1、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定1.提取生物大分子的基本思路是，选用一定的提取生物大分子的基本思路是，选用一定的物理或化学物理或化学方法方法分离具有分离具有不同物理或化学性质不同物理或化学性质的生物大分子。提取的生物大分子。提取DNA就是就是利用利用DNA与与RNA、蛋白质蛋白质、脂质脂质等理化性质的差异去除杂蛋等理化性质的差异去除杂蛋白。白。2.DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶液中溶解度不同溶解度不同，因此可以选择因此可以选择适当盐浓度适当盐浓度使使DNA充分溶解，使充分溶解，使杂质杂质沉淀，或沉淀，或者相反以达到分离的目的。者相反以达到分离的
2、目的。进一步分离进一步分离DNA和蛋白和蛋白质，可利用质，可利用DNA不溶于不溶于酒精，某些蛋白质酒精，某些蛋白质溶于溶于酒精的原理。酒精的原理。3. 蛋白酶能水解蛋白酶能水解蛋白质蛋白质,但对但对DNA无影响无影响；多数蛋白质不能忍受；多数蛋白质不能忍受6080 的高温，而的高温，而DNA在在80 以上才会变性。洗涤剂能瓦以上才会变性。洗涤剂能瓦解解细胞膜细胞膜，但对，但对DNA没有影响。在没有影响。在沸水浴沸水浴条件下，条件下，DNA遇二遇二苯胺会被苯胺会被染染成成蓝色蓝色。 4. DNA粗提取与鉴定，四个主要的实验步骤：粗提取与鉴定，四个主要的实验步骤： 步骤步骤 目的目的实验材料的选取
3、实验材料的选取鸡血鸡血细胞细胞 DNA丰富丰富破碎细胞破碎细胞 获取含获取含DNA的滤液的滤液去除滤液中的杂质去除滤液中的杂质 纯化纯化DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定 鉴定鉴定DNA5. 选取实验材料，原则上凡是选取实验材料，原则上凡是含有含有DNA的生物材料都可以考虑，的生物材料都可以考虑，为提高实验的成功率要选用为提高实验的成功率要选用DNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，的生物组织，如如鸡血细胞鸡血细胞、洋葱洋葱等。破碎动物细胞常用等。破碎动物细胞常用蒸馏水蒸馏水，用玻璃棒用玻璃棒搅拌搅拌后收集滤液。破碎植物细胞需先用后收集滤液。破碎植物细胞需先用洗涤剂、食盐洗涤剂、食盐，再进
4、，再进行充分的行充分的搅拌和研磨搅拌和研磨，过滤后，过滤后收集滤液。收集滤液。6. 破碎细胞后获取的滤液可能含有破碎细胞后获取的滤液可能含有核蛋白核蛋白、RNA、多糖多糖等杂等杂质。可根据质。可根据DNA的不同性质除去这些杂质：的不同性质除去这些杂质： 方法方法原理原理操作操作NaCl溶液分离法溶液分离法酶解分离法酶解分离法高温变性分离法高温变性分离法DNA与蛋白质等杂与蛋白质等杂质在质在不同浓度不同浓度NaCl溶液溶液中的溶解度不同中的溶解度不同2mol/LNaCl溶液溶液溶溶解解DNA0.14mol/LNaCl溶液溶液析出析出DNA蛋白质蛋白质酶酶分解蛋白分解蛋白质质不影响不影响DNA滤液
5、中加嫩肉粉滤液中加嫩肉粉（木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 ）1015min蛋白质蛋白质在在6080大多大多变性变性DNA80 以上以上变性变性6075 保温保温1015min7.进一步提纯进一步提纯DNA并使其析出可用体积分数并使其析出可用体积分数95%、冷却冷却的酒精，然后用玻璃棒的酒精，然后用玻璃棒沿一个方向沿一个方向搅拌，搅拌，卷起卷起丝状物丝状物，滤纸吸去上面的水分，鉴定，滤纸吸去上面的水分，鉴定DNA用用二苯胺二苯胺试剂。对照组的操作是：试剂。对照组的操作是：2mol/L的的NaCl溶液溶液5ml,加入加入4ml二苯胺二苯胺，沸水浴，沸水浴5min，冷却后试管颜色：冷却后试管颜色：无色无色。8
6、. 注意：鸡血中加注意：鸡血中加3g柠檬酸钠柠檬酸钠防止血液凝固；防止血液凝固；加洗涤剂后要加洗涤剂后要轻缓柔和轻缓柔和，否则容易产生，否则容易产生大量泡大量泡沫沫；玻璃棒搅拌要；玻璃棒搅拌要轻缓轻缓以免以免加剧加剧DNA分子断裂，分子断裂，不能形成絮状沉淀不能形成絮状沉淀；二苯胺要；二苯胺要现配先用现配先用，否则，否则会影响鉴定效果；提取器具最好用会影响鉴定效果；提取器具最好用塑料烧杯塑料烧杯，因为因为DNA容易被容易被玻璃器皿玻璃器皿吸附。吸附。血红蛋白血红蛋白的的提取提取和和分离分离1.从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常用的方法有从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常用的方法有酶
7、解法酶解法、超声波法超声波法、研磨法研磨法。分离不同种类蛋白质的依据。分离不同种类蛋白质的依据是蛋白质各种特性的是蛋白质各种特性的差异差异，如分子的，如分子的形态和大小形态和大小，所带电，所带电荷的荷的性质和多少性质和多少、溶解度溶解度、吸附性质吸附性质和对其他分子的和对其他分子的亲和亲和力力等。等。2.凝胶色谱法又叫凝胶色谱法又叫分配色谱法分配色谱法。是根据。是根据相对分子量大小相对分子量大小分离分离蛋白质的有效方法。构成凝胶球体的成分大多数是蛋白质的有效方法。构成凝胶球体的成分大多数是多糖类多糖类化合物化合物，球体内部有许多贯穿的，球体内部有许多贯穿的通道通道，小分子蛋白质因，小分子蛋白质
8、因易易进入凝胶内部的通道进入凝胶内部的通道，路程，路程较长较长，移动速度，移动速度较慢较慢，后从层，后从层析液中洗脱出来，大分子蛋白质析液中洗脱出来，大分子蛋白质无法进入凝胶内部，只在无法进入凝胶内部，只在凝胶珠间隙移动，路程较短凝胶珠间隙移动，路程较短，所以首先洗脱出来。，所以首先洗脱出来。红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白（90）四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2. 血液有哪些成分？血液有哪些成分？ 1. 用用鸡的红细胞鸡的红细胞提取提取DNA，用用哺乳动物的红细胞哺乳动物的红细胞提取提取血红蛋白血红蛋白的的原因原因是什么？是什么？ 鸡的红细胞具有鸡的红细胞具有细胞核细胞核，含有
