1、 第七章第七章生物质谱生物质谱(BioMS) 质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(/值)的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。 生物质谱是通过电离源将蛋白质或多肽、核酸、多糖等分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(/值)的生物大分子的离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定已知或未知生物大分子。20世纪60年代 科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽的结构分析中存在的潜力，但由于离子化技术的限制，近30年来，质谱技术只在有机化合物小分子的结构测定中得到应用，而
2、对于大分子(分子量超过1000Da)、极性分子和难气化的分子，则显得无能为力。70年代 Macfarlane等人发明了一种被称作等离子体解吸(Plasma desorption, PD)的离子化技术，使得质谱测定分子量范围扩大到几千道尔顿。 80年代初 Barber等人又引入了快原子轰击(fast atom bombardment，FAB)电离技术，并成功地测定了一个26肽的结构，从而使得质谱技术应用于蛋白质与多肽的结构测定这一设想变为现实。80年代末 两种更新的技术得到发展，John Fenn 发明的电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)和Hillenkamp等
3、人发明的基质辅助激光解吸电离(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)。 解决了极性大、热不稳定强极性、热不稳定性和难挥发性的生物大分子的离子化和大分子量的测定问题，生物质谱 (BioMS)从而发展起来。 BioMS具有准确、快速、灵敏度高等特点，因此在生物大分子领域得到了广泛应用。第二节第二节生物质谱技术介绍生物质谱技术介绍 质荷比质荷比: : 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.峰峰: : 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度离子丰度: : 检测器检测到的离子信号强度
4、.基峰基峰: : 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子片离子；多电荷离子；同位素离子一一质谱仪组成质谱仪组成二二离子源离子源三三质量分析器质量分析器四四检测器检测器五五串联质谱及联用技术串联质谱及联用技术 质谱仪至少由以下四部分组成：进样系统进样系统按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源离子源用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器质量分析器利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等）的作
5、用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器检测器用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。计算机数据计算机数据处理系统处理系统真空系统真空系统 加速区加速区进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器 Sample inletIonisation sourceIon separationDetectorOutput离子源的功能离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方硬电离方法法，而给样
6、品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于不稳定或易电离的样品。 离子源是质谱仪的心脏，可以将离子源看作是比较高级的反应器，其中样品发生一系列的特征降解反应，分解作用在很短时间(1s)内发生，所以可以快速获得质谱。 电子轰击电离电子轰击电离 Electron Impact Ionization，EI化学离子化化学离子化 Chemical Ionization，CI场电离，场解吸场电离，场解吸 Field Ionization FD， Field Desorption FD快原子轰击快原子轰击 Fast Atom Bombardment，FAB电喷雾电离电喷雾电离 Electrospra
7、y Ionization，ESI基质辅助激光解析电离基质辅助激光解析电离 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI大气压化学电离大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI 根据不同的离子化方法，常用的适用于蛋白质、多肽研究的质谱技术方法包括FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中又以MALDI-TOF-MS和ESI-MS应用最为广泛，这两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而导致了新的软件和检测器的发展。 直到80年代FAB质谱问世，质谱技术才真正推
8、广到蛋白质领域。 它是一种用快速原子轰击被分散在高沸点溶剂(如甘油)中的待测化合物，从而产生分子离子。快原子的产生是通过电离隋性气体Ar、Xe或He产生的Ar+、Xe+或He +被电场加速，从而具有较大动能，以后通过Ar气室进行电荷交换反应： Ar+（高动能的）+ Ar（热运动的）Ar（高动能的）+ Ar+（热运动的） 经电荷交换后的低动能(热)的Ar+被偏转出快原子流，获得高动能快速的Ar原子对样品分子进行轰击，一般样品调在甘油基质之中，当快原子束轰击在涂有样品的金属板上，快原子大量动能以各种方式消散，其中的一些能量导致样品的挥发和离解。 方法要求简单，灵敏较高。FAB产生的分子离子非常稳定
9、，不易裂解，是准确测定多肽化合物分子量的有效方法。应用于一些较复杂的混合物，能测出其各组份的分子量。当然由于不易获得碎片峰，FAB质谱在测定多肽顺序时遇到困难。 电喷雾离子化技术电喷雾离子化技术（electrospray ionization ，ESI）利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子。ESI 可以与液相色谱、高效液相色谱、毛细管IEF 以及毛细管电泳等多种进样器联用。流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘 。 ESI 一般分为正离子ESI 和负离子ESI 两类。 正离子正离子ESI 的原理的原理：在一个金属喷嘴的针尖上加有2.56 kV高电压，经强电场作用，样品溶液从针
