1、2022-6-7酶制剂发酵工艺酶制剂发展概况酶制剂发展概况l1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备得到高峰淀粉酶（-淀粉酶、他卡酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用淀粉酶、他卡酶），用作消化剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。的先例。l1908年，德国的罗姆（年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰酶，用于皮革）用动物胰脏制得胰酶，用于皮革的软化。的软化。l1908年，法国的波伊定（年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌淀粉酶，用于纺）制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的退浆；织品的退浆；l1911年，华勒斯坦（年，华勒斯坦
2、（Wallerstein）从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用）从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。于啤酒的澄清。 l1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌年，日本开始采用微生物液体深层培养方法进行细菌-淀粉淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕。l20世纪世纪80年代发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵年代发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。第一节第一节 酶的生产方法酶的生产方法一、酶的生产方法一、酶的生产方法1 1、提取法、提取法 直接从动、
3、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简直接从动、植物细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的限制。单易行，但受原材料来源的限制。2 2、化学合成法、化学合成法 是是20世纪世纪60年代中期出现的新技术。年代中期出现的新技术。 只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。 目前仍然停留在实验室内合成的阶段。目前仍然停留在实验室内合成的阶段。牛胃牛胃凝乳酶凝乳酶胰脏胰脏胰酶胰酶血液血液凝血酶凝血酶木瓜木瓜木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶3 3、微生物发酵法、微生物发酵法 是是20世纪世纪50年代以来生产酶的主要方法。年代以来生产酶的主要方法。 利用
4、微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。二、应用微生物来开发酶的优点二、应用微生物来开发酶的优点微生物微生物酶酶三、酶发酵生产的类型三、酶发酵生产的类型1 1、液体深层发酵：、液体深层发酵： 液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。下发酵。2 2、固体培养发酵、固体培养发酵 培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件
5、下发酵。株，在一定条件下发酵。3 3、固定化细胞发酵（、固定化细胞发酵（7070年代后期发展）年代后期发展） 将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。4 4、固定化原生质体发酵（、固定化原生质体发酵（8080年代中期发展）年代中期发展） 原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。第二节第二节 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论一、酶生物合成的过程一、酶生物合成的过程DNADNARNARNA蛋白质（新生多肽链）蛋白质（新生多肽链）成熟蛋白质（酶）成熟蛋白质（酶）胞内胞内胞外胞外转录翻译加工分泌或定位二、酶
6、生物合成的调节二、酶生物合成的调节 按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：组成酶组成酶恒定（速度、浓度）恒定（速度、浓度）诱导酶诱导酶在外界环境因素诱导下合成速在外界环境因素诱导下合成速度急增，酶浓度成百上千倍增度急增，酶浓度成百上千倍增加加(适应型酶、调节型酶)酶合成的基因调控类型：酶合成的基因调控类型：诱导诱导和和阻遏阻遏1 1、酶合成的诱导作用、酶合成的诱导作用 加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用。诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。诱导物一般是酶
7、催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导例：乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导淀粉诱导a- a-淀粉酶的合成淀粉酶的合成2 2、酶合成的阻遏、酶合成的阻遏（1 1）终产物阻遏）终产物阻遏 指酶催化反应的产物或代谢途径指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。阻遏的现象。（2 2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）分解代谢物阻遏（营养源阻遏） 是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。遏其他酶合成的现象。 葡萄糖阻遏葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成半乳糖苷酶的生物合成 果糖
