1、第六章 组 织 工 程Tissue Engineering 组织工程的概念组织工程的概念 应用工程学和生命科学的原理与方法,将在体外培养、扩增的功能相关的活细胞种植于多孔支架上,细胞在支架上增殖、分化,构建生物替代物,然后将之移植到组织病损部位,达到修复、维持或改善损伤组织功能一门科学。种子细胞支架材料讯息因子三要素自体细胞异体细胞和异种细胞干细胞天然高分子天然无机物合成高分子 营养营养生长因子生长因子物理和化学环境物理和化学环境应力和应变应力和应变组织工程细胞的三维培养皮肤组织工程骨组织工程 For PowerPoint 97-2010展示内容展示内容组织工程细胞的三维培养组织工程细胞的三维
2、培养 生长因子生长因子 与细胞培养与细胞培养应力与细胞生长应力与细胞生长支架材料支架材料与细胞粘附与细胞粘附 三维培养三维培养 在体内情况下，多种生长因子都由机体协调作用，因而是一个多因子序在体内情况下，多种生长因子都由机体协调作用，因而是一个多因子序贯作用体系：体外如何模仿实施这一多因子序贯调节是组织工程的重大课贯作用体系：体外如何模仿实施这一多因子序贯调节是组织工程的重大课题。题。 细胞生长与生存微环境的关系；功能细胞与支持细胞的相互关系细胞生长与生存微环境的关系；功能细胞与支持细胞的相互关系 ；功能细胞的；功能细胞的生长繁殖与应力等生长繁殖与应力等物理物理因素的关系；功能细胞与其支持物因
3、素的关系；功能细胞与其支持物ECM的关系；功能的关系；功能细胞的生长繁殖与细胞的生长繁殖与三维空间三维空间的关系的关系生长因子与细胞培养生长因子与细胞培养骨形成蛋白（骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP) 在动物长骨的皮质骨中含量较多在动物长骨的皮质骨中含量较多 诱骨活性：诱导间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞。诱骨活性：诱导间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞。 将将BMP注入软组织，可异位诱导新骨的形成。注入软组织，可异位诱导新骨的形成。 BMP已经成功用于治疗骨折、骨延迟愈合、骨不连接及骨缺损。已经成功用于治疗骨折、骨延迟愈合、骨不连接及骨缺损。表
4、皮生长因子（表皮生长因子（EGF ）与角膜损伤的修复）与角膜损伤的修复 刺激角膜上皮增殖刺激角膜上皮增殖 给兔角膜人为造成损伤，给兔角膜人为造成损伤，EGF滴眼给药可明显加快受创角膜的愈滴眼给药可明显加快受创角膜的愈合。合。成纤维细胞生长因子（成纤维细胞生长因子（FGF)血管内皮细胞生长因子（血管内皮细胞生长因子（ VEGF)胰岛素样生长因子（胰岛素样生长因子（IGF)转化生长因子转化生长因子- (TGF-)应力与细胞生长应力与细胞生长 当材料在外力作用（受力、湿度变化等）下不能产生位移时，它的几何形状和尺寸将发生变化，这种形变称为应变。 材料发生形变时内部产生了大小相等但方向相反的反作用力抵
5、抗外力，定义单位面积上的这种反作用力为应力。切应力切应力 张应力张应力 压应力压应力 拉应力拉应力细胞细胞流体切应力（flow shear stress）：主要指血流对血管壁施加的力。切应力对细胞骨架的影响：切应力作用于体外培养的内皮细胞时，细胞骨架会发生改变，细胞膜内侧出现肌动蛋白纤维，细胞内形成粗而长的应力纤维，并与膜附着。细胞变为长梭形，沿着切应力方向排列。高血压引起血管内皮细胞中应力纤维增加。 微管可能是内皮细胞机械应力刺激作用的靶标，切应力通过它改变内皮细胞的形态、影响细胞的黏附与迁移等功能，从而在血管重建中发挥重要作用。 切应力对照 0.5h 3h12h切应力对内皮细胞微管骨架重构
