部位活性很强，但进一步分离成单体化合物后活性没有提高，甚至降低的现象，这可能是由于中药的各成分之间存在着协同作用导致的。这时可以把相应的活性部位研发成为新药，即有效部位新药。如果发现某一单体化合物活性很强，具有临床应用前景，就可以把单体化合物研发成为新药，即有效成分新药。但在活性成分研究中，大部分情况是分离的化合物具有一定活性，但活性不太强，或毒性很大，没有临床使用价值，这类化合物被称为活性先导化合物，可进人结构改造程序。对于没有活性的化合物，将其贮存在样品库中，供其他活
14、性筛选。23v214 先导化合物的结构改造、构效关系研究与新化学药物的发现 如前所述，天然产物中发现的大部分化合物没有直接临床应用价值，但为创新药物发现中先导化合物的主要来源。对于活性筛选发现的活性先导化合物，必须进行结构改造和构效关系研究。通过系统的构效关系分析，进一步设计并优化活性化合物，再通过活性筛选，直至发现具有临床应用价值的化合物，从而进人新药研发阶段，最后成为化学药的一类新药。 24 目前国际上多数创新药物都是通过这一途径发现的，从国际上申请的专利也可以看出，一般一个活性化合物，其合成的衍生物都在数十个，甚至上百个。而在我国，天然产物研究与合成是基本脱节的，从事天然产物研究的人员大
15、多不懂合成，从事合成的人员对结构改造也不感兴趣，这也是我国极少发现新的化学实体药物的主要原因之一。另外，近年来的大量研究表明，中药或天然药物的成分在体内极易产生代谢，从其代谢产物中发现活性成分，也是创新药物发现的一个重要途径。2522 中药创新药物发现的新方法、新技术中药创新药物发现的新方法、新技术包括“基于细胞、靶酶、亲和色谱、分子烙印技术、生物芯片等的高通量筛选技术”、“多维液相色谱一高通量筛选一LCMSNMR联用技术”、“LCMSDSHLPCHTS联合技术”等。26v23 中药创新药物发现的新领域、新途径大部分传统中药是我们的祖先在寻找食物的过程中发现的，因此有“医食同源”或“药食同源”
16、之说。从中国药典收载的常用中药可以看出，大部分中药为草本植物，少数为灌木，极少数为乔木。近百年的中药活性成分研究，从这些草本植物中发现了不少具有临床应用价值的化合物，如麻黄碱、小檗碱、青蒿素等，为现代药物的发展做出了巨大贡献。但大量研究表明，这些草本植物所含化学成分结构简单，基本上都属于天然药物化学或中药化学等教科书上介绍的结构类型，发现新的结构类型、新的活性化合物的难度越来越大。寻找发现创新药物的新领域、新途径是天然药物学家们面临的新课题。根据近二十年来中药、天然药物的研究进展，以下方面将是今后创新药物发现的新途径和新领域。27231乔木类植物 高大乔木在传统中药中很少使用，较常用的仅黄柏、
17、杜仲、厚朴、肉桂等lO多种中药，因此其活性成分研究以前开展得很少。近二十年的研究表明，高大乔木中除了含有一些常见结构类型的植物化学成分外，尚含有一些结构类型较新颖、生理活性较强的成分，发现活性成分的机率较高，如紫杉醇、三尖杉酯碱、喜树碱、番荔枝内酯等都来源于高大的乔木。我国有着丰富的乔木资源，特别是热带、亚热带地区的乔木种类非常丰富，这些乔木大部分未进行过活性成分的研究，为新药发现提供了一个很大的空间。28232海洋生物 海洋面积约占地球表面积的7l，海洋生物资源非常丰富，但由于受样品采集、提取、分离和结构鉴定等技术的限制，对海洋生物进行有组织的研究和开发开展得较晚。六十年代以来，随着科学技术