8、阻遏果糖阻遏a- a-淀粉酶的生物合成淀粉酶的生物合成A1 B1A2 B2EA BE色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶第三节第三节 微生物发酵产酶工艺条件及控制微生物发酵产酶工艺条件及控制 发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养提供适当的营养和生长环境和生长环境，使生产菌，使生产菌大量增殖大量增殖，同时，同时合成所需要的酶合成所需要的酶，然后，然后由发酵所得物料制成酶产品。由发酵所得物料制成酶产品。 现代酶制剂的大规模生产以现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法深层液体发酵法为主。为主。 无论哪种发酵
9、法，都要做三方面的工作：无论哪种发酵法，都要做三方面的工作： （1 1）从原料准备培养基；）从原料准备培养基； （2 2）从原始菌种准备生产菌种；）从原始菌种准备生产菌种； （3 3）发酵过程管理。）发酵过程管理。一、发酵产酶的一般工艺流程一、发酵产酶的一般工艺流程 原原 料料 原始菌种原始菌种 麸皮等原料麸皮等原料 饼粕等原料饼粕等原料 淀粉质原料淀粉质原料 试管斜面培养试管斜面培养(活化) 配制培养基配制培养基 ( (灭菌灭菌) )按不同原料按不同原料 净化、粉碎净化、粉碎 摇瓶等分级扩大培养摇瓶等分级扩大培养作不同处理作不同处理 水解水解 种子罐培养种子罐培养 淀粉糖液淀粉糖液 发酵罐发
10、酵罐(液体发酵液体发酵) 发酵池发酵池(固体发酵固体发酵) 培养 配制培养基配制培养基 (灭菌灭菌) 发酵液发酵液 成品曲成品曲 下游加工 液态酶制剂液态酶制剂 固体粗酶制剂固体粗酶制剂 各种精制酶制剂各种精制酶制剂 酶发酵生产的一般工艺流程图酶发酵生产的一般工艺流程图保藏菌种保藏菌种 试管斜面培养（活化）试管斜面培养（活化）摇瓶扩大培养摇瓶扩大培养种子罐培养种子罐培养发酵罐发酵罐分离纯化分离纯化酶酶培养基培养基无菌空气无菌空气 二、酶生产菌种二、酶生产菌种（一）产酶菌种的要求（一）产酶菌种的要求（1 1）产酶量高；）产酶量高；（2 2）繁殖快，发酵周期短；）繁殖快，发酵周期短；（3 3）产酶
11、稳定性好，不易退化，不易被感染；）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；（4 4）能够利用廉价原料，容易培养和管理；）能够利用廉价原料，容易培养和管理；（5 5）安全性可靠，非致病菌）安全性可靠，非致病菌。（二）常用的产酶微生物（二）常用的产酶微生物1 1、细菌、细菌大肠杆菌大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶、天冬酰胺酶、-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。枯草杆菌枯草杆菌 -淀粉酶、蛋白酶、 -葡聚糖酶、5-核苷酸酶、碱性磷酸酶。2 2、放线菌、放线菌 链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素
12、酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。3 3、霉菌、霉菌 黑曲霉：糖化酶、黑曲霉：糖化酶、- -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。 米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉：红曲霉：- -淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。等。 木霉：纤维素酶。木
13、霉：纤维素酶。 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉：蛋白酶、糖化酶、毛霉：蛋白酶、糖化酶、- -淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。凝乳酶等。4 4、酵母、酵母 啤酒酵母啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。 假丝酵母：假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源酶酶产酶微生物产酶微生物用途用途-淀粉酶淀粉酶枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌地衣芽胞杆菌地衣芽胞杆菌米曲霉米曲霉
14、淀粉液化，织物退浆，消化淀粉液化，织物退浆，消化助剂，加酶洗涤剂助剂，加酶洗涤剂葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶米曲霉，黑曲霉，米曲霉，黑曲霉，米根霉米根霉制造葡萄糖，发酵、酿酒等制造葡萄糖，发酵、酿酒等工业的淀粉水解糖工业的淀粉水解糖中性蛋白酶中性蛋白酶枯草芽胞杆菌，米枯草芽胞杆菌，米曲霉曲霉皮革、毛皮加工，食品加工，皮革、毛皮加工，食品加工，调味品制造、助消化、消炎、调味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清啤酒澄清碱性蛋白酶碱性蛋白酶地衣芽胞杆菌地衣芽胞杆菌加酶洗涤剂加酶洗涤剂植酸酶植酸酶黑曲霉，毕赤酵母黑曲霉，毕赤酵母工程菌株工程菌株饲料添加剂饲料添加剂纤维素酶纤维素酶里氏木霉、黑曲霉里氏木霉、黑曲霉
15、水洗布生产，饲料添加剂，水洗布生产，饲料添加剂，消化植物细胞壁消化植物细胞壁半纤维素半纤维素酶酶木霉、曲霉、根霉木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞饲料添加剂，消化植物细胞壁，低聚木糖生产壁，低聚木糖生产-葡聚糖葡聚糖酶酶枯草芽胞杆菌，黑曲枯草芽胞杆菌，黑曲霉，霉，Penicillium emersonii啤酒酿造，饲料添加剂啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶异淀粉酶产气克雷伯氏菌，芽产气克雷伯氏菌，芽孢杆菌孢杆菌淀粉加工淀粉加工乳糖酶乳糖酶乳酸酵母，米曲霉，乳酸酵母，米曲霉，黑曲霉，米根霉黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶果胶酶曲霉、欧文氏菌曲霉、欧文氏菌
