1、辅助生殖PGD与PGS技术2内容概要内容概要植入前遗传学诊断与筛查的概念植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD检测流程检测流程染色体易位携带者的染色体易位携带者的PGD基于全染色体筛查的基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)单基因病单基因病PGD背景介绍背景介绍适应征及技术进展适应征及技术进展临床应用临床应用植入前诊断植入前诊断 植入前遗传植入前遗传学诊断和筛学诊断和筛查的概念查的概念植入前遗传学植入前遗传学诊断的临床应诊断的临床应用用植入前遗传学植入前遗传学筛查的临床应筛查的临床应用用3一、一、植入前遗传学诊断与筛查的概念植入前遗传学诊断与筛查的概念PGD (Preimplantation
2、Genetic Diagnosis)：又称为孕前诊断(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技术对显微活检的胚胎细胞进行染色体异常或遗传性疾病进行诊断，选择正常的胚胎植入。第一部分 植入前遗传学诊断和筛查的概念4第三代试管婴儿？PGD/PGS是以ICSI-ET为基础，结合显微操作技术和分子生物学研究的而发展起来的。5PGDPGD的意义的意义nPGD可在孕前阶段杜绝X-连锁隐性遗传病、染色体病和基因病患儿的妊娠，避免人工流产终止异常妊娠给广大妇女的身心痛苦。n理论上还可减少遗传病在人群中的遗传负荷。nPGD是遗传性病防治的重要手
3、段，是Edwards获诺贝尔奖的理由之一。植入前诊断植入前诊断传统的产前诊断传统的产前诊断6PGDPGD发展历程发展历程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在显微操纵下对兔囊胚进行活检，取出少量滋养外胚层细胞分析染色质来选择雌性胚胎。1990年Handyside报道了世界第一例植入前性别诊断婴儿的出生，开创了产前诊断的新纪元。1994年，Munne用FISH技术，在植入前诊断胚胎染色体非整倍体及性别获得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和单链多态性分析技术，对单细胞进行视网膜母细胞瘤的易感性分析，在植入前确定胚胎未来发生肿瘤的可能性大小，从而为
4、PGD应用于人类胚胎基因表达的研究开辟了崭新的途径。2001年Verlinsky有报道对胚胎进行HLA选型以便于骨髓移植。进一步拓宽了该技术的研究和应用。7u染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等）染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等） 染色体异常的筛查染色体异常的筛查u单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等）单基因异常的筛查单基因异常的筛查 PGDPGD期望解决的问题期望解决的问题89 植入前遗传学筛查的概念植入前遗传学筛查的概念u胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入着
5、床之前，对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，通过一次性检测胚胎23对染色体的结构和数目，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率，降低多胎妊娠。uPGS目前特指针对染色体数目异常，即非整倍体；uPGS理论上将来可以应用于单基因病。uPGS是低风险人群，夫妻双方的染色体或者基因是正常的。10二、二、PGDPGD检测流程检测流程卵子精子ICSI活检取样胚胎冷冻遗传学检测选择胚胎胚胎植入遗传咨询知情谈话FISHCHIPPCRMPSIVF临床促排卵11极体活检活检第一极体和第二极体，检测母源性的染色体结构异常或基因突变，以及减数分裂异常造成的染色体非整倍体。优点：对卵母细
6、胞的发育没有影响。 缺点：只能检测母源性的染色体异常； 不能检测受精后发生的染色体异常； 可检测细胞数少，易发生检测失败。（一）活检技术选择12卵裂球活检 在D3胚胎发育到6-10细胞时活检出1-2个卵裂球，进行遗传学诊断。 优点：最成熟最常用的活检方法。 缺点：活检出卵裂球后降低了胚胎的发育潜能； 细胞数少，容易发生检测失败(细胞固定及 杂交失败，扩增失败，ADO等)。 13囊胚活检 D5-6天胚胎发育到囊胚阶段后，活检囊胚滋养层细胞进行遗传学检测。 优点：对滋养层细胞的活检不影响将要发育成胎 儿的内细胞团的发育； 可检测细胞数较多，检测失败概率降低。 对SNP-array而言，能大大减低费
7、用。 缺点：大部分情况下（除非可以在24小时之内出结果） 需将活检后的囊胚冷冻保存。 14染色体易位(Translocation):一种染色体结构异常，一条染色体的一段转移到同一条或另一条染色体上，导致易位片段基因的重排 (Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010)易位是一种常见的染色体结构重排异常，新生儿中发病率0.2%.(Stern et al., 1999)临床上两种类型的易位最常见：罗氏易位和相互易位一、染色体易位携带者的一、染色体易位携带者的FISH-PGDFISH-PGD第二部分 植入前遗传学诊断的临床应用15相互易位：两条非同源染色体