6、的影响切应力对内皮细胞微管骨架重构的影响张应力（tensile stress）：心脏搏动、肌肉收缩、肌腱和韧带的拉伸、血管充盈时对血管壁的牵拉、呼吸对肺泡的牵张。静态培养构建的组织工程化肌腱虽然有很好的组织学特性，但其抗拉强度始终低于正常肌腱。可能缺乏足够的力学刺激。张应力能够引起细胞骨架重排及细胞形态的变化。张应力张应力大鼠骨髓间充质干细胞加力前后细胞骨架形态变化A. 不加力B. 加力12h后压应力（compressive stress） 人体的所有关节都是由骨性组织构成它的主要部分，关节内侧缘大多受到压应力的影响。拉应力 大脑、脊髓和内脏器官在人体内都呈现悬挂式的，因受到地球引力的作用，它
7、自身的重量就形成了对抗性的拉力，所以受到拉应力的影响，其他的软组织的两端或周边都附着在其他的组织结构上，因此也都受到拉应力的影响。 压应力和拉应力压应力和拉应力细胞对机械应力应答机制细胞对机械应力应答机制 生理条件下，细胞之间相互联系。 二维细胞培养因重力的影响导致细胞间联系失常，无法形成立体的组织和器官。 三维细胞培养即把细胞悬浮在培养液中，但常用的气泡和搅拌器法，对细胞产生破坏性的应力。旋转培养系统细胞和组织绕水平轴建立均质的液体悬浮轨道，从而中和了大部分重力效应，处于微重力状态。细胞受到的剪切力很小。试验发现，离体细胞在RCCS 中呈现高密度聚集,并形成较大的组织样结构。美国宇航局（美国
8、宇航局（NASA）生命中心开发研制）生命中心开发研制旋转式细胞培养系统旋转式细胞培养系统（rotary cell culture system, RCCS）1）固定蛋白质）固定蛋白质2）固定多肽类物质）固定多肽类物质3）固定氨基酸及其衍生）固定氨基酸及其衍生物物 4）固定细胞生长因子）固定细胞生长因子 表面粗糙时，可使细胞表面粗糙时，可使细胞与材料接触的表面积增与材料接触的表面积增加，以促进细胞在材料加，以促进细胞在材料表面的湿润作用，影响表面的湿润作用，影响细胞的粘附强度。细胞的粘附强度。1 ）材料的生物可降解性）材料的生物可降解性 2 ）合成聚合物）合成聚合物 3 ）蛋白质吸附）蛋白质吸附
9、 粘附的最粘附的最适条件与蛋白质在材料表适条件与蛋白质在材料表面的吸附能力有关面的吸附能力有关 . 材料表面材料表面物理性质物理性质材料表面材料表面化学性质化学性质材料表面材料表面几何性质几何性质 材料表面材料表面生物修饰生物修饰细胞与支架材料的粘附细胞与支架材料的粘附 中等湿润度的材料表面粘附性最强；中等湿润度的材料表面粘附性最强；材料表面电荷量影响细胞粘附性，材料表面电荷量影响细胞粘附性，细胞在带正电荷的材料表面上的粘细胞在带正电荷的材料表面上的粘附增加。附增加。RGD可被固有粘附蛋白受体特可被固有粘附蛋白受体特异性结合，在生物材料表面自异性结合，在生物材料表面自发形成一分子层，为与受体介
10、发形成一分子层，为与受体介导的细胞反应提供位点，促进导的细胞反应提供位点，促进细胞粘附、伸展。细胞粘附、伸展。粘附微岛：采用微晶图技术在材料表粘附微岛：采用微晶图技术在材料表面制成具有确定尺寸、形状及图案的面制成具有确定尺寸、形状及图案的粘附粘附三维培养三维培养 组织工程的核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体组织工程的核心：建立由细胞和生物材料构成的三维复合体定义：利用各种方法及材料定义：利用各种方法及材料,使细胞呈空间立体方式生长使细胞呈空间立体方式生长,更接近更接近于体内生长模式于体内生长模式,形成类似体内组织的结构。形成类似体内组织的结构。 细胞三维培养能够为体外培养细胞提供与其组
