1、第一章工具酶工具酶(Enzymes )本章主要内容本章主要内容 限制性内切酶限制性内切酶 甲基化酶甲基化酶 DNA聚合酶聚合酶 其他分子克隆工具酶其他分子克隆工具酶 限制与修饰限制与修饰(restriction an modification) 限制性内切酶识别的序列限制性内切酶识别的序列 限制性内切酶产生的末端限制性内切酶产生的末端 末端长度对切割的影响末端长度对切割的影响 位点偏爱位点偏爱 (site preferences) 酶切反应条件酶切反应条件 星星活性星星活性(star activity) 单链单链DNA的切割的切割1.1 限制性内切酶1.1.1 限制与修饰 50年代初，发现寄主
2、控制的专一性年代初，发现寄主控制的专一性( host controlled specificity)， 噬菌体噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制。它宿主时受到限制。E.coli KE.coli BE.coli C K110-41 B10-411 C10-410-41 说明说明K和和B菌株中存在一种限制系统菌株中存在一种限制系统(restriction system),可排除外来的可排除外来的DNA; 10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果的存活率是由宿主修饰系统作用的结果; 甲基化：甲基化：A N6甲基甲基-腺膘呤腺膘呤 C 5甲基甲基-胞嘧啶胞
3、嘧啶1.1.2 限制性内切酶 1970年年 美国约翰美国约翰霍布金斯大学霍布金斯大学 H.Smith偶然发现流偶然发现流感嗜血杆菌（感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外）能迅速降解外源的噬菌体源的噬菌体DNA(phage DNA),其细胞提取液可降解其细胞提取液可降解E.coli DNA,但不能降解自身但不能降解自身DNA，即，即HindII酶。酶。 识别位点识别位点 5 .G T Py Pu A C. 3 3C A Pu Py T G. 5G T C G A CG T T A A CG T C A A CG T T G A C限制酶的命名限制酶的命名 宿主：
4、宿主： 属名第一字母、种名头两个字母属名第一字母、种名头两个字母 菌株或生物型号菌株或生物型号 序号：序号： 罗马字罗马字 EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT 依据亚单位依据亚单位(subunit)组成、识别序列组成、识别序列(recognition sequence)的种类和是否需要辅助的种类和是否需要辅助因子因子(cofactor)分类；分类； Restriction Enzymes 3744种种 Type I 1%（既修饰又切割）（既修饰又切割） Type II 93%（回文序列）（回文序列） Type IIs 5%（非分文序列）（非分文序列） Type III 1%
5、（识别和切割位点相距较（识别和切割位点相距较远）远）限制修酶的分类限制修酶的分类type II （93%） 识别回文序列识别回文序列(palindromic sequence)， 一般一般4-6bp，但，但有少数酶识别更长的序列或简并序列有少数酶识别更长的序列或简并序列(degenerate sequence)； 在回文序列内部或附近切割，切割位置因酶而异，产在回文序列内部或附近切割，切割位置因酶而异，产生带生带3-OH和和5-P基团的基团的DNA的产物；的产物； 需需Mg2+type IIs （5%） 识别位点识别位点(recognition site)非对称，非对称，4-7bp； 切割位点
6、可能在识别位点一侧切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内；范围内； 与与 type II 具有相同的辅助因子具有相同的辅助因子(cofactor)要求。要求。type I （1%） R酶和酶和M酶，另外还有负责识别酶，另外还有负责识别DNA序列的序列的S亚基，各亚基，各作为一个亚基存在于酶分子中；作为一个亚基存在于酶分子中； 分别由分别由hsdR，hsdM，hsdS基因编码，属于同一操纵子基因编码，属于同一操纵子(operon)（转录单位）；（转录单位）； EcoK，R2M2S； EcoB，R2M4S2 识别位点识别位点(recognition site) EcoB TGA*(N)8TGCT
