1、一、实验目的一、实验目的1、了解粗糙链孢霉的杂交方法；、了解粗糙链孢霉的杂交方法；2、通过、通过Lys和和Lys杂交后代表现型的分析，杂交后代表现型的分析，了解顺序四分子的基因作图方法；了解顺序四分子的基因作图方法；3、加深分离和交换定律的理解，了解基因转变、加深分离和交换定律的理解，了解基因转变现象。现象。 二、实验原理二、实验原理u粗糙链孢霉粗糙链孢霉 ( Neurosporocrassa ) 属真菌的子囊菌属真菌的子囊菌纲。两种不同接合型菌株的结合受一对等位基因纲。两种不同接合型菌株的结合受一对等位基因控制，可验证分离规律。控制，可验证分离规律。u利用粗糙孢霉利用粗糙孢霉Lys和和Lys
2、杂交，野生型孢子成熟杂交，野生型孢子成熟较早，缺陷型子囊孢子成熟较迟的特点，观察杂较早，缺陷型子囊孢子成熟较迟的特点，观察杂交后代的表型并进行分析交后代的表型并进行分析 ，可用于着丝粒作图。，可用于着丝粒作图。粗糙链孢霉的生活周期粗糙链孢霉的生活周期（接合型与高等动植物中性别的不同）（接合型与高等动植物中性别的不同）四分子分析用于验证基因分离规律四分子分析用于验证基因分离规律（Lys+Lys+） （Lys-Lys-） 合子（合子（+/-+/-） 子囊孢子子囊孢子1 1：1 1分离：分离：4 4个黑色（个黑色（+ +） 4 4个灰色（个灰色（- -）顺序四分子分析用于着丝粒作图顺序四分子分析用于
3、着丝粒作图目的基因与着丝粒之间发生重组目的基因与着丝粒之间发生重组1、着丝粒为、着丝粒为M1分离分离2、目的基因的分离、目的基因的分离 M1分离：目的基因与着丝粒之间未发生重组，分离：目的基因与着丝粒之间未发生重组，产生非重组型子囊产生非重组型子囊M2分离：目的基因与着丝粒之间发生重组，产分离：目的基因与着丝粒之间发生重组，产生重组型子囊生重组型子囊lys C交换型子囊与非交换型子囊的形成交换型子囊与非交换型子囊的形成非交换型子囊非交换型子囊 M1交换型子囊交换型子囊 M2目的基因在目的基因在M1分离，产生非重组型子囊分离，产生非重组型子囊目的基因在目的基因在M2分离，产生重组型子囊分离，产生
4、重组型子囊 + + + + - - - -+ + - - + + - - - + + - - + + - - + + + + - -+ + - - - - + + 非正常分离子囊非正常分离子囊基因转换：一个基因在联会过基因转换：一个基因在联会过程中受到等位基因的影响而发程中受到等位基因的影响而发生变化。基因转换总是伴随着生变化。基因转换总是伴随着染色体之间的交换染色体之间的交换M后分离：后分离：基因转换基因转换产生不正常分离子囊产生不正常分离子囊着丝粒和基因之间的重组值的计算着丝粒和基因之间的重组值的计算 基因与着丝粒之间的图距为去掉的重组值基因与着丝粒之间的图距为去掉的重组值M2分裂分离子囊
5、数分裂分离子囊数子囊总数子囊总数1/2100%三、实验用品三、实验用品1、材料：粗糙链孢霉野生型菌株，、材料：粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+。 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-。2、药品：、药品：琼脂、蔗糖、玉米粒、土豆、琼脂、蔗糖、玉米粒、土豆、 5次次氯酸钠（氯酸钠（NaClO）、）、5石碳酸。石碳酸。3、器具：显微镜、镊子、解剖针、接种针、载玻片、器具：显微镜、镊子、解剖针、接种针、载玻片、试管、培养皿试管、培养皿 、 恒温培养箱、高压灭菌锅、滤恒温培养箱、高压灭菌锅、滤纸、三角瓶、水浴锅。纸、三角瓶、水浴锅。四、实验操作流程四、实验操作流程1、菌种活化、