18、的发展，新的分离技术和分析仪器的采用，使海洋生物的研究成为可能。近二十年来的研究表明，海洋生物中所含化学成分结构新颖、复杂，常具有很强的生物活性，具有很好的新药开发前景。29233 低等生物和植物共生菌低等生物同样存在着样品采集和分类鉴定的困难，因此对其活性成分研究也很少。但大部分低等生物具有很强的生物活性，特别是一些真菌类，很小的剂量就能够产生很强的生理作用。对低等生物进行研究，发现活性成分的机率很高。同时，低等生物还具有易于通过发酵生产的优势，产业化前景看好。因此，低等生物的活性成分研究也是新药发现的一个新领域。当务之急是要加强分类学家与药物学家的配合，解决样品的收集与分类鉴定问题。植物共
19、生菌的研究是近十年来才开始的新研究领域，尽管时间很短，但已发现了大量新化合物骨架和新的活性化合物。植物共生菌种类很多，而且易于发酵和调控，也是创新药物发现的一个重要领域。30234 鲜活动物的内源性物质动物药作为中药使用有着悠久的历史，神农本草经收载动物药67种。对动物药进行系统的活性成分研究开展较晚。近二十年的研究表明，动物药特别是鲜活动物含有大量的活性物质，其活性成分具有生理活性强、疗效确切、副作用小等特点，如蛇毒、蚯蚓纤溶酶、水蛭素、斑蝥素、蜂毒等都是活性很强的天然产物。我国有动物药2 000多种，目前已进行过较系统研究的不到1 ，因此对动物药，特别是鲜活动物进行系统的活性成分研究，有望
20、开发出疗效显著、作用专一、副作用小的新药。 31235 中药复方 中药复方是中医临床用药的主要形式。由于分离技术的限制，中药复方的活性成分研究以前开展较少。近年来，随着分离技术的快速发展，各种高性能色谱填料和高效色谱分离技术已逐渐在我国普及，使中药复方的活性成分研究成为可能。近年来的研究表明，中药复方的化学成分确实有别于单味中药，这并非完全是中药复方共煎产生新的成分，而是通过成分之间的增溶作用，使一些在单味中药研究中没有发现的成分在复方研究中被发现，如我们在补阳还五汤的化学成分研究中发现4个新的生物碱_2 J，为创新药物的发现提供新的结构化合物。另外，中药复方的活性成分研究是发现具有临床使用价
21、值的中药成分的组合或有效部位组合的最有效途径。32v236中药成分的体内代谢产物从代谢产物中发现新药一直是国际上非常重视的领域，特别是近十年来随着新药研发成本的快速增长，国际上一些较小的制药企业和新药研发公司难以承受新药发现的巨大成本，纷纷将研究重点转向代谢产物的研究，一旦大公司发现新药，小公司马上研究其代谢产物，这样可以大大提高新药发现的几率，降低研发成本。中药和天然药物中的成分，由于其具有比化学药更好的生物顺应性，在体内更易发生代谢，其代谢产物往往是其真正的活性成分，如黄芩苷、番泻苷等。因此，对体内代谢产物进行生物活性研究，从代谢产物中发现新药也是一个很好的途径。33v3 中药创新药物的研
22、发v31 中药创新药物选题的原则v311 突出中医药特点、优势原则 “辩证施治，调节阴阳”是中医药理论的精髓。中医治病多从整体观念人手，以调节整体功能为主，如扶正祛邪、调整阴阳、调整脏腑功能及调理气血等，都是中医重要的治疗法则。长期的临床使用表明，中医药在生理功能的调节、病毒性感染、免疫性疾病、各种慢性病、养生保健、抗衰老等方面具有明显的优势。因此，在中药创新药物研发的选题时必须充分考虑中医药治疗的优势病种，发挥中医药的特色与优势，切忌选择目前化学药治疗效果很好的疾病。 34v312 医疗需要(社会效益)原则 医疗需要即社会效益。作为药物，其主要功能是预防、治疗、诊断人的疾病，为人民的健康事业