7、 A* EcoK AA #C (N) 6GTGC A# *甲基化位点；甲基化位点；#可能的甲基化位点可能的甲基化位点 切割位点切割位点1000bp以外，无特异性以外，无特异性typeIII (9090PstI GCTGCAGCTGCACTGCAGTGCA AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20 010900010900 因此，在双酶切多克隆位点因此，在双酶切多克隆位点(multiple cloning site)时，时，选择合适的酶切秩序；选择合适的酶切秩序； 在设计在设计PCR引物引入酶切位点时，应在位点之外引入引物引入酶切位点时，应在位点之外引入所要求的碱基数，一般在末端另
8、加所要求的碱基数，一般在末端另加4个；个； 具体参照具体参照NEB操作手册。操作手册。1.1.6位点偏爱 (site preference) 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割割(preference incistion)； 1975，EcoRI切割切割 phage (Lambda)中的中的5个位点，并个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快割快10倍；倍； 1976，EcoRI在腺病毒在腺病毒2 (adenovirus-2) DNA 中的切割中的切割速率不同。速率不同
9、。1.1.7 酶切反应条件 pH：7.0-7.9 (at 25)，Tris-HCl，乙酸；，乙酸； 离子强度：离子强度： NaCl，高（，高（100mM）、中（）、中（50mM）、低）、低（）；（）； Mg2+ ：10mM MgCl2 or MgAc； DTT (dithiothreitol，二硫苏糖醇，二硫苏糖醇) ：1mM； 100 g/ml BSA，少数需要。，少数需要。每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产品说明书！品说明书！双酶切策略双酶切策略 选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；选用都合适的缓冲液或通用缓冲液； 当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高
10、盐缓冲液（当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）可纯化或不纯化）注意事项注意事项 取少量酶取少量酶 最后加酶、尽快操作最后加酶、尽快操作 减少反应体积减少反应体积 延长反应时间延长反应时间 分装保存分装保存反应温度反应温度 大多数为大多数为37 一部分为一部分为50-65 少数少数25-30反应终止反应终止 EDTA 终浓度终浓度10mM 加热加热 65 （80）20min1.1.8星星活性(star activity) 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性的序列，这个改变的
11、特殊性称星星活性(star activity)； 实际上星星活性实际上星星活性(star activity)是限制性内切酶的一般是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。非典型位点。引起星星活性的因素引起星星活性的因素 高甘油高甘油(glycerin)浓度（浓度（5%） 酶过量（酶过量（100U/ l） 低离子强度（低离子强度（8.0) 有机溶剂：有机溶剂：PMSD(二甲基亚砜二甲基亚砜)、乙醇、乙醇(ethanol)、乙二、乙二醇醇(glycol)、二甲基乙酰胺（、二甲基乙酰胺（dimethylacetamid
12、e）、二）、二甲基甲酰胺甲基甲酰胺dimethylformamide）和）和sulphalane等等 用其它二价阳离子如用其它二价阳离子如Mn+、Cu+ 、Co+或或Zn+代替代替Mg+星星活性的抑制星星活性的抑制 减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到提高离子强度到100150mM(在不抑制酶活性的前提在不抑制酶活性的前提下下) 降低反应降低反应pH至至7.0 使用使用Mg2+作为二价阳离子作为二价阳离子1.1.9单链DNA的切割 HinP1I, HhaI, MnlI，50
