1、主要内容第一节 食品毒理学实验的原则和局限性食品毒理学实验的原则和局限性 第二节 毒理学毒性评价试验的基本目的毒理学毒性评价试验的基本目的 第三节 实验动物的选择和处理实验动物的选择和处理 第四节 食品毒理学试验设计要点食品毒理学试验设计要点 第五节 实验动物的染毒和处置实验动物的染毒和处置 第六节 体外试验在毒理学中的应用体外试验在毒理学中的应用食品毒理学作为一门实验科学，以动物实验为中心。食品毒理学研究的主要手段是动物实验。食品毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的基本方法。 食品毒理学研究的主要手段是动物、实验。 1. 体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学
2、物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。2.体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。 以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。实验动物种类：常见包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、猫、猴、小型猪、鸡、青蛙、蟾蜍、鱼类等。豚鼠豚鼠：特点是毛短而光滑，生长快，抗病力强，繁殖性能好。广泛用于药物学、传染病学、免疫学、营养学、耳科学等各项医学及生物学的研究中。 SD大鼠大鼠：白色，产仔多，生长发育较Wistar大鼠为快，对疾病的抵抗力尤以呼吸道疾病的抵抗力强。自发肿瘤发生率较低，对性激素感受性高。 BALB/c小鼠小鼠：对致癌因子敏感，对放射性
3、照射极为敏感。生产性能良好，繁殖期长，广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究。 意义: 实验动物是生命科学（生物、医学、食品等）研究的重要基础和支撑条件，在科研、教学、生产、检定、安全评价和成果评定中都离不开实验动物，被称为“活的仪器、活试剂”。英国一位科学家曾这样比喻：“在生命科学研究中使用实验动物就象在分析化学中使用分析天平一样重要”。 落户武汉大学实验动物中心的慰灵碑，旨在纪念在抗非典疫苗和药物实验中为人类健康献身的38只恒河猴第一节 食品毒理学实验的原则和局限性 食品毒理学实验的原则 u 化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人 u 实验动物必须暴露于高剂量 u 成
4、年的健康实验动物(雄性和雌性未孕)和人可能的暴露途径是基本的选择 代表性、可重复性 u 化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人 l 人是最敏感的动物物种；l 人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。l这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。 以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。因此可以利用安全系数来计算人的相对安全剂量。第二个原则是实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应(效应)关系，确定受试化学物
5、引起毒效应及其毒性参数。引起毒效应的最低剂量(LOAEL)与人的暴露剂量接近时，说明该化学物不安全。当该剂量与人的暴露剂量有很大的距离(几十倍，几百倍或以上)，才认为具有一定安全性，此距离越大，安全性越可靠。 第三个原则，成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。不能重复的实验结果是没有任何科学价值的。选用成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。 食品毒理学实验
6、的局限性 用实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性时，会有很大的不确定性 l 实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别 l 高剂量向低剂量外推的不确定性 l 小数量实验动物到大量人群外推的不确定性 l 成年健康动物与不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体之间的易感性不同首先，实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别。 虽然在毒理学实验中通过用两种或两种以上的动物，并尽可能选择与人对毒物反应相似的动物，但要完全避免物种差异是不可能的。而且在动物实验中，可观察到体征(sign)，而没有症状(symptom)。实验动物不能述说涉及主观感
7、觉的毒效应，如疼痛、腹胀、疲乏、头晕、眼花、耳鸣等，这些毒效应就难以或不可能发现。第二，高剂量向低剂量外推的不确定性 在毒理学实验中，为了寻求毒作用的靶器官，并能在相对少量的动物上就能得到剂量-反应或剂量-效应关系，往往选用较大的染毒剂量，这一剂量通常要比人实际接触的剂量大得多。有些化学物在高剂量和低剂量的毒性作用规律并不一定一致，如大剂量下出现的反应有可能是由于化学物在体内超过了机体的代谢能力，这就存在高剂量向低剂量外推的不确定性。 第三，毒理学实验所用动物数量有限，那些发生率很低的毒性反应，在少量动物中难以发现。而化学物一旦进入市场，接触人群往往会很大。这就存在小数量实验动物到大量人群外推
