1、 Tea Biotechnology李远华李远华 主要内容主要内容生物技术概念；生物技术的分类及其特点；茶叶生物技术的内容及其特点；茶叶生物技术的研究现状；酶工程在茶学领域中的应用；基因工程在茶学领域中的应用；细胞工程在茶学领域中的应用；发酵工程在茶学领域中的应用；我国茶叶生物技术研究的展望；生物技术对茶产业发展的影响。 国际经济合作及发展组织(IECDO)将生物技术定义为应用自然科学及工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或用于为社会服务的技术。内容可分为细胞工程、酶工程、发酵工程、基因工程和蛋白质工程。 特别是现代生物技术正在推动新的科技革命的形成，基因组学、后基因组学
2、、蛋白质组学、干细胞技术和组织工程学、系统生物学、植物转基因技术、体细胞克隆、生物芯片、基因治疗、生物药物等技术将发挥主导作用。 20世纪60年代末英国剑桥大学化学系对茶树幼茎切片的培养，探讨咖啡因合成途径。 20世纪70年代YTakino和GWSanderson等以及施兆鹏分别研究了单宁酶和果胶酶提高速溶茶制率、减少冷后浑及改善速溶茶汤色。利用发酵技术开发具有特殊风味及营养保健功效的新型茶叶制品如红茶菌、茶酒。 虽然茶叶生物技术研究起步较晚，但进展较快，当前已是茶学学科的一个热点，特别是基因工程技术在茶叶中应用取得了突飞猛进，茶叶基因的分离转化，茶树基因组学研究等，中国农业科学院茶叶研究所、
3、安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室、浙江大学茶叶研究所等都取得了可喜成就。 茶叶生物技术是茶学与生物技术结合的交叉学科，是利用生物技术来解决茶产业面临问题。 茶叶生物技术综合了微生物学、细胞生物学、遗传学、植物生理学、生物化学、分子生物学、基因工程、细胞工程、微生物工程、生化工程、生物工程下游技术、发酵工程设备以及茶学等多学科知识，它的特点具有典型的智力密集型产业，高投入、高风险和高科技人才，具有研发和产业化周期长、对资源依赖性强和对人才实验操作技能要求高等特征。 我国茶叶生物技术研发应由积极跟踪为主转变为自主创新为主，切实提高自主创新能力，拉近与其他学科生物技术研究水平的差距，使
4、我国拥有一批具有自主知识产权的专利与标准；由单一技术突破为主转变为单一技术突破与多项技术的集成相结合，全面提高我国茶叶生物技术及产业的整体水平；由立足国内市场转变为面向国际市场，充分发挥我国是世界茶叶原产地优势，加速茶产业标准化、市场化、国际化进程；由研究开发为主，转变为研究开发与产业化协调，加速培育新的茶叶经济增长点。 从事茶叶生物技术，必须了解和掌握国家生物技术产业政策、知识产权及生物工程安全条例等有关政策和法规。学好茶叶生物技术，能够成为从事茶学与生物技术有关的应用研究、技术开发、生产管理和行政管理等工作的高级专门人才。 植物生物技术可从其研究对象上分为三个层次，即分子水平上的植物基因工
5、程技术、细胞及亚细胞水平上的植物细胞工程技术以及器官水平上的植物组织培养技术。 植物生物技术在植物繁殖方面已取得了巨大的成功，但由于种种原因，茶叶生物技术的许多研究目前还远远落后于其他作物。目前应用于茶学领域的生物技术主要有酶工程、基因工程、细胞工程、微生物工程等。 （一）（一）酶工程在茶学领域中的应用酶工程在茶学领域中的应用 茶叶酶工程的重要内容是利用酶的高效生物催化功能，促进茶叶内不利及无效成分的有益转化，改善茶叶的色香味形及营养价值等综合品质。 目前主要有多酚氧化酶、果胶酶、多糖水解酶、单宁酶、蛋白酶、-葡萄糖苷酶、纤维素酶等酶制剂已应用于茶学领域。 多酚氧化酶主要用于催化茶叶中多酚类氧