11、织来源细胞三维培养能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似相似甚至相同的细胞生长微环境甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系和细胞联系, ,从而既有利于各类从而既有利于各类细胞的细胞的分化定向诱导分化定向诱导, ,又有利于细胞分化表型的维持和增殖。又有利于细胞分化表型的维持和增殖。 支架材料的物理线度影支架材料的物理线度影响细胞生长速率，材料响细胞生长速率，材料越厚，生长越慢；支架越厚，生长越慢；支架材料的网孔大小必须适材料的网孔大小必须适当，以便种子细胞易于当，以便种子细胞易于跨越网孔而又不至于引跨越网孔而又不至于引起接触抑制。起接触抑制。 分为静止三维培养和分为静止三维培养和动力性三维培养。动力
12、性三维培养。 用机械或酶消化方法处理组织器用机械或酶消化方法处理组织器官，使细胞在没有明显破损情况官，使细胞在没有明显破损情况下分散为单细胞悬液，进一步分下分散为单细胞悬液，进一步分离所需种子细胞。离所需种子细胞。 三维培养的一般方法三维培养的一般方法For PowerPoint 97-2010种子细胞种子细胞的制备的制备将种子细胞接将种子细胞接种到三维支架种到三维支架细胞外基细胞外基质支架的质支架的制备制备三维培养三维培养 静止性三维细胞培养静止性三维细胞培养 方法方法：把细胞直接种植在把细胞直接种植在三维载体上三维载体上,体外不施加体外不施加任何物理方法下进行的培任何物理方法下进行的培养。
13、养。 由于由于重力作用重力作用,静止培养时细静止培养时细胞多聚集到载体的底部和载胞多聚集到载体的底部和载体之外体之外,载体内部黏附生长的载体内部黏附生长的细胞数量很少细胞数量很少,导致载体内部导致载体内部移植细胞数量的不足。移植细胞数量的不足。 培养液培养液很难扩散很难扩散渗透到载体的中渗透到载体的中心心,氧气、营养物质扩散和代谢氧气、营养物质扩散和代谢物排出受限物排出受限 影响载体内部细胞的代谢活性影响载体内部细胞的代谢活性 能够排出更多的能够排出更多的CO2 ,维维持生理性持生理性pH值值,为细胞代谢为细胞代谢和功能发挥提供更有利的微和功能发挥提供更有利的微环境环境 方法：根据细胞在自然条
14、件下生方法：根据细胞在自然条件下生长受力情况长受力情况,在培养过程中适当应在培养过程中适当应用物理方法。用物理方法。 更多免费更多免费PPTPPT资源及互动请访问资源及互动请访问 我爱我爱 PowerPoint PowerPoint 官方网官方网 http:/iloveppt.org/动力性三维细胞培养动力性三维细胞培养 不仅为细胞生长提供了适宜的不仅为细胞生长提供了适宜的生物性微环境生物性微环境和力学刺激和力学刺激,而且而且能更好地促进细胞功能的发挥。能更好地促进细胞功能的发挥。能够产生有效的、能够产生有效的、均匀均匀的细胞种植的细胞种植,允许允许移植最大数量的细胞移植最大数量的细胞能够促进