8、之间进行片段的交换，常常是整个末端的断裂并互换。- Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010着丝粒着丝粒Derivative chromosome 4Derivative chromosome 2016罗氏易位：这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体 (D组 and G 组, 染色体13-15, 21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失-Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010CentromereCentromereChr21Chr14der(14;21)17
9、易位携带者的健康风险 平衡的染色体易位个体往往没有明显的疾病表型，称为“易位携带者”。但却多存在生殖的障碍； 易位携带者主要的遗传风险起源于配子减数分裂的过程，携带者可产生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以导致流产，出生染色体异常患儿引起出生缺陷（特别是智力障碍），并可导致不孕和不育；18平衡易位携带者的遗传风险平衡易位携带者的遗传风险四射体对于相互易位携带者，配子分离模式理论上产生18种配子类型：包括1种正常, 1种平衡易位型 和16 种不平衡分离的配子。19normalbalanceddisomy 21disomy 21nullisomy 21Nullisomy 14罗氏易位产生6种配子
10、类型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4种不平衡分离配子，这类不平衡配子往往导致流产。罗氏易位的遗传风险罗氏易位的遗传风险20染色体易位和生殖健康反复流产： 3-4%的反复流产患者存在染色体结构异常 相互易位占 61%罗氏易位占 16% - Clifford et al. 1994; Franssen et al. 2005我院数据：共发现1425 易位携带者，其中相互易位 76.6% (1094/1428)，罗氏易位 23.4% (334/1428).反复流产 75.2% (1071/1425)严重男性因素 17.2% (245/1425)卵巢功能下降1.2% (18/1425) 21PG
11、D用于易位携带者治疗的历史 产前诊断移植以来被有效的用来避免染色体异常患儿出现，但是诊断异常后流产给妇女带来心理和生理的负担，并可能导致生育障碍； 第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色体特异性DNA扩增技术成功对人胚胎性别进行诊断并获得妊娠。- Handyside, AH. Nature,1990 1998年，FISH技术被用于易位携带者的PGD诊断并获得成功 - Conn CM et al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998 22荧光原位杂交(FISH)荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridizatio
12、n, FISH）是以利用荧光标记的特定基因或染色体片段作为探针，与染色体特定序列DNA分子杂交，可以确定分裂细胞或间期细胞对应染色体序列的位置及数目，以此检测染色体数目或结构异常。FISH技术有以下几个特点： 安全、快速、灵敏度高； 探针能较长时间保存； 多色标记，简单直观； 可用于中期染色体及间期细胞的分析23荧光原位杂交(FISH-PGD)技术流程24欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南25ESHRE要求： 实验室胚胎活检技术； 遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求； 选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；欧洲生殖与胚
13、胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南26细胞核玻片固定程序：活检卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋养层细胞(TE)；低渗液滴中处理5min；在圆圈标记对应的玻片正面部位加固定剂(Tween-20/HC1)，将低渗好的细胞转至固定剂液滴中；待固定剂完全干燥后，可放在-20备用，或者直接进入下一步；60烤片，30min-3h；RNase消化，蜡膜封片，湿盒中37度孵育30min-1h；将RNase处理后的玻片依次过2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脱水；将玻片放入变性液中，75预变性3-5min（目的是将DNA双链打开）；玻片依次过75%、90%、100%酒精梯度脱水，2min