13、 HaeIII，10% BstNI, DdeI, HgaI, HinfI, TaqI，1 AluI, BbvI, DpnI, FnuDII, FokI, HpaII, HphI, MobI, MobII, MspI, Sau3AI, SfaNI，不切割不切割1.1.10 影响酶活性的因素 “外因外因”底物的纯度底物的纯度 “内因内因”site preference甲基化甲基化(methylation)底物的构象底物的构象:切割切割cccDNA和和linear DNA时表现的差异，与切割时表现的差异，与切割DNA相比，相比，EcoRI、PstI、SalI 需要至少需要至少5倍的酶来切割倍的酶来切
14、割pBR322的的I型型DNA。1.1.11 酶切位点在基因组中分布的不均一性 基因组中，碱基对的排列是非均匀的，因此尽管基因组中，碱基对的排列是非均匀的，因此尽管GC含含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的。的。 在在E.coli中中,酶切位点出现的平均长度酶切位点出现的平均长度AscI(GGCGCGCC) 20kbNotI(GCGGCCGC) 200kbEcoRI/HindIII 5kbSpeI(ACTAGT) 60kb 细菌基因组细菌基因组(bacteria genome) 在大多数富含在大多数富含A+T的细菌中，的细菌中，CCG
15、和和CGG的排列是最的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少；非常少； 酵母基因组酵母基因组(yeast genome) G+C%为为38%，因此富含，因此富含G+C的识别序列特别少；的识别序列特别少； 哺乳动物哺乳动物G+C为为41%，其中，其中CG的序列比想象的低的序列比想象的低5倍之多，因此倍之多，因此含含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞相当稀少。而且序列的酶切位点在哺乳动物细胞相当稀少。而且在哺乳动物细胞中，大多数在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的。序列是甲基化的。1.2 甲基化酶（Methylase） 真
16、核生物真核生物(eukaryote)和原核生物和原核生物(prokaryote)中存在大中存在大量的甲基化酶；量的甲基化酶； 原核生物的甲基化酶作为修饰系统，保护自身的原核生物的甲基化酶作为修饰系统，保护自身的DNA不被相应的限制酶切割；不被相应的限制酶切割； 大肠杆菌有三种甲基化酶大肠杆菌有三种甲基化酶 Dam甲基化酶甲基化酶 Dcm甲基化酶甲基化酶 EcoK I甲基化酶甲基化酶Dam甲基化酶 识别识别GATC，在腺嘌呤，在腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基(methyl)； PvuII、BamHI、BclI、BglII、XhoII、MboI、Sau3AI的识别位点中含的识别位点中含GATC
17、序列；序列； ClaI(1/4)、XbaI (1/16)、TaqI (1/16)、MboII (1/16)、HphI(1/16)的部分识别序列含的部分识别序列含GATC序列，序列，4个个ClaI位位点点(ATCGATN)中有一个该序列；中有一个该序列； BclI、ClaI、MboI和和XbaI受甲基化影响；受甲基化影响； BamHI、Sau3AI、BglII和和PvuI等不受甲基化影响；等不受甲基化影响； 一般哺乳动物一般哺乳动物DNA，不会在，不会在A-N6上甲基化。上甲基化。Dcm甲基化酶 识别识别CCAGG或或CCTGG序列，在第二个序列，在第二个C上上C5位置上位置上引入甲基；引入甲基
18、； EcoRII /BstNI，CCA(T)GG，二者识别序列相同，但，二者识别序列相同，但切点不同，切点不同，EcoRII受受dcm甲基化作用影响，甲基化作用影响，BstNI可避可避免这一影响；免这一影响； 受影响的酶：受影响的酶： Acc65I、AlwNI、ApaI、EcoRII、 EaeI 不受影响的酶：不受影响的酶： KpnI、BanII、Bg1I、BstNI、NarI EcoKI甲基化酶 识别识别AAC(N)6GTGC, 在在N6位置甲基化位置甲基化 TTG(N)6CACG 识别位点少识别位点少(1/8kb) 研究较少，而研究较少，而dam（1/256bp） dcm(1/512bp)