15、载体中黏附生长细胞的增殖能够促进载体中黏附生长细胞的增殖,分泌更多细胞外基质分泌更多细胞外基质,促进组织再生促进组织再生能够促进氧气和营养物质向载体能够促进氧气和营养物质向载体内部输送内部输送细胞能够沿着三维载细胞能够沿着三维载体的孔隙生长体的孔隙生长,产生具有产生具有一定几何形状的组织一定几何形状的组织培养液流动培养液流动能够能够对细胞产生机械应对细胞产生机械应力刺激力刺激,调节细胞功调节细胞功能的发挥。能的发挥。模拟微重力环境也可以使细胞克服重力影响更容易贴模拟微重力环境也可以使细胞克服重力影响更容易贴附在微载体表面。附在微载体表面。 细胞在模拟微重力环境中有一定程度的三维空间细胞在模拟微
16、重力环境中有一定程度的三维空间自由，有利于细胞一细胞、细胞一基质之间按组自由，有利于细胞一细胞、细胞一基质之间按组织学特性相互接触，有利于细胞的增殖和分化织学特性相互接触，有利于细胞的增殖和分化 细胞克服重力影响易于聚集，能获得比在普通重力环境中更高细胞克服重力影响易于聚集，能获得比在普通重力环境中更高的细胞培养密度。的细胞培养密度。 低剪切力低剪切力、高效物质交换高效物质交换的条的条件为多种细胞和组织块的生长件为多种细胞和组织块的生长和代谢提供良好的培养环境。和代谢提供良好的培养环境。旋转培养系统（旋转培养系统（RCCSRCCS）重力矢量叠加技术：模拟微重力通过持续在三维空间改变重力矢量，使
17、重力矢量叠加技术：模拟微重力通过持续在三维空间改变重力矢量，使细胞没有足够时间对这种变化作出反应。细胞没有足够时间对这种变化作出反应。 共轴氧合器提供了充分氧合，高效物质交换共轴氧合器提供了充分氧合，高效物质交换能力为高密度细胞培养提供良好的培养环境能力为高密度细胞培养提供良好的培养环境 TEXT “墨汁” 不同类型的人体活细胞悬浮液TEXT “纸张”水凝胶（富含糖类和其他营养物质，能够给生长中的细胞提供营养，且容易去除）TEXT“文章稿件”具备正常功能的人体器官3D 打印机的喷头不仅仅能在平面上移动，还能够垂直移动。它的打印过程像是将一层层剖面图叠加在一起，最后制造出一个立体的结构。三维生物
18、打印机三维生物打印机三维生物打印机的原型机，技术人员正在试验打印程序一、计算机辅助设计出该器官的结构蓝图二、将所需细胞精确“打印”到位三、后期处理促进细胞融合和器官成熟技术步骤打印机有两个喷头，一个喷涂细胞（黄色），另一个喷涂水溶胶（红色）以支持和固定细胞，待细胞结构稳固后可以将水溶胶移除打印机的喷头及其作用器官打印的过程骨组织工程骨组织工程支架材料是骨组织工程的核心！支架材料是骨组织工程的核心！良好的生物相容性可制备成三维立体结构生物可降解性良好的表面活性可塑性支架材料的要求支架材料的要求骨支架材料的分类骨支架材料的分类无机材料无机材料复合材料复合材料纳米材料纳米材料人工合成支架材料天然骨衍
19、生支架材料有机材料有机材料 天然骨天然骨 胶原材料胶原材料 珊瑚骨珊瑚骨无机材料无机材料钙磷生物陶瓷是目前广泛应用的骨替代材料主要成分为钙、磷离子,与骨的无机成分相似,它具有良好的生物相容性和骨传导作用其诱导成骨机制是强烈吸附骨形态发生蛋白(BMP) 、表皮生长因子( EFG) 等骨诱导因子有关。其存在弱点在于其脆性较大,而且单纯HA 不易被吸收,因而限制了其在承重部位的应用。Morishita 等 将骨髓基质干细胞(MSCs) 接种于HA 支架上,植入骨肿瘤切除后的缺损区6 个月后得以修复。Tan 等将自体骨髓与HA 复合后植入到绵羊腰椎融合间隙,3 个月后见植入体新骨形成并与椎体融合。有机