23、提供保障。因此，新药的选题必须针对当前社会的人口谱、健康谱和疾病谱，研制治疗常见病、多发病和疑难病的药物。具体来说，当今社会急需治疗下列几类疾病的药物：常见病：感冒、肝炎、消化道疾病、呼吸系统疾病等；现代社会流行病：心脑血管疾病、癌症、肺病、糖尿病等； 老年病：老年痴呆症、老年糖尿病、骨质疏松、各种器质性疾病、白内障等；疑难病：艾滋病、各种免疫性疾病等。 35313 市场需求(经济效益)原则市场需求即经济效益。药品作为一种商品，除了疗效外，必须还有市场效益，否则，该新药获得证书后只能存在档案室。因此，在新药选题时必须进行充分的市场调研，分析所选病种的发病率、当前上市药物的品种、临床用药状况、各
24、个品种的特点和目前市场占有率，根据拟选新药的优势和特点，预测新药上市后可能的市场占有率和市场前景。对于这一点，国内的企业和科研单位做得不够充分，较少有新药研究单位在立项时能够拿出一套详细的市场调研报告，这也是为什么报批的新药大部分不能很好地开发市场的重要原因。36314 立足创新原则 作为创新药物必须立足于“新”字，中药创新药物的创新可以从三方面实现：新物质，包括新化合物和新有效部位；新药用，一个已知化合物或已知提取物，发现其药用价值，将其开发成为新药，也是非常有价值的，如砒霜，发现其可以治疗白血病，曾引起国际上的轰动；名优中成药的二次开发，对名优中成药进行深入研究，阐明其有效部位，将其研制成
25、为新的有效部位复方制剂，从而降低服用剂量、提高疗效、建立有效的质量标准，对中成药来说，也是很好的创新。37v315 可行性原则 在创新药物研发时必须注意生产工艺和质量标准的可行性。因为，其一，生产工艺和质量标准将伴随着药品的终生，一个无法工业化或高成本的生产工艺将使新药无法投产，一个难以重现的质量标准将无法控制药品的质量；其二，有效成分新药要求有效成分的含量达到提取物的90以上，有效部位的新药要求有效部位含量达到提取物的50以上，在选择药材时就必须考虑是否能够纯化到相应的含量，是否能够测出这些成分的含量。根据我们的经验，创新药物的研发必须考虑以下二点：38(1)生产工艺可行性：研制有效成分的新
26、药，应选择有效成分含量高、主成分明显、易于分离的植物，如果该成分是针对某种重大疾病的特效药物，则另当别论；研制有效部位的新药，应选择有效部位集中，化学成分类别较少的植物；研制复方有效部位的新药，应选择药味较少，方中各味药的有效部位较明确的中药复方。 39(2)质量标准可行性：质量标准可行性主要是在有效部位新药研发中存在的问题，因为有效部位新药要求对各类成分进行含量测定，且所测各类成分的含量之和必须大于50。因此，在有效部位新药研发时首先必须考虑各类成分是否能够测定、相互之间是否存在干扰。在定量方法建立时可考虑采用以下措施：a选择适当的方法，将各类成分进行分离，分别测定；b选择各类成分专属的紫外
27、一可见吸收波长分别进行测定；e采用各类成分专属性强、且稳定的显色方法，排除成分之间的干扰。40v32 各类中药创新药物的研究思路v321 有效成分新药 有效成分新药实际上与化学药没有本质性的区别，研发有效成分的新药应该与上市的适应症相同或相似的化学药进行比较，分析拟开发新药在疗效、安全性、生产成本等方面的优势或特色，如果没有优势或特色，则该新药的开发意义就不大。由于中药中的成分多数情况下存在着协同作用，单体化合物的活性往往不是很强，难以与化学药相比，从近几年申报的中药一一类新药也可以看出这一点，所以开发有效成分新药必须慎重。41v322有效部位新药 中药有效部位是经过筛选确定的某一中药或复方中