6、化生成茶黄素和茶红素，同时使香气前体物质发生偶联氧化，产生各种香气成分，形成红茶基本风味。付赢萱等利用多酚氧化酶进行为期18d普洱茶渥堆发酵，茶多酚、茶褐素等成分的变化差异显著，且在酶浓度为1.6U/g、3.2U/g时，普洱茶达到了陈年普洱茶品质，汤色深橙红色、明亮，滋味醇厚回甘。 蛋白酶主要用于降解茶叶中蛋白质而生成各种氨基酸，从而改善茶叶的香气和鲜爽度，在红碎茶加工中添加蛋白酶可使氨基酸、茶红素含量提高，茶褐素明显下降，滋味增强，汤色变亮，香气变好；夏季绿茶加工过程中添加木瓜蛋白酶(Papain)能明显提高茶汤中氨基酸的含量，从而有效降低夏茶的苦涩味。 -葡萄糖苷酶是将茶鲜叶中香气前体物质
7、转化成游离态香气成分的关键酶，从茶叶中提取的-葡萄糖苷酶粗品可使夏季烘青绿茶中香叶醇的含量提高13倍，明显改善夏季绿茶香气。另有研究表明：外源单宁酶、果胶酶的加入能有效提高微滤功效和微滤液的生化得率，加酶微滤的平均膜通量提高30 ml/min；同时，微滤中的水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡碱、糖、儿茶素的得率都有较大提高。 梁靖等研究纤维素酶的加入量、酶解温度、酶解时间对速溶茶提取率的影响，结果显示，使用纤维素酶可以有效提高速溶茶的提取率，其最佳工艺参数为酶量0.15U/mL、温度45、时间60min 。 谭淑宜等研究了果胶酶提取和蛋白酶提取分别对红碎茶和绿茶提取液中茶多酚、氨基酸、咖啡碱及水浸
8、出物含量的影响，结果表明，果胶酶对红碎茶和绿茶的提取均有一定的效果，水浸出物含量均有所提高；红碎茶和绿茶经蛋白酶提取，其提取液中氨基酸提取率分别比对照高196.8%和72.8%，可见蛋白酶有利于提高速溶茶滋味品质。速溶茶：维素酶和果胶酶、木瓜蛋白酶，提高提取率及品质。茶浓缩汁生产：单宁酶茶饮料浑浊、沉淀：单宁酶 纤维素酶和半纤维素酶属于多糖水解酶类，可催化纤维素水解成小分子的糖类物质，从而增加茶汤的甜醇度 蛋白酶可将茶叶中的蛋白质水解成各种氨基酸，不仅能改善茶叶的香气和鲜爽度，而且可减少不溶性的复合物产生 提高茶汤的质量酵母菌分泌的胞外酶，可使茶叶中含量较高的茶多酚、蛋白质、碳水化合物发生一系
9、列的化学反应。 于春花等研究了外源酶对普洱生茶浸提液品质的影响，结果显示三种酶对茶褐素氧化贡献由大到小分别为漆酶、蛋白酶、单宁酶；三种酶最优配比为：0.15%、0.05%、0.03%，此条件下，茶多酚含量28.71%，与酶处理前试样比较降低了8.45%，可溶性糖、氨基酸、茶褐素含量分别为11.97%、3.58%、8.60%，是酶处理前的3.49倍、1.10倍、4.32倍。 酶技术在渥堆发酵中的应用研究愈来愈多，其目的主要是为了缩短发酵周期及改善茶叶品质。单宁酶、蛋白酶、多酚氧化酶等复合酶制剂处理普洱茶样后可以明显改变内含成分含量，进而改善茶叶品质。 在夏季金观音鲜叶萎凋过程中添加纤维素酶、木瓜
10、蛋白酶与木聚糖酶能显著提高茶红素、茶黄素和水浸出物，其中添加纤维素酶的效果最好，可使茶黄素含量达到0.57%，茶红素含量达10.93%，水浸出物含量达34.53%。 （二）基因工程在茶学领域中的应用（二）基因工程在茶学领域中的应用 1. 1. DNADNA分子标记技术分子标记技术优势：不受实验组织类型不同和发育时间等方面的影响，实验个体的任何组织器官在各种时期都可能进行分析实验。可完全不受环境因素的影响。环境的改变不能决定DNA的结构，即DNA的核苷酸序列是固定不变的。标识的数目庞大，可覆盖全部的基因组。遗传多态性高，因此具有大量变异的等位基因，也各不相同。有很多标识为共显性，可有效的辨别出纯