8、的不确定性。四，实验动物一般都是实验室培育的品系，一般选用成年健康动物，反应较单一，而接触人群可以是不同的人种、种族，而且包括年老体弱及患病的个体，在对外源化学物毒性反应的易感性上存在很大差异。第二节 毒理学毒性评价试验的基本目的 包括以下几点： 受试物毒作用的表现和性质 剂量-反应(效应)研究，可以得到该受试物的多种毒性参数 确定毒作用的靶器官 确定损害的可逆性 1. 受试物毒作用的表现和性质。在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的逐项的观察和记录。发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。2. 2. 剂量剂量- -反应反应(
9、 (效应效应) )研究。剂量研究。剂量- -反应反应( (效应效应) )研究是毒性研究是毒性评价和安全性评价的基础。评价和安全性评价的基础。在急性在急性( (致死性致死性) )毒性试验中，应该得到毒性试验中，应该得到LD50LD50（半数致死（半数致死剂量剂量/ /浓度），也可以得到浓度），也可以得到LD01LD01（最小致死剂量或浓度）（最小致死剂量或浓度）和和MTDMTD（最大耐受剂量或浓度）。（最大耐受剂量或浓度）。在急性非致死性毒性试验中，可应该得到急性可观察到在急性非致死性毒性试验中，可应该得到急性可观察到有害作用的最低剂量有害作用的最低剂量(LOAEL)(LOAEL)和未观察到有害
10、作用的剂量和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)(NOAEL)。在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，可得到相应的在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，可得到相应的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量- -反应反应( (效应效应) )研究将为确定受试物是否具有这些特殊毒性提供研究将为确定受试物是否具有这些特殊毒性提供依据。在致畸试验也可得到依据。在致畸试验也可得到LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL；在致突变、；在致突变、致癌试验中，尽管认为是无阈值的，但也可得到表观的致癌试验中，尽管认为是无阈值的，
11、但也可得到表观的LOAELLOAEL和和NOAELNOAEL。3. 确定毒作用的靶器官。确定受试物有害作用的靶器官，是毒理学研究的重要目的，以阐明受试物毒作用的特点，并为进一步的机制研究和毒性防治提供线索。4. 确定损害的可逆性。一旦确认有害作用存在，就应研究停止接触后该损害是否可逆和消失，器官和组织功能是否能恢复，还是像化学致癌作用那样停止接触后损害继续发展？毒性的可逆性关系到对人的危害评价，如果受损的器官组织能够修复并恢复正常功能，则可能接受较高危险性的接触水平。描述性动物毒性实验1、急性致死性毒性实验2、皮肤和眼刺激试验3、致敏试验4、亚急性（重复剂量）毒性试验 5、亚慢性毒性试验 6、
12、慢性毒性试验 7、发育和生殖毒性试验 8、致突变试验急性致死性毒性实验对新化合物首先进行的第一个试验，是使用一种或一种以上的动物，通过一种或一种以上的途径（其中一种途径为经口途径，或其他有意摄入的途径）测定LD50和其他毒效应的试验。最常使用的动物是小鼠和大鼠，但有时也用家兔和狗。受试动物包括雌雄两性成年动物，染毒前往往隔夜禁食。记录一次染毒后14天内动物死亡的数目。除死亡和体重改变外，每天还要观察受试动物的中毒症状、活动状况、行为改变、患病情况、食物利用率等。亚慢性毒性试验染毒期限有时不同，最常采纳的实验期限是90天。最主要目的是确定“无可观察到作用剂量（NOAEL）”，并进一步确认重复染毒
13、情况下，受试物毒作用的特异靶器官。除受试物种的NOAEL外，还可获得“观察到有害作用的最小剂量（LOAEL）”。亚慢性毒性试验一般选择2种动物（大鼠和狗），采用与预定实际接触相一致的染毒途径（常为经口途径）。慢性毒性试验除了实验期限超过3个月以外，长期或慢性毒性试验的进行在其他方面都类似于亚慢性实验。慢性毒性试验染毒期间对啮齿类一般为6个月至2年的时间，对非啮齿类通常为1年甚至更长。染毒持续时间在某种程度上取决于人类实际接触时间。目的是评价化学物的蓄积毒性。致突变试验致突变作用是化学物引起细胞核遗传物质发生改变的能力。这种改变是可以通过细胞分裂传递给下一代细胞的。突变可以发生于两种类型的细胞，
14、产生本质上不同的后果。生殖细胞突变：引起精细胞和卵细胞的DNA损伤，并可通过减数分裂将突变遗传到子代细胞。体细胞突变是指发生在精、卵细胞以外所有其他种类细胞的突变。体细胞突变是不遗传的，但可以通过有丝分裂将遗传缺陷传递给同一组织的其他细胞，也可能引起细胞死亡。第三节 实验动物的选择和处理 1、 实验动物物种的选择 u 基本原则l 选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种l 自然寿命不太长的物种l 易于饲养和实验操作的物种l 经济并易于获得的物种u 目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是啮齿类，另一种是非啮齿类。l 系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗。l
15、豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验。l 兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验。l 遗传毒理学试验多用小鼠，致癌试验常用大鼠和小鼠，致畸试验常用大鼠、小鼠和兔。l 迟发性神经毒性试验常用母鸡。常用实验动物生物学和生理学参数参 数猴狗猫兔大 鼠小 鼠豚 鼠地 鼠成体体重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12寿命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530饲料消耗 (成本g/d)1504001001801051210成体代谢(calkg d)1588080110130600100250体温()38.838.938.639l438l