28、的各类有效成分的组合，仍然是个混合物，只不过把无效成分去除，使疗效更强、作用更专一，所以有效部位新药仍然具有中药多成分、多靶点的作用特点，符合中医药理论。同时，经过精制，除去无效成分，提高疗效，降低服用剂量，达到化学成分清楚、质量易控的目的，符合中药现代化的发展趋势。因此，有效部位新药将是中药创新药物研发的主要方向，特别是根据中医药配伍理论结合现代药效学筛选组成的中药有效部位复方制剂，能够更好地发挥中医药的特色与优势，将是今后有效部位新药研发的主要方向。在开发有效部位的新药中，单味药的有效部位是研发的基础。如果一个单位要进行系列有效部位新药的研发，应该先进行一些常用中药的有效部位研究，申请专利
29、。如果单味药的有效部位能够开发成为新药，先进行单味药的开发，在此基础上，再进行有效部位复方制剂的开发，达到多快好省的目的。否则，常用中药的有效部位的工艺和用途都被专利保护后，即使有很好的处方或思路，也无法进行研发。42v323中成药二次开发如前所述，名优中成药的二次开发是中药创新药物研发的重要组成部分。名优中成药的二次开发不是简单的改变剂型或改变工艺，名优中成药的二次开发应该在“精、新、效、优”四个字上做文章。“精”，是指精制，提高有效成分的含量，降低服用剂量，尽可能地将其研制成为有效部位的新药，达到质的飞跃，如果可测性成分含量难以达到50以上，也尽量往高含量研究。“新”，是指剂型新，根据疾病
30、治疗的需要，从制剂学上做文章，提高中药的制剂水平。“效”，是指疗效，通过二次开发应提高药物的疗效，起码与原制剂达到等效，如果二次开发，其他工作做得很好，但疗效却降低了，这样的开发也是不成功的开发。“优”，是指质量优，主要表现在： 质量标准有了很大的提高，所建立的质量标准能够有效地控制产品的质量；药品稳定性和批次间的一致性均有了很大的提高。如果能够实现这几点，二次开发就是一个很成功的开发。43二、天然药物化学成分预实验二、天然药物化学成分预实验（一）预试验的目的和要求 中药化学成分预试验是指通过简单的提取分离和定性反应，初步检验某中药中可能含有哪些化学成分，然后按照所含化学成分的性质，设计有效成
31、分提取、分离的具体方法。对预试验的要求是简便、快捷而正确。一般采用试管实验，由于植物提取液大多颜色较深，颜色变化在试管内观察易产生干扰，可另采用纸片法，把试样和试剂点在滤纸上，观察其化学反应后的颜色变化。如果还难以肯定，可进一步采用纸色谱及薄层色谱方法，把各类成分初步分开后喷洒各类显色剂，再加以判断，灵敏度也可提高。薄层色谱比纸色谱展开时间短，操作方便，更适用于预试验工作。44 预试验往往只能提供初步线索，其准确性受多种因素影响，主要表现在：共存成分相互干扰；提取分离方案不很完善；提取液中杂质多，颜色深，影响定性反应的观察；定性检出试剂不够专一；成分含量低，与检出试剂反应不灵敏；成分在植物体中