11、合DNA型及杂合DNA型，收集全部的DNA遗传信息。DNA分子标记技术更加简单、快捷、自动化。通过实验提取出的DNA，在合适条件下能长时间的进行保存，这在进行物种或者基因的起源及决定性的鉴定上有利。应用：茶树的亲缘关系鉴别、遗传多样性分析、分子遗传图谱的构建、种质资源的分子鉴定等方面。 SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),是一类由几个核苷酸（一般为16个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列。 A
12、FLP（Amplified fragment length polymorphism）技术是由Zabeau等于1993年发明的分子标记技术。AFLP 是基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 限制性酶切片段，并结合了 RFLP 和 PCR 技术特点，具有多态性高、重复性好、假阳性低、所需模板 DNA 量少等特点，非常适合在分子生物学基础相对薄弱的茶树研究中应用。该技术以锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列的3或5端加锚24个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片断进行PCR扩增RFLP和和RAPD技术技术。 RFLP是发展最
13、早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 RAPD 技术是1990 年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物，在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。ISSR (inter-simple
14、 sequence repeat)即简单重复区间序列标记是一种新型的分子标记技术，它是用锚定的SSR ( simple sequence repeats)为引物，采用PCR 技术对位于SSR之间的DNA 序列进行扩增的分子标记技术。ISSR技术具有重复性好、多态性高和操作简单的特点，是一种评价物种间遗传多样性和亲缘关系的有效方法，目前已被广泛应用于植物品种鉴定、基因定位、指纹图谱绘制等方面研究中。2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 自1994年Takeuchi等报道了第一条茶树基因CHS（查尔酮合成酶）序列以来，茶树基因克隆表达取得了较快的发展。 Misako kato等首次对咖啡碱合成
15、酶(TCS)进行了纯化，并对其相关性质进行了研究，且成功地克隆了咖啡碱合成酶基因，是目前茶界发表最高档次的一篇研究论文。发表在MISAKOKATO, KOUICHIMIZUNO，ALANCROZIER. Caffeine synthase gene from tea leavesJ. Nature，2000，406(6799): 956-957。2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 李远华研究咖啡碱合成酶基因mRNA在叶片栅栏组织中表达信号强。（作者李远华，江昌俊，宛晓春，茶树咖啡碱合成酶基因mRNA表达的研究，茶叶科学，2004，1） 李远华对咖啡碱合成酶基因表达与定位，是在武汉大学博士
16、后期间进行，“茶树咖啡碱合成酶基因的表达及定位分析”，资助编号：20060390833，中国博士后科学基金资助项目，研究结果发表： Yuan-Hua Li,Wei Gu,and Sheng Ye. Expression and Location of Caffeine Synthase in Tea Plants，Russian Journal of Plant Physiology（SCI）, 54(5): 698701, 2007。2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 李远华、王朝霞、杨顺利、江昌俊等2001开始从茶树中获得了与茶叶香气形成有关-葡萄糖苷酶基因(李远华博士论文：茶树茶树