14、/浓度，完全风干；探针75变性5min；将探针加到风干的玻片样本上，双层蜡膜封片，置于湿盒中，37过夜（杂交4-6h）；玻片依次过洗涤液WS1三缸(45)，WS2两缸（室温），WS3一缸（室温）；75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干；加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南27平衡易位探针选择和淋巴细胞预实验探针的选择：商业探针的使用需通过QC质控；自制探针也需要进行合适的QC/QA鉴定。所有探针在应用到临床检测前都需经过细胞杂交预实验，评估特异性、亮度及弥散度；对于所有平衡易位携带者，需要取用对应易位区段合适的探
15、针以及探针组合对夫妻双方淋巴细胞中期分裂相及间期核进行预实验检测： 至少分析20个中期分裂相，确保探针位置在正确的染色体上，易位片段能被正确指示； 至少分析100个间期核，评估特异性、亮度及弥散度。欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) -FISH-PGD实践指南着丝粒探针位点特异性探针亚端粒探针28一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGDFISH-PGD举例：平衡易位携带者举例：平衡易位携带者预实验结果：外周血淋巴细胞培养
16、制备的一个中期分裂相和一个间期核FISH探针：易位片段的亚端粒探针（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10号着丝粒片段的着丝粒探针（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。29一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。FISH-PGDFISH-PGD举例：平衡易位携带者举例
17、：平衡易位携带者FISH-PGDFISH-PGD检测结果：检测结果：不同通道滤光片下观察到的细胞核中的FISH探针荧光信号。a胚胎细胞核中每个探针均为2个杂交信号提示每个探针位点均为2个拷贝，表示易位相关的染色体组成为正常或平衡易位。b胚胎核中均为1个红色信号、3个绿色信号和2白色信号，分别提示6号易位片段为一个拷贝、10号易位片段为3个拷贝和10号着丝粒片段为2个拷贝，表示该胚胎为临近-1分离形成的6q136qter单体和10p1510pter三体不平衡产物。临近-1分离模式图302006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果正常或平衡易位胚胎比例低，尤其是相互易位312
18、006-2011 年我院易位携带者进行d3 FISH-PGD结果32单卵裂球单卵裂球FISHFISH几种风险可能导致没有准确结果几种风险可能导致没有准确结果：杂交背景干扰太强的情况杂交杂质信号干扰的情况杂交失败未见信号的情况固定或重杂交细胞核丢失的情况囊胚FISH相对卵裂期FISH更有优势？1.活检细胞数的增多有利于信号的判定；2.直观方便检出胚胎嵌合体。33囊胚囊胚FISH-PGDFISH-PGD举例：平衡易位举例：平衡易位34FISH面临的挑战35不同实验室不同实验室FISH检出率和准检出率和准确率波动较大确率波动较大着床率和妊娠率随着着床率和妊娠率随着FISH检检测错误率的上升而降低测错
19、误率的上升而降低36FISHFISH技术局限技术局限FISH技术仅能检测有限的染色体，因此患者经FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未检测的非整倍体异常妊娠而引发的早期流产或出生缺陷。FISH-PGD早期流产胚胎进行比较基因组杂交检测，检出5号染色体重复。需要全染色体筛查为基础的PGD技术？37二、基于全染色体筛查的二、基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS)PGD(PGD-CCS)PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了，避免了FISH仅能检测少数染仅能检测少数染色体的限制，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行色体的限制
20、，采用全染色体筛查的方式对易位或倒位携带者进行PGD诊断，同诊断，同时排除其它染色体非整倍体异常。时排除其它染色体非整倍体异常。38易位携带者的SNP-PGD临床情况总结1. 囊胚+SNP活检分析增加PGD诊断的准确性2. 基于基于SNP的的PGD-CCS可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产可以检测出除易位染色体外其他染色体的异常，减少流产39易位携带者SNP-PGD的临床结局总结40共分析共分析360 个患者年龄在个患者年龄在2044岁之间，平均新发生异常的几率是岁之间，平均新发生异常的几率是27.2% Age是否是否SNP-PGD需要用于每个易位携带者需要用于每个易位携带者?