32、的存在状态等。为提高预试验检出的准确性，可从以下几方面考虑：45v1预试验前对药材的性状特征进行认真观察，以引起提取检识时的注意。如黄色药材可能含有黄酮、蒽醌等；红色药材可能含有蒽醌或其他醌类、酮类化合物；具苦味的可能含生物碱、强心苷；具酸味的可能含有机酸；具甜味的常含糖类成分；具涩味的可能含鞣质等。v2制备供试液时，应尽量除去杂质，以减少成分间的相互干扰。如检查生物碱时，可利用生物碱溶于酸水而与香豆素、中性内酯分离，再用生物碱沉淀试剂检出生物碱。 46v3在化学反应检识时，尽量采用专属性强的检出试剂，并选用几种不同试剂同时检查，根据反应结果综合分析。如强心苷首选-去氧糖反应，再配合liebe
33、rmann-burchard和Beljet反应等。在检识方法上，可配合TLC或PC检识，往往可提高检出的准确度。v4反应颜色判断不准确时，可同时作对照试验和空白试验。v5成分含量太低时，可配合生物测定方法。 预试验结果只能提供药材中可能含有哪些类型的化学成分，要完全肯定某类化学成分，则需提取分离得到后再进一步检识。47v（二）预试验的方法（二）预试验的方法 天然药物化学成分预试验的方法可以分为两类。一类是单项预试验，即根据工作的需要有重点的检查某一类成分。另一类是系统预试验，即用简便、快速的方法，对中药中存在的各类化学成分进行全面定性检查。48（三）预试验溶液的制备（三）预试验溶液的制备v1
34、1单项预试验溶液的制备单项预试验溶液的制备 通常将中药材分别用石油醚、95乙醇和水提取，便可以将绝大部分化学成分提取出来。v（1）水提取液：取药材粉末10g，加100ml蒸馏水，室温浸泡24小时，滤过，取少量滤液检查蛋白质、氨基酸，剩余滤液和滤渣水浴加热（5560）1小时，滤过，滤液检查糖、皂苷、有机酸、鞣质、生物碱盐。 49（2） 乙醇提取液50（3）石油醚提取液：取药材粉末1g，加10ml石油醚（沸程：6090），浸渍24小时，滤过，滤液进行萜类、挥发油、甾体、油脂等亲脂性成分检查。512 2系统预试验供试液制备系统预试验供试液制备 利用各类成分极性大小的不同，用极性由小到大的溶剂连续抽提
35、，将各类成分分开。常用的溶剂梯度顺序为：石油醚、苯、乙醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、水。每级提取液，可进一步结合化合物的酸碱性不同，采用酸、碱液处理，使其分为酸性、碱性和中性部分。52（四）供试液中化学成分的检识（四）供试液中化学成分的检识 各类化学的检识反应一般在试管、滤纸片或薄层板上进行。检识时应尽量采用对寻查成分专属性强的反应，如蒽醌首选碱液反应；强心苷首选Keller-Kiliani反应；皂苷首选泡沫试验等。另外还可结合仪器分析的方法，如利用甾体皂苷的特征红外光谱，可迅速准确的辨认甾体皂苷。53v1水溶性成分的检识 取中药粗粉5g，加50ml蒸馏水，浸泡过夜，或于5060水浴
36、中温浸1小时，滤过，滤液供检识下列各类成分：54（1）糖、多糖和苷类v1）Molish反应：取1ml供试液于试管中，加入12滴10-萘酚乙醇试剂摇匀，倾斜试管45，沿管壁滴加1ml浓硫酸，分成两层。如在两液层交界面出现紫红色环，表明可能含有糖、多糖或苷类。v2）斐林反应：取1ml供试液于试管中，加入新配制的45滴斐林试剂，在沸水浴中加热数分钟，如产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明含有还原糖。 将上述溶液中沉淀滤过除去，滤液加1ml 10盐酸溶液，置沸水浴中加热水解数分钟，放冷后，滴加10氢氧化钠溶液调pH至中性，重复上述斐林反应，如仍产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有多糖或苷类。55（2）氨基酸、