17、-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位，位， C a m e l l i a s i n e n s i s b e t a - 1 , 3 - g l u c o s i d a s e mRNA,GenBank,Accession no.,AF537127)。 李远华研究了茶树-葡萄糖苷酶cDNA克隆与原核表达、茶树-葡萄糖苷酶基因mRNA表达的研究、茶树-葡萄糖苷酶基因的定位原位扩增研究。研究-葡萄糖苷酶基因mRNA主要在茶树叶片栅栏组织、叶主脉的薄壁组织表达；不同品种之间的表达位置基本相似，但表达信号却有差异。（有关研究论文以表在：农业生物技术学报，南京农
18、业大学学报，茶叶科学）2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 茶树基因的分离和克隆是茶树生物技术研究的重要内容之一，也是茶树种质资源改良和利用以及茶树生物反应器研究的基础。 李远华等采用SSH 技术分析了VA 菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况，克隆了HMGR基因（GenBank，登录号KJ946250）、GAGP基因（GenBank，登录号KJ946251）、Actin基因(GenBank, 登录号KJ946252)，并进行了表达分析。2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 武夷学院第一个，也是福建省茶叶界第一个国家自然科学基金和结题项目： VA菌根促进茶树生长的转录谱分析和相关候
19、选基因克隆，项目批准号：31070613，已结题（结题号：99982635-1878），国家自然科学基金面上项目，2011-2013，李远华主持。2. 2. 基因克隆和表达基因克隆和表达 茶叶中还有一些很重要基因：多酚氧化酶基因，茶氨酸合成酶基因等。日本人研究的茶树-樱草糖苷酶基因并发表在美国植物生理学期刊，也是重要一个成果。 茶树基因组研究也取得了成果：中科院昆明植物所、云南农大等（高立志、盛军等人，2017年）从“云抗10号”约3.02Gbp；安徽农大、深圳华大基因组中心等（宛晓春、韦朝领等人，2018年）研究“舒茶早”约3.0Gbp ，在美国国家科学院院刊PNAS发表，是中国茶界第一篇这
20、么高水平研究论文。 （三）（三）细胞工程在茶学领域中的应用细胞工程在茶学领域中的应用 细胞工程就是人为地改变或创造细胞的遗传性状，在体外大量培养和繁殖细胞群体，为生物个体或株系提供所需产品的工程技术。目前应用于茶学领域的主要有细胞培养、细胞融合、染色体转移及细胞代谢物的生产等。 在20世纪80年代，Kato等从愈伤组织中诱导再生植株，研究表明，只有在带茎表层的组织上，诱导的愈伤组织才能分化出不定芽，在后面的继代培养中生长发育良好，且茎段纵切的分化率比横切的高。 Akulaa等通过茶树茎段诱导体细胞胚发生，建立了一套较完整的茶树再生体系，在培养基上诱导产生不定胚，之后在1/2浓度大量元素、完全的
21、MS培养基浓度微量元素和维生素的MS培养基中诱导体胚，诱导率达60%。 Kato以幼叶为外植体材料，将其置于不同浓度的2，4-D培养基上培养，在叶的基部能直接或通过胚性愈伤组织诱导出体细胞胚，通过细胞组织学观察发现体细胞胚起源于叶片中脉。 茶树花药培养获得植株，是我国茶界当时突破性一个茶树花药培养获得植株，是我国茶界当时突破性一个成果：成果： 福建农学院亚热带果树研究所园艺植物组织培养育种研究室陈振光教授（园艺系副主任）等经过近十年的研究,成功地从茶树花药中诱导出根、茎、叶完整的植株,并先后将试管苗移植于大田,成活了30株。 目前大部分的栽培品种都是通过常规的育种方法从群体品种中选育而来，而常