21、41Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 40种代谢疾病，可覆盖大规模人群建立国家和地区发病率数据库 确认诊断疾病，特别是稀有疾病疾病亚型分类，或鉴别相似表型的不同疾病，进行有效干预 拯救婴儿生命，使他们更健康减少对社会和家庭带来的负担减少出生缺陷指导意义指导意义Next Generation Sequencing(NGS)43NGS-PGD/PGS技术路线WGASNParray检测NGS检测平行实验已知样本非整倍体单个胚胎干细胞正常核型淋巴细胞FISH-PGD诊断为异常的胚胎重活检淋巴细胞全基因组扩增获
22、得产物临床并行实验SNParray检测NGS检测建立平台评估检出率，准确度等指标，芯片与测序相当44方法学的建立2X 测序深度能覆盖60%人类基因组，10X深度能覆盖90%人类基因组。等位基因脱扣ADO率约5-20%；平均值为4%，近着丝粒区段发生ADO率相对较高。碱基对检出误差：C:GT:A.Before & after GC bias correction专为单细胞测序 CNV 分析而设置的算法，矫正WGA产生的GC偏差，使结果更接近基因组DNA测序水平。 45NGS vs SNParray 在非整倍体与16M缺失重复的比较方法学的建立46技术特点 高通量，高准确度：使用新一代测序技术，克
23、服PCR技术通量低的缺点。 不容易产生漏检：可对所有23对染色体进行检测。FISH技术由于每一轮杂交的探针数目是有限的，无法对所有23对染色体进行检测，容易产生漏检。 自动化程度高：测序数据通过SOAP比对，SegSeq软件进行分析47我们前期已建立了FISH、SNP芯片技术检测染色体异常，并与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。2012年8月诞生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女婴。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作48三、单基因病PGD49ESHRE PGD工作组对扩增基础的PGD的最佳实践指南 50单基因病PGD的流程 1. 预备实验 1.1 基因诊断 1.2 设计个性化方案
24、 1.3 构建单体型 1.4 基因组水平实验 1.5 淋巴细胞/废弃胚胎细胞水平实验 2. 临床实验 2.1 临床前预备实验 2.2 临床诊断 3. 产前诊断511 1、等位基因脱扣（allele dropout, ADOallele dropout, ADO） 影响PGDPGD准确性的主要因素之一，其发生率约为5-20%5-20%。可导致胚胎的误诊。导致ADOADO的原因目前仍未充分弄清。解决办法： 采用多重PCRPCR的方法，加入标记位点的检测； 控制扩增片段大小(40%aneuploid cells 25%aneuploid cells 25-40%aneuploid cells FIS
25、H reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp. 110, 2013真正会影真正会影响到移植响到移植风险的嵌风险的嵌合胚胎发合胚胎发生率
26、仅为生率仅为5%.因为绝大因为绝大多数非整多数非整倍体异常倍体异常在内细胞在内细胞团与滋养团与滋养层中共同层中共同发生。发生。而在滋养而在滋养层细胞中层细胞中可能嵌合可能嵌合存在更多存在更多异常。异常。嵌合对PGS诊断的影响70如何理解卵裂期活检的影响（Timelapse分析） 正常卵裂球的移除进一步影响胚胎发育的潜能 异常卵裂球的存在影响胚胎的正常诊断71囊胚活检有替代卵裂期活检的趋势作者认为：卵裂球活检仍相对更加损伤胚胎，临床结局显示囊胚活检应是最为合适的植入前遗传学检测的活检时期。Fertil Steril. 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.