37、多肽和蛋白质类v1）茚三酮反应：取供试液点于滤纸片上，喷雾茚三酮试剂后，吹热风数分钟，如呈紫红色或蓝色，表明可能含氨基酸、多肽或蛋白质。v2）双缩脲反应：取1ml供试液于试管中，加1滴10氢氧化钠试剂，摇匀，再加0.5硫酸铜溶液，边加边摇匀，如溶液呈现紫色、红紫色或蓝紫色，表明可能含有多肽或蛋白质。v3）酸性蒽醌紫反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒酸性蒽醌紫试剂，如呈现紫色，表明可能含有蛋白质。56（3）酚类、鞣质类化合物v1）三氯化铁反应：取1ml供试液于试管中，加醋酸酸化后，加数滴1三氯化铁试剂，溶液如呈显绿、蓝绿、蓝黑或紫色，表明可能含有酚性成分或鞣质。v2）三氯化铁-铁氰化钾反应：取供试
38、液点于滤纸片上，干燥后，喷洒三氯化铁-铁氰化钾试剂，如立即呈现蓝色，表明可能含有鞣质。喷试剂后应立即观察，若放置一段时间，背景也能逐渐呈蓝色。如欲使纸上的斑点保存下来，在纸片仍湿润时，用稀盐酸洗涤，再用水洗至中性，置室温干燥即可。57v3）香草醛-盐酸反应：取供试液点于滤纸片上，干燥后，喷洒香草醛-盐酸试剂，如立即呈不同程度的红色，表明含有间苯二酚和间苯三酚结构的化合物。v4）明胶-氯化钠反应：取1ml供试液于试管中，加入12滴明胶-氯化钠试剂，如产生白色混浊或沉淀，表明可能含有鞣质。v5）咖啡碱反应：取1ml供试液于试管中，加入数滴0.1咖啡碱溶液，如产生棕色沉淀，表明可能含有鞣质。58（4
39、）有机酸类v1）pH试纸反应：取供试液，以广泛pH试纸测试，如呈酸性，表明可能含有有机酸或酚类成分。v2）溴酚蓝反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒0.1溴酚蓝试剂的70乙醇溶液，如在蓝色背景上产生黄色斑点，表明可能含有有机酸。如显色不明显，可再喷雾氨水，然后暴露于盐酸蒸气中，背景逐渐由蓝色变成黄色，而有机酸的斑点仍为蓝色。59（5）皂苷类v1）泡沫反应：取2ml供试液于试管中，剧烈振摇2分钟，如产生大量持久性泡沫，再把溶液加热至沸或加入乙醇，再振摇，如仍能产生多量持久性泡沫，表明可能含有皂苷。v2）溶血反应：取供试液点于滤纸片上，干燥后，加1滴2红细胞试液，数分钟后，如在红色背景中出现白色或淡黄
40、色斑点，表明可能含有皂苷。本实验也可在试管中进行。602.醇溶性成分的检识 取10g中药粗粉，加100ml乙醇，沸水浴中回流提取1小时，滤过。滤液回收乙醇至无醇味，取1/2量浓缩液，加10ml乙醇溶解，供甲项检识。剩余的浓缩液加10ml 5盐酸，充分搅拌，滤过，滤液部分供乙项检识。酸水不溶部分，加10ml醋酸乙酯溶解，醋酸乙酯液用5氢氧化钠溶液振摇洗涤2次（每次23ml），弃去碱水层。醋酸乙酯层再用蒸馏水洗12次，至水洗液呈中性，弃去水洗液，置于水浴上蒸发除去醋酸乙酯，残留物用15ml乙醇溶解，供丙项检识。61甲项检识（1）鞣质类：同水溶性成分检识（2）有机酸类：同水溶性成分检识（3）黄酮类v