16、237.438.638.0呼吸频率50202553851609083(次min)(4060)(1030)(2030)(4065)(65110)(80240)(70100)(35130)心率(次min)200100120200328600300450血压 mmHg(收缩舒张)159/127148/100155/10011080130/901207577/50108/77出生体重(g)500700110022001251005-61.5751002.0断乳时体重(g)44005800300010015004050101225035参 数猴狗猫兔大 鼠小 鼠豚 鼠地 鼠妊娠(d)1686363312
17、1206716性周期(d)282215281516454516194动情期(d)12713919301111窝数量136161136911215112断乳年龄(周)16246698343234生殖年龄(月)549106723232生殖期(年)10155104131131生殖季节任何时间春，秋冬季23个月任何时间任何时间任何时间任何时间任何时间所需面积(tf2)*68330.40.40.70.34环境温度()18281828182818281925192519251925血容量(mL/Kg)7579605365807585凝血时间(s)90180120300601460143HCT(红细胞)42
18、45404246414250Hb(gbl)12.516.011.813.614.816.012.412.02、实验动物品系的选择 品系品系(strain) 指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。 实验动物按遗传学控制分类可分为： 近交系：指全同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。如小鼠有津白I、津白、615，DBA1和DBA2，BALB/C，C3H，C57B6J，A和AHe等。 杂交群动物(杂交1代，F1)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。 封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。如
19、昆明种小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD(Sprague-Dauley)大鼠等。 根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。杂交群次之、封闭群较低。不同品系实验动物对外源化学物毒性反应有差别，不同品系实验动物对外源化学物毒性反应有差别，所以毒理学研究要选择适宜的品系，对某种外源所以毒理学研究要选择适宜的品系，对某种外源化学物毒理学系列研究中应固定使用同一品系动化学物毒理学系列研究中应固定使用同一品系动物，以求研究结果的稳定性。物，以求研究结果的稳定性。对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级(或
20、二级以上)的动物 。级 别要 求I 级 级 级IV 级普通动物（Conventional animal, CV），微生物、寄生虫携带性情况不明，但不能带有人畜共患和烈性传染病原体。在开放系统饲养。 清洁动物（Clean animal，CL），除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病 。 无特定病原体动物(specific pathogen free animal,SPF）不带指定的病原微生物和寄生虫，在屏障系统饲养。除级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌，没有致病病原体 。 无菌动物（G Germfree animal,GFermfr
21、ee animal,GFGF）: 无菌剖腹产，在绝对隔离器中养育。在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫.I级：CV (conventional animal)开放系统，普通饲养，大批生产，成本低，是最低级别的实验动物。CV广泛应用于教学、预试验及一些要求不严的短期试验，生物制品生产。严格意义上讲，CV不适合于科学研究。尽管如此，CV祖先来自于无特定病原体动物(SPF)，剖腹产后普通化，即开放饲养。CV在饲料配方，饮水，室内温、湿度、光照、噪声仍应符合国家标准。市售和来历不明的动物为“无证动物”，试验结果不予承认。II级：CL（Clean animal）亲代是SPF
22、或GF，屏障系统饲养。质量控制要求介于CV与SPF之间。国外无此级别，国外一般均采用SPF或GF。国内由于发展水平条件所限，作为一种过渡，暂可作为标准实验动物用于一般的科学研究。屏障系统：空气经过一定的过滤净化，饲养环境保持正压，进入系统的一切物品：饲料、饮水、用具等均需经严格灭菌处理。工作人员进出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。饮水除高压消毒外，还应酸化和过滤净化。III级：SPF (specific pathogen free animal)属健康无病动物，动物质量高，适合长期慢性实验，并能取得可靠实验结果。广泛应用于药学、毒理学、肿瘤学、免疫学、传染病学、多种诊断和疫苗生产，以及生物制
23、品鉴定中。 IV级：GF ( germfree animal)GF: 无菌剖腹产，在绝对隔离器中养育。（塑料薄膜无菌隔离器）应用：应用：在实验动物领域应用；在免疫学方面应用：是研究免疫发生机理与生产高效优质疫苗的最理想动物。用于微生物学研究：研究微生态学的最理想的动物模型。肿瘤学研究：是研究致癌机理，防癌、抗癌药物筛选的理想动物。营养学研究：是研究营养学的良好模型。GF动物不仅用来观察肠道内细菌对代谢的影响，还用于研究限制采食，对寿命，免疫力的影响，无菌动物对诸多营养机理的分析将起到更重要的作用。毒理与药理学研究：最适合于进行慢性毒性实验，适合于新药毒性及安全性评估。在微生态制剂、生物制品、抗