22、规的育种方法主要是通过植株表现型的差异进行蹄选，这种方法对于质量性状来说一般是有效的，但数量性状在茶树性状中占主导地位，而数量性状易受外界环境和茶树生理周期的影响，很难在早期进行鉴定，以传统育种方法选育出一个优良新品种，至少需要20年的时间，很难满足现阶段快速培育新品种的需求。 在植物组织培养合成茶氨酸的研究中，日本学者已证实，向培养基中添加前体物质盐酸乙胺时，可大幅度提高愈伤组织中的茶氨酸合成量。 利用茶树细胞培养生物合成法生产儿茶素具有不受地域季节限制、不与传统饮料茶叶争原料、便于产业化等优点，因而受到了国内外的重视。成浩等对此进行了较系统的研究，证实茶树培养细胞在一定的条件下能够保持其次
23、生代谢产物的合成能力，而且可通过培养基组分调节等方法大幅度提高儿茶素含量。 利用组织培养进行植物繁殖，因其具有繁殖系数高、易保持亲本的优良性状等优点，将在茶树育种研究及茶叶生产实际中具有广阔的应用前景。 孙仲序等进行了山东茶树良种组织培养及繁殖能力的研究，结果表明，通过组织培养获得的茶苗移栽成活率达85%，一个外植体经3次继代培养可繁殖47棵苗。 刘德华等以茶树腋芽、叶为外植体进行培养分化出大量胚状体、芽，并获得再生植株。 （四）（四）发酵工程在茶学领域中的应用发酵工程在茶学领域中的应用 发酵工程是生物工程技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节，是一门利用微生物的生长快、生长条件简单、
24、代谢途径特殊等特点，采用工程菌株来生产各种有用物质的工程技术。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。发酵工程技术是应用于茶叶上最早的生物技术，我国传统的黑茶加工中的渥堆过程就是通过微生物分泌的胞外酶及释放的微生物促使茶叶中内含物发生复杂的变化，从而形成黑茶特有的品质风味。 吴谦等以绿茶为主要原料，取汁后使用酵母轻度发酵，研制出清澈透明，清凉爽口的发酵茶。 潘立元等在绿茶茶汤中接种罗氏酵母，研制出酒精度低、口感醇和具有一定保健作用的绿茶汽酒。 龚加顺等利用优势菌种黑曲霉发酵晒青绿茶过程中，主要成分的变化规律表明，随着发酵时间的延长，主要的化学品质成分含量均发生了明显变化，而且可在短时间内
25、生产熟普洱茶，其理化成分含量可达到陈年普洱茶的水平。 丘晓红等在茶汤中接入木醋杆菌和酵母菌，发酵生产出营养丰富的细菌纤维素茶饮料。 康燕山等在普洱茶发酵中，添加了几种外源酶 (纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶) 及外源酵母，结果表明，外源酶及外源酵母的添加对普洱茶发酵过程中成分变化影响显著。 刘泽森等采用双蒸双压、冷发酵2种不同发酵方式处理六堡茶，考察其对六堡成品茶品质及内含物质的影响。分析表明，不同处理的六堡茶茶多酚、氨基酸、咖啡碱、水浸出物、茶红素、茶褐素均有极显著差异，其感官和理化成分都表现出不同的产品特点，双蒸双压处理的六堡茶发酵程度、物质转化程度均低于冷发酵处理。 曹冠华等将筛选出的根霉
26、、黑曲霉和青霉按 1：1：1 比例制成发酵剂，添加 1%的量进行普洱茶渥堆发酵，得到了较好的发酵效果。 赵龙飞等认为普洱茶发酵是多种微生物作用以及茶叶内含物质在酶和湿热的作用下，发生酶促和非酶促反应的过程，其中酵母菌在这个过程中对不同风味陈香的形成发挥着重要作用。在湿热条件和酶的作用下，茶叶中的碳水化合物即糖类逐渐被转化，为酵母菌的生长和繁殖提供营养，促进其分解作用的进行。 梁名志等报道指出，通过人工接种酵母、黑曲霉和青霉这三种微生物进行固态发酵的发酵产品具有较好的滋味、汤色、香气等感官品质，同自然渥堆发酵茶样相比，该工艺下茶多酚和水浸出物含量优越，在药用功能方面，防治努南氏综合症和胃癌的效果