16、水果加工，果汁、果酒澄清，水果加工，果汁、果酒澄清，麻类纤维脱胶麻类纤维脱胶 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源转化酶转化酶啤酒酵母、假丝酵母啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖制造转化糖凝乳酶凝乳酶米赫毛霉米赫毛霉,大肠杆菌和真大肠杆菌和真菌生产的重组酶菌生产的重组酶制造乳酪制造乳酪脂肪酶脂肪酶曲霉、根霉、酵母等曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工生物化工葡萄糖氧葡萄糖氧化酶化酶青霉、曲霉青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖定葡萄糖葡萄糖异葡萄糖异构酶构酶凝结芽胞杆菌，白色链凝结芽胞杆菌，白色链霉菌
17、霉菌生产果葡糖浆生产果葡糖浆青霉素酰青霉素酰化酶化酶细菌、霉菌、放线菌细菌、霉菌、放线菌制造制造6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸 工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源（三）生产菌种的来源（三）生产菌种的来源1 1、买，专利、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（中国工业微生物菌种保藏中心（CICCCICC）；）； 中国典型培养物保藏中心（中国典型培养物保藏中心（CCTCCCCTCC，又称武大保藏中心）。，又称武大保藏中心）。 中国农业微生物菌种保藏中心（中国农业
18、微生物菌种保藏中心（ACCCACCC）；）； 中国普通微生物菌种保藏管理中心（中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCCCGMCC） 美国典型微生物菌种保藏中心（美国典型微生物菌种保藏中心（ATCCATCC） 荷兰微生物菌种保藏中心（荷兰微生物菌种保藏中心（CBSCBS） 德国微生物菌种保藏中心（德国微生物菌种保藏中心（DSMZDSMZ） 英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTCNCTC） （1 1）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、）样品的采集：主要是各种富含所需微生物的土壤、水、气、枯枝烂叶、烂水果等气、枯枝烂叶、烂水果等 ；产酶菌种筛选步骤：产酶菌种筛选步骤
19、：2 2、筛选、筛选 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选行分离筛选 。（2 2）初筛：分离产目的酶的菌株；）初筛：分离产目的酶的菌株； 给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株分离出来。 - -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选蛋白蛋白酶的筛选酶的筛选（3 3）复筛：从所得菌株中筛选优良株；）复筛：从所得菌株中筛选优良株； 在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。诱变育种 细胞杂交原生质体融合育种 基因工程育种 （4 4）高产菌株的选育。）高产菌株的选育。（四）生产种子的制备（
20、四）生产种子的制备 生产种子：生产种子：由原始保藏菌种，经过由原始保藏菌种，经过活化活化，扩大培养扩大培养，用，用于发酵罐接种的大量菌体。于发酵罐接种的大量菌体。1 1、种子制备工艺过程、种子制备工艺过程保藏菌种保藏菌种活化培养活化培养逐级摇瓶培养逐级摇瓶培养种子罐培养种子罐培养接种至发酵罐接种至发酵罐（1 1）菌种活化）菌种活化 目的：目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力恢复细胞的生命活动能力。 方法：在试管斜面上培养方法：在试管斜面上培
21、养1-31-3代。代。（2 2）扩大培养）扩大培养 目的：目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得以获得足够数量足够数量的的优质优质细胞。细胞。 培养基称为种子培养基。培养基称为种子培养基。 方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段。扩大培养应注意的事项：扩大培养应注意的事项：（1 1）尽量）尽量减少传代次数减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性；，以降低菌种衰退和污染的可能性；（2 2）培养基成分一般应比发酵培养基的）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源氮源丰富；丰富；（3 3）培养时间一般控制在微生物生
22、长的）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期对数生长期，及时接，及时接入下一级培养或发酵罐；入下一级培养或发酵罐；（4 4）严格控制）严格控制培养条件培养条件（pHpH、温度、通气量等），加强培、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。养过程的实时监测。三、培养基三、培养基1 1、碳源、碳源：提供碳元素；能源。提供碳元素；能源。 碳源碳源、氮源氮源、无机盐无机盐、生长因素生长因素、水水等。等。 来源：淀粉及其水解物来源：淀粉及其水解物淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。 此外石油产品中此外石油产
23、品中1212碳碳1616碳的碳氢化合物已成功用作微生碳的碳氢化合物已成功用作微生物培养基的碳源。物培养基的碳源。 注意注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。 培养基培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。物质的混合物。2 2、氮源：、氮源：提供氮元素。提供氮元素。 来源：有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的来源：有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、