20、材料有机材料以聚乳酸(polylactic acid , PLA) 、聚羟基乙酸( polyglycolic acid ,PGA) 、PGA - PLA 共聚物为代表优点是可降解性,良好的细胞相容性,容易塑形;缺点是降解产物为酸性,对微环境有影响;细胞组织相容性差;机械强度不足;容易引起周围组织非特异性炎症反应和免疫反应。纳米材料最大的特点为高比表面积和孔隙率,有利于细胞接种、迁移和增殖。在骨组织工程支架材料主要是nHAC。有研究者将nHAC 材料负载骨髓基质干细胞修复兔颅骨15 mm 缺损,实验表明修复区无炎症和排异反应,具有良好的组织相容性,8 周时已有较好的新骨组织形成并修复兔的颅骨缺损
21、区。采用提纯并去抗原型胶原为模板,在钙磷盐溶液中调制矿化而获得纳米级复合材料,研究结果表明该新型仿生骨材料具有良好的生物相容性,能够促进和加快骨愈合。复合型材料复合型材料通过一定的方法将几种单一材料复合,综合各种材料优缺点,形成复合型支架材料2006 年Link 等报道,将磷酸钙骨水泥和PL GA 微粒的复合物修复老鼠的颅骨缺损,4 周后扫描电镜及组织学观察有新骨生成,8 周时PL GA 微粒完全降解被新骨取代。Chen 等将聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物( PL GA) 支架浸入适当浓度的胶原溶液中,在PL GA海绵内的孔壁上形成一薄层胶原海绵,可提高材料的亲水性及细胞黏附性。天然骨天然骨 要利
22、用天然骨的无机或有机成分形成的天然网状孔隙系统结构为支架,利于成骨细胞粘附、增殖及发挥成骨作用,并提供宽大的内部空间和表面的微环境。胶原胶原 胶原支架具有良好的生物相容性及适于细胞生长的孔径,易于营养细胞的大分子通过,且移植前可预先塑形,移植过程能保持适当的机械强度,并具有作为细胞生长模板的稳定性,因而可做骨组织工程支架材料。珊瑚骨珊瑚骨 主要成分为碳酸钙 优点：骨传导作用较好,在高孔隙率状况下仍能保持一定的机械强度,优于大多数人工制备的多孔材料 缺点：力学性能较差、降解困难、不易加工。存在问题存在问题支架材料的降解速度与新骨形成速度不协调; 支架材料与机体的免疫排斥反应和炎性反应; 材料的表
23、面活性差,影响种子细胞的黏附、分布和功能发挥; 材料的机械强度与降解速率难以相匹配;材料的生产、存储等没有得到一致公认标准等。组织工程骨的临床运用组织工程骨的临床运用1、组织工程骨修复牙槽突裂 组织工程骨为牙槽突裂骨移植修复提供了较好的骨替代复合物，消除了患者自身骨来源的诸多缺点。2 2、组织工程骨与口腔种植、组织工程骨与口腔种植众所周知，口腔种植中最大的问题在于颌骨骨量不足，影响种植手术的适应证。研究发现，将可吸收的聚合物与成骨细胞的复合物植入猪下颌骨的缺损处，采用三维模式观察骨组织的生长情况，发现新生骨组织在猪下颌骨缺损处生长良好。Schimming 等将下颌骨骨膜分离的成骨细胞种植到高分
24、子聚合物支架上，体外培养2 周后，将成骨细胞聚合物复合体移植到上颌骨骨量不足患者的上颌窦底部，以增加该区域骨质的厚度，术后3 个月形成了足够的新生骨组织，18 例患者中12 例获得了成功。Ueda 等在种植体获得初期稳定性的前提下，将凝血酶凝胶、富血小板浆、及自体骨髓MSCs 构建的可注射组织工程骨注射到种植体骨外部分周围，术后48 个月，种植体骨外部分即被钙化样组织充满。牙槽骨高度平均增加5 mm。X 射线片显示，新生的类骨组织与种植体紧密结合。负载6 个月后，种植体稳定性依然良好，且没有明显的骨丧失。Filho Cerruti 等用同样的材料用于上颌牙槽骨骨量不足的牙种植患者，结果与Ued