6、菌种活化 ：将：将Lys和和Lys菌株分别接种在完全培养基上，菌株分别接种在完全培养基上，28培养培养5d左右。左右。2、杂交、杂交 ：将两种亲本菌株分生孢子或菌丝接种到杂交培养基：将两种亲本菌株分生孢子或菌丝接种到杂交培养基上，培养上，培养57d，形成黑色子囊果。，形成黑色子囊果。3、子囊果处理：在有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片、子囊果处理：在有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒入三角瓶中，小组集中煮沸，防止孢子飞扬。刻，把水倒入三角瓶中，小组集中煮沸，防止孢子飞扬。4、显微观察：取一载玻片，加、显微观察：取一载玻片，加12滴滴5次氯酸钠，用接种次氯酸钠，用接种环挑出子囊果，
7、放在载玻片上，用另一载玻片盖上，用手环挑出子囊果，放在载玻片上，用另一载玻片盖上，用手指压片，压破子囊果，在低倍镜下观察。指压片，压破子囊果，在低倍镜下观察。五、实验结果与分析五、实验结果与分析1、观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算、观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因与着丝粒距离。基因与着丝粒距离。 2、记录你所观察到的基因转变现象。、记录你所观察到的基因转变现象。思考题：思考题：1 1、用图表示第六种子囊类型的形成。、用图表示第六种子囊类型的形成。2、假设在基因与着丝点之间发生了双交换，你的数据和计算假设在基因与着丝点之间发生了双交换，你的数据和计算
8、结果会发生怎样的偏差？结果会发生怎样的偏差？实验结果实验结果子囊类型子囊类型观察数量观察数量 （5:3） （3:5） （6:2） （2:6） （4:4不正常）不正常）（粪壳菌子囊孢子颜色遗传）粪壳菌子囊孢子颜色遗传）0.060.050.0085:36:2不规则 4:4正常正常 4 : 4 98.825:35:3、3:53:5或或6:26:2、2:62:6或或3:13:1、1:31:3都都属于不规则，属于不规则，说说明减数分裂的明减数分裂的4个个产物中，一个基产物中，一个基因转变为另一等因转变为另一等位基因位基因基因转变现象。 rare exceptions有时出现如图结果有时出现如图结果参考结
9、果参考结果六、注意事项六、注意事项1、菌种活化及杂交要注意无菌操作。、菌种活化及杂交要注意无菌操作。 2、赖氨酸缺陷型接种在完全培养基上生长不好，、赖氨酸缺陷型接种在完全培养基上生长不好，需要加适量赖氨酸。需要加适量赖氨酸。3、杂交后培养温度要控制在、杂交后培养温度要控制在25；30以上抑制以上抑制原子囊果的形成。原子囊果的形成。4、用过的载玻片、镊子和解剖针等物都需放入用过的载玻片、镊子和解剖针等物都需放入5 5的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。 5、注意观察选择的时间、注意观察选择的时间 Lys子囊孢子成熟较迟，当子囊孢子成熟较迟，当Lys子囊孢子已子囊孢子已成熟呈黑色时，成熟呈黑色时， Lys子囊孢子还呈灰色，如果观子囊孢子还呈灰色，如果观察时间过早，所有的子囊孢子都未成熟，全为灰察时间过早，所有的子囊孢子都未成熟，全为灰色；观察过迟，色；观察过迟， Lys子囊孢子也已成熟，全为黑子囊孢子也已成熟，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。色，就不能分清各种子囊类型。6、注意基因转变现象、注意基因转变现象 偶尔观察到偶尔观察到6 2、2 6、5 3、3 5或异常或异常的的4 ：4等分离比，是基因转变造成的。基因转变等分离比，是基因转变造成的。基因转变的频率一般在的频率一般在1%左右。左右。