24、菜子饼等；副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等； 无机氮：含氮的无机化合物，如（无机氮：含氮的无机化合物，如（NHNH4 4）2 2SO4SO4、NHNH4 4NONO3 3 、NaNONaNO3 3和（和（NHNH4 4）3 3POPO4 4等。等。3 3、无机盐：、无机盐：大量元素和微量元素大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分；基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分；构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。作为酶的激活剂。4 4、生长因子、生长因子 指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类
25、物质。种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。 酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。5 5、水、水配制培养基的注意事项配制培养基的注意事项：（1 1）培养基的）培养基的碳氮比碳氮比是培养基成分配比的重点；是培养基成分配比的重点；（2 2）碳源和氮源的选择，要注意避免）碳源和氮源的选择，要注意避免碳分解代谢阻碳分解代谢阻遏遏和和氮分解代谢阻遏氮分解代谢阻遏；（3 3）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的）培养基中无机盐的选择要注意盐类引起的生理生
26、理酸碱性反应酸碱性反应；（4 4）发酵生产所用的培养基成分配比）发酵生产所用的培养基成分配比不可轻易改变不可轻易改变。（二）培养基的种类（二）培养基的种类1 1、斜面培养基：、斜面培养基： 是供菌种生长繁殖使用的。是供菌种生长繁殖使用的。2 2、种子培养基：、种子培养基： 是供菌种生长繁殖使用的。是供菌种生长繁殖使用的。3 3、发酵培养：、发酵培养： 是供菌种生长繁殖和发酵产物合成之用。是供菌种生长繁殖和发酵产物合成之用。四、发酵条件的控制四、发酵条件的控制影响产酶的几个重要条件影响产酶的几个重要条件1 1、温度的调节控制、温度的调节控制（2）有些微生物）有些微生物生长最适温度生长最适温度与与
27、发酵产酶的最适温度发酵产酶的最适温度有所不有所不同。同。例：例： 酱油曲霉生产蛋白酶，酱油曲霉生产蛋白酶，28时蛋白酶产量比在时蛋白酶产量比在40 条件条件下高下高24倍，在倍，在20条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。生长速率较慢。 为此为此，在有些酶的发酵生产过程中，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段要在不同的发酵阶段控制不同的温度控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同
28、的最适生长温度。）不同的微生物有不同的最适生长温度。（3）温度的控制方法）温度的控制方法 一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。2 2、pHpH值的调节控制值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。值有所不同。（2） 微生物生长的最适微生物生长的最适pH值与产酶最适值与产酶最适pH值往往不同。值往往不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过）有些微生物可
29、以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。，往往可以改变各种酶之间的产量比例。黑曲霉黑曲霉 - -淀粉酶淀粉酶 糖化酶糖化酶pHpH值中性值中性 pHpH值偏酸性值偏酸性 （4 4）影响）影响pHpH值的因素值的因素一般来说，培养基成分中一般来说，培养基成分中C/NC/N比高比高，发酵液倾向于，发酵液倾向于酸性酸性，pHpH低；低；C/NC/N比低比低，发酵液倾向于，发酵液倾向于碱性碱性，pHpH高。高。不同盐的利用对不同盐的利用对pHpH也会产生影响。也会产生影响。（5 5）生产中控制）生产中控制pHpH值的方法值的方法添加添加缓冲
30、液缓冲液维持一定的维持一定的pHpH值（如磷酸盐）；值（如磷酸盐）；调节培养基的调节培养基的原始原始pHpH，保持一定的，保持一定的C/NC/N比比；发酵液中发酵液中pHpH过高，加过高，加糖或淀粉糖或淀粉来调节。反之，加来调节。反之，加尿素尿素或液氨或液氨；pHpH值还与通气量有关。值还与通气量有关。通过调节通过调节通气量通气量来实现；来实现；加加酸酸、碱碱。3 3、溶解氧的调节控制、溶解氧的调节控制 溶解氧溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。氧。l调节溶氧速率的方法调节溶氧速率的方法（1 1）调节通气量；）调节通气量；（2 2）
31、调节氧的分压；）调节氧的分压；（3 3）调节气液接触时间；）调节气液接触时间；（4 4）调节气液接触面积；）调节气液接触面积；（5 5）改变培养液性质。）改变培养液性质。5 5、湿度的调节控制、湿度的调节控制 用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。期湿度大些，有利于产酶。4 4、泡沫、泡沫l形成：形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。l危害：危害：阻碍阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。的排除，影响氧的溶解；引起染菌。l消泡方法：消泡方
32、法：机械消泡、化学消泡。机械消泡、化学消泡。五、提高酶产量的措施五、提高酶产量的措施（一）添加诱导物（一）添加诱导物 诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高酶产量。酶产量。1 1、不同的酶有各自不同的诱导物；但有时一种诱导物可诱导、不同的酶有各自不同的诱导物；但有时一种诱导物可诱导生成同一酶系的若干种酶；同一种酶往往有多种诱导物。生成同一酶系的若干种酶；同一种酶往往有多种诱导物。3 3、诱导物的浓度：、诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。必须控制在适当浓度。2 2、诱导物的分类、诱导物的分类 （1 1）酶作用的底物；）酶作用的底物；