27、fertnstert.2013.07.004.72极体活检风险最低的活检方法极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测技术的进步，如极体活检对胚胎没有损伤，随着极体染色体检测技术的进步，如更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来更精确而且便宜的测序技术的应用，极体活检将成为未来PGD/PGS中一项非常有前景的技术。中一项非常有前景的技术。 73讨论：极体活检vs囊胚活检？避免嵌合的影响避免嵌合的影响不影响未来的胚胎不影响未来的胚胎仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错仅检测减数分裂错误而未评估有丝分裂错误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误误，而有丝分裂可能修复减数分裂错误 能分析来自父母
28、双方的异常能分析来自父母双方的异常嵌合嵌合(滋养外胚层可能不能代表内细胞团滋养外胚层可能不能代表内细胞团) 囊胚培养和玻璃化囊胚培养和玻璃化冷冻冷冻美国的Nathan Treff 代表与欧洲的Joep Geraedts达成了许多共识：极体活检与囊胚活检各有优势，不再建议进行卵裂期活检74Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475早年PGS尝试：利用动物MII卵构建人卵裂球分裂相技术难度大，构建成功率低，无法实现临床应用。全染色体组筛查技术75全染色体组筛查技术FISH: 9-11条条chr所有23对人染色体都需要筛查CGH-比较基因组杂交比较
29、基因组杂交aCGH: 基因组杂交芯片基因组杂交芯片Microarray SNP RealTime PCRNext Generation Sequencing76全染色体筛查技术进展1996 Sermon K., et al. Adaptation of the primer extension preamplification (PEP) reaction for preimplantation diagnosis: single blastomere analysis using short PEP protocols. Mol Hum Reprod. 1996; 2(3):209-212.
30、 (最早用最早用全基因组扩增法进行全基因组扩增法进行PGD，但仅筛查几个基因，但仅筛查几个基因)1999 Wells D., et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 27:1214-1218. (首次使用单细胞首次使用单细胞mCGH做做PGS)2005 Knijnenburg J., et al. Rapid detection of genomic imbalances using m
31、icro-array consisting of pooled BACs covering all human chromosome arms. Nucleic Acids Res. 2005;12(33):e159. (首次用首次用aCGH做做PGS)2007 Treff NR., et al. Accurate 23 chromosome aneuploidy screening in human blastomeres using single nucleotide polymorphism (SNP) microarray. Fertil Steril, 2007;86:s217. (
32、首次用首次用SNParray做做PGS)2013 Eric J. Forman, et al.Comprehensive chromosome screening alters traditional morphology-based embryo selection:a prospective study of 100 consecutive cycles of planned fresh euploid blastocyst transfer (首次用首次用qPCR做做PGS)2013 Chunlei Zhang,et al.A Single Cell Level Based Method
33、 for Copy Number Variation Analysis by Low Coverage Massively Parallel Sequencing (首次用首次用NGS做做PGS)Pubmed总体能够搜索到2881篇文献，自2002年至今，每年平均有176篇，称增长趋势77PGS适应证-高龄78PGS适应证-反复植入失败反复植入失败反复植入失败：2003年Wilton等人将单细胞CGH应用到反复植入失败（Recurrent Implantation Failure,RIF）患者的PGS中，对比应用CGH与FISH两种平台，发现单细胞CGH-PGS的植入率与妊娠率均高于FISH。
34、2007年Voullaire等人对28名反复失败女性采用CGH筛查胚胎非整倍体，发现存在高比例的染色体异常。2014年最新研究Basile等人结合arrayCGH及Timelaps形态学分析反复植入失败患者125个周期504枚胚胎，认为随着胚胎发育动力的逐渐减弱，染色体正常胚胎逐渐减少。79反复流产 2012年最新文献Hodes等人统计了多中心反复流产(recurrent pregnancy loss,RPL) 患者共2282个胚胎，经aCGH平台进行PGS后排出了60%的非整倍体胚胎，正常胚胎植入率55%(移植周期)，植入成功后继续妊娠率达到92%，流产率降至6.9%，而对照组平均流产率在2
35、3%左右。 Hodes-Wertz B,et al.Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos.Fertil Steril. 2012 Sep;98(3):675-80.80对于一般患者Geoffrey Sher, et al. Genetic analysis of human embryos by metaphase comparative genomic hybridization (mCGH) improves efficiency of IVF by increasing embryo
36、implantation rate and reducing multiple pregnancies and spontaneous miscarriages. Fertility and Sterility 2009;92(6).8135岁，优质患者，单囊胚移植的随机研究，aCGH筛选囊胚后明显提高妊娠率。82“until results of RCTs using a different biopsy stage and arrays can demonstrate a significant increase in delivery rates, there is no evidence that routine PGS is beneficial for patients with advanced maternal age”