24、菌素试验研究方面具有明显优势。老年医学：无菌动物是最理想的衰老模型，无菌动物寿命明显延长。其次：在放射医学、口腔医学、军事、航天、环境医学等方面都有广泛应用。4、个体选择 u 性别 如果已知不同性别的动物对受试物敏感性不同，应选择敏感的性别。如对性别差异不清楚，则应选用雌雄两种性别。如实验中发现存在性别差异，则应将不同性别动物的实验结果分别统计分析。 u 年龄和体重 在幼年期和老年期，对外源化学物的生物转运和生物转化，靶器官和受体的敏感性均与成年期不同。毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。 u 生理状态 妊娠影响体重及其他指标的检测结果，且性激素对外源化学物代谢转化有影响，应选用未产
25、未孕的雌性动物。u 健康状况 应选用健康动物：发育正常、体形健壮，无外观畸形，被毛浓密、有光泽、顺贴而不蓬乱，行动灵活、反应敏捷，眼睛明亮有神，表皮无溃疡和结痴，天然孔道干净无分泌物等。u为确保选择健康动物，一般在实验前观察57天。对于大鼠和狗的亚慢性和慢性试验，可在实验前采血进行血液学和血液生化学检查，异常的动物应剔除；对狗应常规驱除肠道寄生虫。五、实验动物喂养环境实验动物喂养室室温应控制在（223），家兔可控制在（203），相对湿度30%70%，无对流风。人工昼夜周期，即使动物处于人工调控的12小时白昼(早6点至晚6点)及12小时黑夜(晚6点至次日早6点)，以稳定其生物时间节律。 第四节
26、食品毒理学试验设计要点一、体内毒理学试验设计u 1. 剂量分组 一般至少要设3个剂量组(即高剂量组、中剂量组、低剂量组) 。 高剂量组应出现明确的有害作用，低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用(即相当于NOAEL)，但低剂量组剂量应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量。中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间，应出现轻微的毒性效应(即相当于LOAEL)。 1）急性毒性实验 查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组
27、，再上下各推一到两个剂量组做预试验。每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。 初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log40.6)来划分各组剂量。 一般设置57个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠68只、家兔46只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异，则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。2）亚慢性毒性实验 亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型
28、的损伤。此剂量的确定可参考两个数值，一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此化合物LD50的1/201/5为最高剂量。 化合物亚慢性毒性试验应求出其剂量反应关系，为此，亚慢性试验至少应设计三个染毒剂量组及一个正常动物对照组，必要时再加一个受试化合物的溶剂对照组。最低剂量组的剂量应相当于亚慢性的阈剂量水平或未观察到作用水平，中间剂量组动物以出现轻微中毒效应为度。 3）慢性毒性实验 为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。以求出明确的剂量反应关系
29、。 染毒组剂量的选择可参考三组数据。一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/501/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50 的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。组间剂量差一般以510倍为宜，最低不小于两倍。毒理学试验常用的对照有4种： l 未处理对照组 不
30、施加任何处理因素。 l 阴性(溶剂赋形剂)对照 不给处理因素但给以必须的实验因素(溶剂赋形剂)，以排除此实验因素(溶剂赋形剂)的影响， l 阳性对照 用已知的阳性物(如致突变物)检测试验体系的有效性。阳性对照组最好与受试物用相同的溶剂、染毒途径及采样时间。 l 历史性对照 由本实验室过去多次实验的对照组数据组成，上述三种对照都可构成相应的历史对照。 u 各组动物数 应考虑到统计学的要求。u 试验期限 某些试验(如致畸试验和多代生殖试验)的试验期限是由受试实验动物物种或品系而决定的。而其他毒性试验的期限在某种程度上由定义所决定。 急性毒性是一次或1天内多次染毒观察14天。一般要求计算两周内的总死
31、亡数。对于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率，有些速杀性化合物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础。 亚慢性毒性试验规定为染毒持续至实验动物寿命的10，对大鼠和小鼠为90天，对狗应为1年。一般认为在环境毒理学与食品毒理学中所要求的连续接触为36个月，而在工业毒理学中认为13月即可。 慢性毒性试验致癌试验一般规定为持续至实验动物寿命的大部分。又可分为两类，即规定试验期限的试验，或直到最敏感的组死亡率达到某一水平(通常为80)的试验。 一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而