41、1）盐酸-镁粉反应：取1ml供试液于试管中，加镁粉适量，摇匀，加25滴浓盐酸，即产生剧烈反应，如溶液呈红色或紫红色，表明可能含有黄酮类。v2）三氯化铝反应：取供试液点于滤纸上，晾干，喷雾三氯化铝试剂，干燥后，斑点呈鲜黄色，如在紫外灯下观察，斑点有明显的黄绿色荧光，表明可能含有黄酮类。v3）氨熏反应：取供试液滴于滤纸片上或硅胶色谱板上，置氨气中熏片刻，斑点呈亮黄色，在紫外灯下观察，斑点呈黄色荧光，表明可能含有黄酮类。62（4）蒽醌类化合物v1）碱液反应：取1ml供试液于试管中，加10苛性碱试剂呈红色，如加酸使成酸性，则红色褪去，表明可能含有蒽醌类。v2）醋酸镁反应：取1ml供试液于试管中，加数滴
42、1醋酸镁甲醇溶液，如溶液呈橙红色、紫色等颜色，表明可能含有蒽醌类。63（5）甾体和三萜类v1）醋酐-浓硫酸反应：取1ml供试液，置蒸发皿中水浴蒸干，加1ml冰醋酸使残渣溶解，再加1ml醋酐，最后加1滴浓硫酸，如溶液颜色由黄红紫蓝墨绿，表明可能含有甾体类成分。如溶液最终呈现红或紫色，表明含有三萜类成分。v2）三氯醋酸反应：取供试液滴于滤纸片上，滴三氯醋酸试剂，加热至60，产生红色，渐变为紫色，表明含甾体类成分。加热至100才显红色、红紫色，表明含有三萜类成分。v3）氯仿-浓硫酸反应：取1ml供试液，置于蒸发皿中水浴蒸干，加1ml氯仿使残渣溶解，将氯仿液转入试管中，加1ml浓硫酸使其分层，如氯仿层
43、显红色或青色，硫酸层有绿色荧光，表明可能含有甾体或三萜。64乙项检识（1）生物碱类v1）碘化铋钾反应：取1ml供试液于试管中，加12滴碘化铋钾试剂，如立即有棕黄色至棕红色沉淀产生，表明可能含有生物碱。v2）碘化汞钾反应：取1ml供试液于试管中，加23滴碘化汞钾试剂，如产生白色或类白色沉淀，表明可能含有生物碱。v3）碘-碘化钾反应：取1ml供试液于试管中，加23滴碘-碘化钾试剂，如产生褐色或暗褐色沉淀，表明可能含有生物碱。v4）硅钨酸反应：取1ml供试液于试管中，加12滴硅钨酸试剂，如产生黄色沉淀或结晶，表明可能含有生物碱。65丙项检识（1）强心苷类v1）碱性苦味酸反应：取1ml供试液于试管中，
44、加数滴碱性苦味酸试剂，如溶液即刻或15分钟内显红色或橙红色，表明可能含有强心苷类。v2）间二硝基苯反应：取1ml供试液于试管中，加数滴间二硝基苯试剂，摇匀后再加数滴20氢氧化钠，如产生紫红色，表明可能含有强心苷类。66v3）冰醋酸-三氯化铁反应：取1ml供试液于蒸发皿中，水浴上蒸干，残留物加0.5ml冰醋酸-三氯化铁试剂溶解后，置于试管内，沿管壁加入1ml浓硫酸，使分成二层，如上层为蓝绿色，界面处为紫色或红色环，表明可能含有2，6-二去氧糖的强心苷类。v4） 呫吨氢醇反应：取1ml供试液于蒸发皿中，水浴上蒸干，加呫吨氢醇试剂，置水浴上加热2分钟，如溶液显红色，表明可能含有2，6-二去氧糖的强心
45、苷类。v本实验也可取强心苷固体样品少许，加入1ml呫吨氢醇试剂振摇，置水浴上加热3分钟，如呈现红色，表明可能含有2，6-二去氧糖。67（2）香豆素、内酯类v1）异羟肟酸铁反应：取1ml供试液于试管中，加7盐酸羟胺醇溶液及10氢氧化钠溶液各23滴，置沸水浴上加热数分钟至反应完全，放冷，加1盐酸调pH34，再加12滴1三氯化铁试剂，如溶液为红色或紫色，表明可能含有香豆素或内酯类。v2）开环-闭环反应：取1ml供试液于试管中，加23滴1氢氧化钠溶液，于沸水浴上加热34分钟，得澄清溶液，再加35滴2盐酸使溶液酸化，如溶液变为混浊，表明可能含有内酯类化合物。68v3）重氮化偶合反应：取1ml供试液于试管