19、SssI甲基化酶 来自原核生物螺原体（来自原核生物螺原体（Spiroplasma），可在），可在CG序列中序列中的的C在在C5位置上甲基化，又称位置上甲基化，又称CG甲基化酶；甲基化酶； 许多酶对此甲基化敏感，如许多酶对此甲基化敏感，如AatII、ClaI、XhoI、SalI等；等； 不敏感的有不敏感的有BamHI、EcoRI、SphI和和KpnI。甲基化对限制酶切的影响 修饰酶切位点修饰酶切位点 TCGA中的中的A甲基化后，甲基化后，GTCGAC将不受将不受HincII切割；切割； 构建构建DNA文库文库(DNA library)时，用时，用AluI(AGCT)和和Hae(GGCC)部分消化
20、基因组部分消化基因组DNA，用甲基化酶处理，然后，用甲基化酶处理，然后加上合成的加上合成的EcoRI接头，当再用接头，当再用EcoRI来切割时只有接头上的位来切割时只有接头上的位点可被切割。点可被切割。 产生新的酶切位点产生新的酶切位点TCGATCGAAGCTAGCT TaqI TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI1.3 DNA聚合酶 真核真核DNA polymeraseDNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶 原核原核DNA polymerase I：一条多肽链，可催化单链或双链：一条多肽链，可催化单链或双
21、链DNA的延长；的延长； II：一条多肽链，与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；：一条多肽链，与低分子脱氧核苷酸链的延长有关； III：多聚酶，是促进：多聚酶，是促进DNA链延长的主要酶。链延长的主要酶。E.coli DNA polymerase I 53DNA聚合酶活性聚合酶活性 Mg2+ 、dNTP DNApolyI 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性 Mg2+ DNApolyI+ dNTP降解降解RNA:DNA中的中的RNA(RNase H 活性活性) 35外切酶活性外切酶活性 Mg2+ DNApolyI+ dNTPDNA polymerase I的用途的用途 切口平移法切口平移法(nick
22、translation )标记标记DNA Mg2+，低限量，低限量DNase IdNTP，DNA poly I若有放射性若有放射性dNTP，则可标，则可标记成探针记成探针(probe) 用于用于cDNA克隆中的第二链克隆中的第二链即单纯的即单纯的DNA聚合活性，但由于有聚合活性，但由于有5-3外切活性，已外切活性，已不再使用，而改用不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶酶和反转录酶(reverse transcriptase ) 末端标记（末端标记（end labeling）（）（ 交换或置换反应）交换或置换反应） Mg2+, DNApoly I -P32dATPA*TT4 DNA poly
23、T7 DNA poly 更好更好Klenow酶 DNA polymerase I经蛋白酶（经蛋白酶（proteinase)（枯草杆菌蛋（枯草杆菌蛋白酶）裂解白酶）裂解, 从全酶中除去从全酶中除去53外切活性片段，而聚外切活性片段，而聚合活性和合活性和35外切活性不受影响，大小为外切活性不受影响，大小为76kDa ； 通过基因工程也可以构建得到；通过基因工程也可以构建得到； 作用与作用与DNA polymerase I相似。相似。T4 DNA polymerase 来源于来源于T4 phage感染的感染的E.coli， 114kDa； 与与Klenow酶相似，但酶相似，但3- 5外切活性强外切活
24、性强200倍倍; 用途用途补平或标记补平或标记3 凹端，必须有高浓度凹端，必须有高浓度dNTP（末端标记）（末端标记）置换反应：必须有高浓度置换反应：必须有高浓度dNTP(一种一种)末端标记末端标记T7噬菌体DNA聚合酶 来源于来源于T7 phage感染的感染的E.coli,为两种紧密结合的蛋白质为两种紧密结合的蛋白质复合体（噬菌体基因复合体（噬菌体基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白）；蛋白和宿主的硫氧还蛋白）； 与与Klenow酶相似，但酶相似，但3- 5外切活性强外切活性强1000倍倍; T7 DNApoly为持续合成能力最强的一个，产物平均长为持续合成能力最强的一个，产物平均长度要大得多，在测