25、a 等的报道一致。从以上学者的研究中发现组织工程骨在口腔种植中存在光明的前景，在一定程度上可以扩大口腔种植的适应证，提高种植术后患者的使用效果。3 3、组织工程骨植骨临床应用七年随访结果、组织工程骨植骨临床应用七年随访结果【摘要】目的总结生物衍生组织工程骨植骨I临床应用的中期效果。方法2000年12月一2001年6月，采用同种异体骨膜来源的成骨细胞1106mL与生物衍生骨支架材料构建组织工程骨，经体外培养37 d后，植入修复lO例骨缺损。男6例，女4例；年龄1470岁，中位年龄42。其中骨囊性病变2例，陈旧性骨折不愈合l例，新鲜粉碎性骨折伴骨缺损6例，慢性化脓性骨髓炎l例。每例患者植入生物衍生
26、组织工程骨量315 g，平均73 g。结果10例患者术后伤口均I期愈合。术后获随访7年，除l例于术后1年发生植骨松动外露取出，以及l例并发创伤后肱骨头坏死取出外，其余植骨均在术后3045个月达骨性愈合。x线片检查：除l例患者已行肱骨头切除术外，其余均达到骨愈合，骨皮质连续，重塑良好。患肢功能能满足日常生活及工作需要。结论生物衍生组织工程骨具有良好的成骨能力，临床应用中期效果良好，未见明显排斥反应及并发症。组织工程皮肤应用于各种病理情况外科创面外科创面 l急性切割伤急性切割伤l良恶性肿瘤和胎记等切除良恶性肿瘤和胎记等切除术后创面的修复术后创面的修复l大疤性硬斑病大疤性硬斑病l切除后缺损难以修复的
27、皮肤切除后缺损难以修复的皮肤病（瘢痕、巨痣、太田痣、文病（瘢痕、巨痣、太田痣、文身及一些肿瘤等）身及一些肿瘤等）l大疱性表皮松解症大疱性表皮松解症l光化性紫癜光化性紫癜 皮肤病皮肤病敷料真皮复合皮（包含表皮和真皮）皮肤组织工程临床应用 Biobrane临时性敷料,用来覆盖大面积烧伤创面敷 料允许创面生理性液体蒸发可防止蛋白等大分子物质丢失促进表皮再生减小脓毒血症发生可以有效地减轻疼痛双层膜状物外层 薄的硅胶膜内层 整合有大量的胶原颗粒， 可以迅速与创面紧密贴附AlloDerm烧伤后创面的应急临时性覆盖物敷 料保持真皮层的正常结构免疫组化染色表明基底膜的主要成分-层粘连蛋白仍存在于脱细胞真皮基质
28、表面AlloDerm+表皮层覆盖创面可明显减少伤口收缩真皮人工真皮基质结合成纤维细胞、表皮细胞培养成皮肤替代物，初步临床应用已取得了一定的疗效。国外已有lntegra，AlloDerm，Biobrane, Dermagraft-TM，Dermagraft-TC等人工真皮应用于临床。（都经过FDA验证）复合皮Apligraf系采用异体成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中形成细胞胶原凝胶1998年由年由Organogenesis公司注公司注册生产的册生产的Apligraf是目前最成熟是目前最成熟的的既含有表皮层又含有真皮层既含有表皮层又含有真皮层的组织工程复合皮，其细胞成的组织工程复合皮，其细胞成分均来源
29、于分均来源于新生儿包皮新生儿包皮。1w接种角质形成细胞4d1-2w浸没培养，角质形成细胞融合成片进行气液界面培养,即为产品Apligraf已获美国FDA批准用于治疗糖尿病性溃疡和静脉性溃疡。48 到目前为止，尚无含有血管附件的组织工程皮肤产品问世。因此，组织工程皮肤移植后血管化的机制和时间都与自体皮肤移植不同，导致组织工程皮肤移植后缺血及营养不足。与自体刃厚皮片移植相比，组织工程皮肤产品有以下缺点：移植后长入困难；容易感染；质地较脆弱；愈合时间延长；移植成功率不高；费用较高。可以减少自体供皮区的损伤；可以简化皮肤缺损的外科治疗过程，减少患者的住院时间；可以为无法进行自体皮肤移植的患者植皮；可以减少大面积皮肤缺损的发病率和死亡率；可以对种子细胞进行修饰，实现基因治疗。缺点优点Thank you!