9、，含有DNA，便于进行便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 可选用可选用猪猪、牛牛、羊羊或或其他脊椎其他脊椎 动物动物的血液来分离的血液来分离血红蛋白。血红蛋白。 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤次数不可过少。 1、采集血样。、采集血样。2、低速短时间低速短时间离心（
10、速度越高和时离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）到分离的效果）3、吸取血浆吸取血浆：上层透明的黄色血浆。：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化的氯化钠钠溶液洗涤。溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6、重复重复4、5步骤步骤三次三次，直至上清液中已，直至上清液中已没有黄色没有黄色，表明，表明洗涤干洗涤干净净。初次离心后的结果3次洗涤后的结果 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置
11、于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分钟分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白。血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离心将搅拌好混合液转移到离心管内，以管内，以2000r/min的速度离心的速度离心10 min。第第1层（最上层）：层（最上层）：甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2层（中上层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固白色薄层固体体）；第）；第3层（中下层）：血红蛋白的层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4层层（最下层）：杂质沉淀层（最下层）：杂质沉淀层（暗
12、红色暗红色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的层的红色透明液体红色透明液体。 取取1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pH为为7.0），透析），透析12小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。缓冲液能够抵制外界缓冲液能够抵制外界酸和碱酸和碱对溶液对溶液pH的影响，维的影响，维持持pH基本不变基本不变。它通常由。它通常由12种缓冲
13、剂制成，这样种缓冲剂制成，这样可以在实验条件下准确模拟可以在实验条件下准确模拟生物体内天然环境生物体内天然环境。利用透析袋透析 取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨两端需用砂纸磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆覆盖尼龙网，再用盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离面，否则难以铺实尼龙网，还会导致
14、液体残留，蛋白质分离不彻底。不彻底。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上将上述三者按相应位置组装成一个整体述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。装配好的凝胶柱1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。与凝胶面
15、平齐，关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。 加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 小心加入小心加入pH=7.0 的的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流待红色
16、的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每出液，每5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白
17、分离蛋白质分离蛋白质 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决于它取决于它所带所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加可以在凝胶中加入入SDS 。由几条肽链组成。由几条肽链组成的的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDS的作用下会的作用下会，因此测定的结果只是因此测定的结果只是。SDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成，SDS所带负电荷的量所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子大大超过了蛋白质分子。因而掩盖了因而掩盖了，使电泳迁，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。移率完全取决于分子的大小。蛋白质的提取和分离一般分为蛋白质的提取和分离一般分为4步：步：样品处理样品处理、粗分粗分离离、纯化纯化和和纯度鉴定纯度鉴定。后三步的方法依次是：。后三步的方法依次是：透透析析、凝胶色谱法凝胶色谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。