33、（2 2）酶作用底物的类似物；）酶作用底物的类似物； （3 3）酶的反应产物；）酶的反应产物； （4 4）底物和底物类似物的前体物。）底物和底物类似物的前体物。（二）控制阻遏物的浓度（二）控制阻遏物的浓度1 1、解除终产物阻遏的方法、解除终产物阻遏的方法降低培养基中酶作用产物的浓度；降低培养基中酶作用产物的浓度；添加终产物的类似物。添加终产物的类似物。2 2、解除分解代谢产物阻遏的方法、解除分解代谢产物阻遏的方法控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较难利用的碳源（如淀粉等），或采用补料，分次流加碳源等方难利用的碳源（如淀粉等），
34、或采用补料，分次流加碳源等方法，以控制碳源浓度在较低的水平，以利于酶产量的提高；法，以控制碳源浓度在较低的水平，以利于酶产量的提高；添加一定量的环腺苷酸（添加一定量的环腺苷酸（cAMPcAMP），可以解除分解代谢物阻遏），可以解除分解代谢物阻遏作用。作用。（三）通过基因突变提高酶产量（三）通过基因突变提高酶产量使诱导型变成组成型；使诱导型变成组成型；使阻遏型变成去阻遏型。使阻遏型变成去阻遏型。（四）其他提高酶产量的方法（四）其他提高酶产量的方法1 1、添加细胞渗漏增强物：、添加细胞渗漏增强物： 如吐温（如吐温（TweenTween）、催通（）、催通（TritonTriton）等。）等。 在培养
35、基中添加在培养基中添加1%的吐温（的吐温（Tween），可使纤维素酶的产），可使纤维素酶的产量提高量提高1020倍。倍。2 2、其他产酶促进剂、其他产酶促进剂 植酸钙植酸钙 ： 霉菌蛋白酶或橘青磷酸二酯酶 120倍 聚乙烯醇聚乙烯醇 衍生物衍生物 ：可防止霉菌菌丝结球，提高糖化酶产量 聚乙烯醇聚乙烯醇 、醋酸钠等、醋酸钠等 ：纤维素酶 这些物质的实际效果明显，但作用机制还需深入探讨。第四节第四节 酶的分离纯化酶的分离纯化一、酶的提取、分离纯化技术路线一、酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞
36、发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。1、细胞破碎、细胞破碎许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶
37、原料，使酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行
38、提取水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 2 2、酶的提取、酶的提取 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、控制好温度、pHpH值等提取条件。值等提取条件。酶的主
39、要提取方法酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象盐溶现象。 （1 1）沉淀分离）沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它
40、溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的
41、条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离盐析盐析 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为，这称为盐析现象盐析现象。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用
42、，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法（2 2）过滤与膜分离）过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过过滤滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过
43、滤：采用各种高分子膜为过滤介质 过滤的分类及其特性过滤的分类及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤粗滤 2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤微滤0.22m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤超滤200.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透反渗透 20生物小分子、盐、离子反渗透膜微滤微滤 0.110 m：细菌、煤灰、发酵细胞、颜料、蛋白等细菌、煤灰、发酵细胞、颜料、蛋白等超滤超滤 0.005 0.1 m：蛋白、颜料、多糖、大分子蛋白、颜料、多糖、大分子纳滤纳滤
44、 0.00050.005 m：低聚糖、染料、多价离子低聚糖、染料、多价离子反渗透反渗透0.00010.001 m：电解质、大于电解质、大于100Da的有机溶质的有机溶质水、小于水、小于100Da的有机溶质的有机溶质 膜的适用范围（3 3）酶的浓缩、干燥与结晶）酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。纯化过程中是一个重要的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干
45、燥凝胶等吸去水分，作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩真空浓缩。即在一定的真空条件下，。即在一定的真空条件下，使酶液在使酶液在6060以下进行浓缩。以下进行浓缩。在固体酶制剂的生产过程中，在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥真空干燥冷冻干燥冷冻干燥喷雾干燥喷雾干燥气流干燥气流干燥吸附干燥吸附干燥