32、环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。二、体外毒理学试验设计 u 测定受试物溶解性 u 试验最高剂量的推荐 大多数情况下，可溶性受试物的试验上限应该是：(1)对哺乳动物细胞为10mmol/L或5mg/ml。(2)对细菌试验为5mg/平板。 u 代谢活化 常规使用Aroclor 1254（多氯联苯1254）预处理的雄性成年大鼠肝匀浆90000g离心上清液(S9)，及相应的辅因子(NADPH再生系统)。 u 阳性对照 阳性对照的剂量应选择其剂量-反应的直线部分。u 重复 可疑结果则
33、应重复实验，最好改变剂量范围剂量间隔、改变S9浓度或改变实验方法进行重复。 第五节 实验动物的染毒和处置 一、动物实验前的准备u 购进之后，应雌雄分开饲养 u 进行57天的检疫 u 实验动物的标记 l 啮齿动物 染色法 苦味酸(黄色)、品红(红色)的酒精饱和溶液在动物被毛上染色l 啮齿动物 剪耳法 l 狗等大动物 挂牌法 u 分组 按性别、体重顺序编号，随机分组 二、受试物和样品的准备u 了解受试物的纯度、杂质成分、化学结构和理化性质u 检索相似化合物的毒性资料，以作参考u 受试物应一次备齐全部实验的用量 所需受试物总量(ABCD)1.2 式中：A为每组动物数；B为各处理组的剂量之和(如0.1
34、+0.3+1.0mg/kg1.4mg/kg)；C为染毒次数(通常为天)；D为动物的平均体重；1.2为安全因子，防止损耗。u 将受试物制备成一定的剂型 常制备成水溶液、油溶液或混悬液。溶剂或助溶剂应该是无毒的，与受试物不起反应，受试物在溶液中应稳定。l 水溶性受试物 水、等渗盐水 l 水不溶性受试物 溶于或悬浮于适当的有机溶剂中 u 各种染毒途径的最大容积，以受试的实验动物物种或制剂来确定。 一般规定，染毒最大容积为：经口20ml/kg (对空腹动物)；经皮2ml/kg(根据体表面积计算，限于染毒的准确性)；静脉1ml/kg(5分钟以上)；肌肉注射0.5ml/kg(一个部位)；每眼0.01ml；
35、直肠0.5ml/kg；阴道：大鼠0.2m1，兔1ml；吸入2mg/L；鼻：猴或狗每鼻孔0.1ml。 三、染毒途径 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。u经口(胃肠道)染毒 常用有灌胃、喂饲和吞咽胶囊等方式。 l 灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。 l 吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至狗的舌后部，迫使动物咽下。 l 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。 u 经呼吸道染毒 经呼吸道染毒可分为吸入染毒和气管内注入。l 静式吸入染毒：将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。l 动式吸入
36、染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成。又分为整体接触和口鼻接触两种。l 气管内注入：实验动物在麻醉后，将受试物注入气管，使之分布至两肺。 u经皮肤染毒 l 经皮染毒毒性试验 l 皮肤刺激和致敏试验 试验前用机械法(剃毛)或化学法(硫化钠或硫化钡)脱毛。不应损伤脱毛区的表皮，脱毛区面积不大于动物体表面积的1015。 u 注射染毒 注射用药品，应以注射途径染毒，对大小鼠可用静脉注射，对非啮齿类可模拟临床用药途径。 应调整受试物的pH及渗透压，pH应58，最好是等渗溶液。 静脉注射应控制速度。 四、症状观察u 急性毒性试验 应详细地观察动物的中毒症状、发生和发展过程及规律，死亡前症状特点
37、、死亡时间等等。 化合物经口急性毒性分级标准毒性分级小鼠一次经口LD50(mg/kg)大约相当体重70kg人的致死剂量6级，极毒5级，剧毒 4级，中等毒3级，低毒 2级，实际无毒1级，无毒15000稍尝，1050g工业毒物急性毒性分级标准毒性分级小鼠一次经口LD50(mg/kg)小鼠吸入2小时LC50(ppm)兔 经 皮LD50(mg/kg)剧 毒高 毒中 等 毒低 毒微 毒10000500005000u 亚慢性试验观察指标 1、一般性指标 1）.一般综合性观察指标 动物体重 食物利用率 症状 脏器系数 2）.一般化验指标 主要指血象和肝、肾功能的检测，在亚慢性试验中研究外来化合物对实验动物的
38、毒性作用。 2、病理学检查 u慢性试验 其中包括体重、食物摄取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。五、实验动物处死及生物标本采集u 实验动物处死方法 大小鼠可用颈椎脱臼法，然后股动脉放血。兔、豚鼠、狗等一般用股动脉放血处死。u 血液采集 不影响动物生理功能的最大取血量为其总血量(50ml/kg体重)的10。u 尿液采集 大小鼠可用代谢笼，下部有粪尿分离器。 狗可用接尿法或导尿法。 u 病理解剖和标本留取 毒性病理学检查是毒理学试验重要的组成部分，病理学研究有助于确定有害作用和靶器官。l 大体解剖：在实验动物处死后半小时内进行。观
39、察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面。对指定的脏器称重，并计算脏器系数。 l 组织病理学检查：对指定的器官或组织用锋利的刀剪取材，应统一取材部位。组织块一般在10倍体积的10福尔马林中固定，此后常规制片(组织石蜡包埋、切片、HE染色)。应详细记录显微镜下观察到的病变，并做出病理诊断。 第六节 体外试验在毒理学中的应用 体外试验模型(in vitro test)在判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用过程中也起着重要的作用。 原因： 量大 全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。