25、序时具有优势。度要大得多，在测序时具有优势。 用途用途:替代替代T4 DNApoly的功能的功能长模板的引物延伸长模板的引物延伸(primer extension)反转录酶 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 53合成合成DNA，无，无35外切活性；外切活性； 来自禽成髓细胞瘤病毒（来自禽成髓细胞瘤病毒（ AMV ），鼠白血病病毒（），鼠白血病病毒（Mo-MLV）；）； AMV 二链多肽二链多肽(62kDa/94kDa)，同时具很强的，同时具很强的RNase H活性。因此，活性。因此，在反应开始时，引物在反应开始时，引物(primer)和和mRNA模板模板(template)杂交体杂
26、交体可成为可成为RNase H的底物，此时，模板的降解和的底物，此时，模板的降解和cDNA的合成相的合成相竞争；竞争； Mo-MLV单肽，单肽，84kDa，RNase H 活性弱，利于合成较长的活性弱，利于合成较长的cDNA。末端转移酶 来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞来源于小牛胸腺，存在于前淋巴细胞(prolymphocyte)及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚聚合酶；合酶； 在二价阳离子存在下，末端转移酶在二价阳离子存在下，末端转移酶(terminal transferase )催化催化dNTP加于加于DNA分子的分子的3羟基端；羟基端
27、； T or C 首选首选 Co2+ A or G首选首选Mg2+ 底物底物 DNA，可短至，可短至3个核苷酸，个核苷酸，3突出突出 低离子强度时，低离子强度时，5突出或平端突出或平端DNA亦可，但效率低亦可，但效率低 用途用途 在在3端加同聚尾，端加同聚尾，cDNA或载体或载体(vector)，用于克隆，用于克隆(clone)或标记或标记(label) 末端标记末端标记 ddNTP同聚尾的长度同聚尾的长度 37 15min 随时间的延长尾亦长。随时间的延长尾亦长。1.4 其他分子克隆工具酶RNA聚合酶 来源于噬菌体来源于噬菌体(phage)感染宿主后所产生感染宿主后所产生 SP6噬菌体噬菌体
28、RNA聚合酶，来源于感染鼠伤寒沙门氏聚合酶，来源于感染鼠伤寒沙门氏菌菌LT2菌株；菌株； T4或或T7噬菌体噬菌体RNA聚合酶，来源于感染的大肠杆聚合酶，来源于感染的大肠杆菌（菌（E.coli）。）。 活性活性这些这些RNA聚合酶实际上为转录过程中聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，合成的酶，识别识别DNA中特异的启动子序列，并沿此中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板模板起始起始RNA的合成。与的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物聚合酶不同，无需引物(primer)，但识别特异性位点。，但识别特异性位点。RNA聚合酶的用途聚合酶的用途 体外体外(in vitro) 将这些将这些RNA聚
29、合酶特异性的启动子安装在载体中聚合酶特异性的启动子安装在载体中，如，如pGEM-3Z载体载体(2.74kb、p13)中，用于体外转中，用于体外转录外源录外源DNA； 体内体内(in vivo) 将将T7 RNA 聚合酶基因置于聚合酶基因置于 lacUV5 启动子之下，启动子之下，插入到插入到 噬菌体噬菌体DE3中，感染中，感染E.coli，整合于染色体，整合于染色体的的BL21处。将处。将T7噬菌体启动子控制的目的基因噬菌体启动子控制的目的基因 经经质粒导入该宿主菌中，在质粒导入该宿主菌中，在IPTG诱导下，启动外源诱导下，启动外源基因的表达。基因的表达。连接酶(Ligase) T4 DNA
30、ligase 68kDa，T4噬菌体感染大肠杆菌产生噬菌体感染大肠杆菌产生 催化催化DNA 5磷酸基与磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键羟基之间形成磷酸二酯键 底物：底物： DNA or RNA(效率低效率低) 粘端粘端(matched end)、切口、切口(nick)、平端、平端(blunt end) 10% PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，单价阳离子（，单价阳离子（150-200mM NaCl）提高平端连接速率。）提高平端连接速率。 条件条件 164hr；4overnight ， 需需ATP E.coli DNA ligase 与与T4 DNA ligase相似，但需烟酰胺相似，但需烟酰胺-腺嘌