27、较好。 王朝霞等用RT-PCR法扩增出一204 bp的cDNA特异片段，然后通过3/5RACE的方法，分别扩增出3端和5端的序列，从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列，所得序列全长627 bp，编码l01个氨基酸。该基因若能成功转入茶树，并高效表达，将有望抗茶丽纹象甲、茶籽象甲、绿鳞象甲等害虫，这将有望解决制约我国茶叶出口的农药残留问题。 展望：展望：1、利用酶的高效生物催化特性，几乎可按照人们的意愿“塑造”茶叶品质，因此酶技术是解决茶叶品质问题及开发茶叶新产品的有效途径，尤其是对茶氨酸合成酶、多酚氧化酶及-葡萄糖苷酶等几种与茶叶品质密切相关的酶的研究更应重视。2、利用基因工程技
28、术研究确定儿茶素、茶氨酸等茶叶保健功能成分的目的基因，然后将其转入某些工程苗，采用发酵工程技术进行高效生产，这种基因工程和发酵工程等技术的综合研究，将为茶叶保健功能成分的开发利用开辟新的道路。3、DNA 分子标记技术将在茶树种质资源研究领域有更广泛的用途和前景。如 ACGM 标记，能够探知亲缘关系较近的物种间的同源基因的功能，对于茶树这种遗传背景复杂，且基因序列研究较少的物种，可以通过一些和茶树亲缘关系较近且功能基因研究较多的物种进行 ACGM 标记，找到一些新的功能基因。4、近红外光谱技术（Near Infrared，NIR）是一种高效快速的现代分析技术，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化
29、学计量学等多个学科的最新研究成果。NIR 技术已尝试应用于茶叶含水量、咖啡碱、茶多酚、茶黄素和茶红素、总氮量、纤维素、茶叶抗氧化活性等方面的快速检测；NIR 技术还应用于茶叶等级、茶叶种类、茶叶真伪等方面的判别上；此外，NIR 技术在茶鲜叶质量评价（嫩度、匀净度和新鲜度）上和茶鲜叶产地判别上也进行了尝试。图表图表1：2017年年12月农业部等月农业部等9部门关于认定中国特部门关于认定中国特色农产品优势区名单（第一批）色农产品优势区名单（第一批）1、在茶叶加工领域，应用生物技术，可以创造出更多的经济效益。茶叶加工中应用酶工程技术，利用酶如多酚氧化酶、单宁酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶等高效
30、生物催化功能，促进茶叶内不利及无效成分的有益转化，改善茶叶的色香味形品质及营养价值等综合品质。发酵工程技术应用于茶叶上，我国传统的黑茶加工中的渥堆过程就是通过微生物分泌的胞外酶及释放的微生物促使茶叶中内含物发生复杂的变化，从而形成黑茶特有的品质风味。2、在茶叶深加工领域，研制具有广谱、高效、无毒的纯天然的茶叶生物防腐、保鲜剂，保持新鲜茶叶所具有的色、香、味、形，生产出符合消费者需要的天然、新鲜、健康和安全茶叶。茶叶富含茶多酚、咖啡碱、氨基酸、茶多糖、维生素、芳香类物质等生物活性成分而具有抑菌、抗病毒、防癌抗癌等保健功能，可以利用细胞培养法进行生产。3、发酵技术用于茶叶综合利用，茶叶下脚料可发酵生产木糖酶和过氧化物酶等多种酶制剂，用固体发酵法可从低档茶叶及茶渣中制取高蛋白质饲料等。4、应用生物芯片技术，能够准确、快速对茶树基因、蛋白质、核酸等生理活性物质的结构、功能、机理等进行检测和分析，能够进行快速、准确地检测和分析茶叶品质因子和农药残留等安全指标。应用基因组学、蛋白质组学技术，可以从更高水平来系统研究茶树的功能与结构，创新茶树优良种质和提供优质原料，为茶产业可持续发展、茶叶效益提升创出一条崭新路子。