40、节省时间和经费 动物保护主义运动的兴起 生物技术为毒性试验和研究提供的新方法和工具 一、概述 (一) 分类 依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类： 筛选试验 仅提供决策过程的最初的资料 附加试验 为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料 替代试验 在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验 (二) 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。 基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽。 (三) 体外试验的优缺点 体外毒性试验系统的优点u能控制环境因素u可排除相互作用的系统如免疫系统、
41、神经内分泌系统的影响u每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等u试验间的误差较少u可同时和或反复多次取样u可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等u较为快速和经济u需要较小量的受试化合物u产生较小量的有毒废物u可以利用人体细胞u减少整体动物的使用 其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。 体外毒性试验结果可迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发，减少由资源到产品的投入。 在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。目前主要是将动物试验结果外推至
42、人类，物种间差异为其不确定因素之一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 不足之处：u 体外到体内外推的问题 体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异。另一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素。u 体外毒性试验难以预测慢性毒性 因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 二、体外试验系统(一) 脏器灌流 肝脏灌流 是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流
43、液流速。需指出肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细胞的功能与生存不能维持。 肠灌流 利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中，在几小时之内可维持基本正常的神经肌肉传导。 (二) 脏器切片 肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。 需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交流。 优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易。 不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。 (三) 原代细胞培养 肝细胞原代培养 一般认为，用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与
44、体内试验相符合。 巨噬细胞 可以用于多种体外试验。 淋巴细胞 多用小动脉脾脏分离淋巴细胞或进一步分离T、B淋巴细胞进行免疫毒理研究。 脑细胞 分离的新鲜脑细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其机理。 心肌细胞 用于毒理学研究的报道目前还较少。 (四) 细胞培养 1. 肾细胞 由于肾小管，尤其是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。 2. 胚胎细胞 利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。 人胚主动脉平滑肌细胞 也可作为标本传代培养研究金属的毒理。 (五) 组织匀浆 制备组织匀浆 是用物理学方法使细胞壁破坏，细胞组成成分与细胞
45、间质混合形成混悬液。 利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。 最常使用的是脑匀浆、肝匀浆。 (六) 亚细胞组分 将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效应的机理均十分重要。 细胞膜 红细胞、肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜标本。使用细胞膜可以进行很多的毒理试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。 微粒体(microsome) 尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。 线粒体(mitochondria) 它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。 (七) 酶 外源化学物对机体的毒性效应，往往表现某种或某些酶的活性变化上，即可以利用标志酶活性的变化反映化学物所损伤的靶器官。 在体外毒理学中则主要是定量研究外源化学物对靶酶作用的特征、性质和机理。