31、呤二核苷腺嘌呤二核苷酸酸(NAD+) 参与；参与； 平端连接效率低，不将平端连接效率低，不将RNA连接到连接到DNA，不连接，不连接RNA。 Taq DNA ligase 连接连接dsDNA中的缺口中的缺口 作用于作用于4565，需，需NAD+ T4 RNA ligase 催化催化ss DNA或或 RNA的的 5-磷酸与磷酸与 3羟基之间形成共羟基之间形成共价连接价连接核酸酶 ( nuclease) BAL 31 核酸酶核酸酶 来源于来源于Alteromonas espejiana BAL31 主要活性为主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链两条链的的3端去除
32、单核苷酸；具有内切核酸酶活性，切除单端去除单核苷酸；具有内切核酸酶活性，切除单链链DNA; 依赖依赖 Ca2+，EDTA可抑制其活性可抑制其活性 用途：从两头缩短用途：从两头缩短DNA (用于缺失突变等）用于缺失突变等）Sl核酸酶核酸酶 来源于米曲霉来源于米曲霉(Aspergillus oryzae) 降解单链降解单链DNA或或RNA 对对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA不敏感不敏感 酶量大可完全消化双链，中等酶量可在切口酶量大可完全消化双链，中等酶量可在切口(nick)或小或小缺口缺口(gap)处切割双链处切割双链 用途：用途： 去掉突出的单链尾，以产生平端去掉突出的单链尾，以产生平端
33、 打开打开dsDNA合成中产生的发荚环合成中产生的发荚环绿豆核酸酶绿豆核酸酶 来源于绿豆芽来源于绿豆芽 与与Sl nuclease 相似，但比相似，但比Sl更温和更温和核糖核酸酶核糖核酸酶A 来源于牛胰，内切核酸酶；来源于牛胰，内切核酸酶； 可特异攻击可特异攻击RNA上嘧啶残基的上嘧啶残基的3端；端； 用途：用途： 除去除去DNA样品中的样品中的RNA 除去除去DNA:RNA中未杂交的中未杂交的RNA区区DNase I 来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解解 ds or ss DNA； Mg2+：独立作用于每条：独立作用于每条DNA链，
34、切割位点随机；链，切割位点随机； Mn2+：两条链的大致同一位置切割：两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端，产生平端 或或1-2个核苷酸突出；个核苷酸突出； 用途：用途： 切口平移切口平移(nick translation)标记，在标记，在dsDNA上随机产生切口上随机产生切口 随机克隆，以便安插在随机克隆，以便安插在M13 phage上测序上测序 分析分析 蛋白蛋白:DNA复合物（复合物（DNA酶足迹法）酶足迹法） 除去除去RNA样品中的样品中的DNA（RNase-free）RNase H 内切核酸酶，特异性水解与内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的杂交的RNA上的磷酸上的磷酸二酯键
35、，产生二酯键，产生3-OH和和5P末端的产物；末端的产物； 不降解单链核酸、不降解单链核酸、dsDNA or dsRNA； 许多酶附带该活性，比如许多酶附带该活性，比如AMV反转录酶；反转录酶； 用途：用途： 在在cDNA克隆，合成第二键之前去除克隆，合成第二键之前去除RNA。RNase One Promega开发，基因工程酶，开发，基因工程酶， 27kDa，可以将，可以将RNA降降解至单核苷酸，可以在任意碱基处内切磷酸二酯键。解至单核苷酸，可以在任意碱基处内切磷酸二酯键。T4多核苷酸激酶 催化催化ATP的的 -磷酸基转移至磷酸基转移至DNA或或 RNA的的 5末端，也末端，也具有具有3磷酸酶
36、活性；磷酸酶活性； 高浓度高浓度ATP发挥最佳活性。发挥最佳活性。NH4+强烈抑制剂；强烈抑制剂； 用途：用途： 用于对缺乏用于对缺乏 5-磷酸的磷酸的 DNA进行磷酸化进行磷酸化(phosphorylation)。以致可用于。以致可用于DNA连接；连接； 交换反应：过量的交换反应：过量的ATP可使该激酶将磷酸化的可使该激酶将磷酸化的5端端磷酸转移给磷酸转移给ADP，然后，然后DNA从从 -32pATP中获得放中获得放射性标记的射性标记的 -磷酸而重新磷酸化。磷酸而重新磷酸化。碱性磷酸酶 种类：种类：牛小肠碱性磷酸酶（牛小肠碱性磷酸酶（CIP，CIAP）细菌碱性磷酸酶（细菌碱性磷酸酶（BAP） 活性：活性：除去除去DNA or RNA 5磷酸磷酸 用途：用途：防止防止DNA片段自身环化片段自身环化标记前（标记前（5端）除端）除5磷酸磷酸