46、中，加数滴5碳酸钠试剂，于沸水浴上加热数分钟，冷后，加数滴新配制的重氮盐试剂，如呈红色或紫色，表明可能含有香豆素类化合物。v4）间硝基苯反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒2间硝基苯试剂，待乙醇挥发后，再喷洒2.5mol/L氢氧化钾溶液，置70100的恒温箱中加热，如呈紫红色，表明可能含有内酯类化合物。本试验也可在试管中进行。v5）荧光反应：取供试液，点于滤纸片上或硅胶色谱板上，干燥后置紫外灯下观察，如呈现蓝-绿色荧光，再喷洒1氢氧化钾试剂，荧光加强，表明可能含有香豆素类化合物。69v3.石油醚溶性成分的检识 取2g中药粗粉，加10ml石油醚，室温下浸渍提取23小时，滤过，滤液作下列成分检识。（1
47、）甾体、三萜类：同醇溶性成分甲项检识。70（2）挥发油、油脂类v1）油斑试验：取供试液点于滤纸片上，室温下挥去溶剂后，滤纸片上如留有油斑，表明可能含有油脂或挥发油，若稍经加热，油斑消失或减少，表明可能含有挥发油，如油斑无变化，表明可能含有油脂。v2）香草醛-浓硫酸反应：取供试液点于硅胶色谱板上，挥去石油醚，喷洒香草醛-浓硫酸试剂，如产生红、蓝、紫等颜色，表明可能含有挥发油、萜类和甾醇。714.氰苷类成分的检识v（1）苦味酸钠反应：取1g样品，检前捣碎，置于试管中，加数滴蒸馏水使湿润，于试管中悬挂一条苦味酸钠试纸（勿使试纸接触试管下部样品），用胶塞塞住试管，于5060水浴中加热1530分钟，如试
48、纸由黄色变为砖红色，表明可能含有氰苷。v（2）普鲁士蓝反应：取1g样品，检前捣碎，置于试管中，加蒸馏水使湿润，立即用滤纸将试管口包紧，并在滤纸上加1滴10氢氧化钾溶液，于5060水浴中加热1530分钟，再在滤纸上分别滴加10硫酸亚铁试剂、10盐酸、5三氯化铁试剂各1滴，如滤纸显蓝色，表明可能含有氰苷。725.实验说明及注意事项v（1）本实验所用的供试品，可根据具体情况，灵活选择，但应包括试验材料项中所列出的成分，提倡尽可能使用有代表性的化学对照品。v（2）预试验反应完成后，首先对反应结果明显的成分进行分析判断，作出初步结论。而对某些反应结果不十分明显的，应进一步浓缩处理供试液，再进行检识或另选
49、一些试剂进行检识，有时可配合色谱法检识。73v（3）判断分析各反应结果时，应综合考虑，例如异羟肟酸铁反应为阳性的有酯、内酯、香豆素类等化合物，要配合香豆素的特有反应，将香豆素与其它酯类化合物进行区别。v（4）预试验结果一般只能提供试样中可能含有哪些类型的化学成分，然后设计提取分离的工艺方法，通过对提取分离得到的成分进一步检识，才能确定该药材中含有哪些成分。74（五）色谱预试（五）色谱预试 色谱预试不仅可以减少成分间的相互干扰，还可以根据展开剂和各成分的比移值Rf，推断各成分的极性大小和溶解性能。如有寻查物的标准品作对照，可以初步判断供试液中含有何种化合物。各类成分的常用色谱预试条件见表12-2
50、。 7576三、活性成分筛选三、活性成分筛选（一）活性成分筛选的两种思路（一）活性成分筛选的两种思路 对中药进行有效成分探索时，进行活性成分筛选应以能反映中药治疗作用的药理活性指标（即动物试验）作为指针。筛选方法有两种：一种是在提取分离得到单体后再进行活性测试，即对每一个单体成分进行多个生物活性试验指标的观察。这种方法测试结果比较容易判断，但分离工作盲目性较大，特别是那些活性很强的微量成分在分离过程中易丢失，目前已渐少采用。 77 另一种是将提取分离的每一阶段的组分进行活性评估，追踪其活性最强部分，再继续追踪，结合药理试验筛选，直到活性单体成分的得到。此种方法筛选工作复杂，需要较好的设备和仪器