10、尖小孔喷出，成为一个个带正电的液滴。在迎面吹来的热氮气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩解(库仑爆炸)，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。 负离子ESI 的过程与此类似，唯电性相反。RayleighLimitReached+-+-+-+-Evaporation+Charged Droplets 试样离子准分子离子Analyte Ions Solvent Ion ClustersSalts/Ion pairsNeutrals+-其他离子这
11、种分子离子特点是分子离子往往带多个电荷。这些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离子谱上会观察到(M+nH) n+或(M-nH) n-的峰。对于生物大分子，在ESI谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值。实际上从一组峰上可算出无数个分子量值，它们相互之间会略有差别，一般需在计算机上经特定的程序处理（去卷积），找出最接近实际的分子量值。 优点：优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题，并可用于研究DNA 与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用
12、。缺点：缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。基质辅助的激光解析电离基质辅助的激光解析电离(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)技术产生的离子常用飞行时间(time-off-flight,TOF)检测器来检测，所以MALDI名字常与TOF联在一起，即叫基质辅助的激光解析飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MS)。简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(m/z) 来对该多肽进行分析，以判
13、断该多肽源自哪一个蛋白。 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品此激活产生的能量作用于多肽
14、，使之由固态样品混合物变成气态。混合物变成气态。 由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOF mass analyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配。对于一些分子量较大(1000000Da)或疏水性强的蛋白质，MALDI比ESI更有效。MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样
15、品都能用MALDI进行分析。MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，且灵敏度也比别的离子化方式高。ESI和MALDI这两种“软电离”技术解决了极性大、热不稳定的蛋白质的离子化和大分子生物的分子质量的测定问题。而且，这两种方法在灵敏度、准确度和分析混合物的复杂性方面都比以前的质谱技术有了显著的改善，Yes0.005%-0.01%to 50 kDA0.02%-0.03%to 150 kDA150 kDALow tolerance (20 mM) for nonvolatile buffers, alkali metal salts, detergents; online LC-MS us
16、ed for contaminant removal ESINo0.01%-0.05%to 25 kDA0.05%-0.3%to 300 kDA350 kDAHigh tolerance (50 mM) for alkali metalsalts, phosphate, urea, etc.; tolerant of somenonionic detergents; intolerant of SDS MALDICompatible withon-line LC/CE-MSMass assignmentaccuracyMW rangeTolerance for buffers, salts,
17、and detergents Ionization method生物质谱两种主要电离方法比较质量分析器质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离，用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围（质量范围）和分辨率。 扇形磁分析器 四极杆分析器 离子阱分析器 飞行时间分析器 傅里叶变换分析器不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产生不同的偏转，从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径，通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口的离子，从而实现离子的空间分离，形成质谱。 离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压（DC）和一
18、个射频电压（RF）作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），通过施加适当电压就可以形成一个势能阱（离子阱）。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。 有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，
19、质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m/z值。与传统质量分析器相比，更易得到高分辨率和高测量精度；速度快，离子飞行时间仅为几个s和约100s之间；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器。 在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来
20、越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。其优点为分辨率很高，质荷比可以精确到千分之一道尔顿。具有特定m/z 值的离子通过质量分析器打在检测器上，在检测器上产生的放大电流可以作为时间函数用来测定离子强度（丰度）和m/z。离子源产生的离子的相对强度可以由检测器测量，其结果通常以m/z 值作为横坐标、离子相对丰度为纵坐标的形式表示。质谱一般可以用两种形式表示，一种是以规一化（nomalized）的或者相对丰度（%RA）的形式来表述，另一种是以总离子流的百分数（%TIC）来描述。在
21、规一化的质谱中，最高的峰（largest peak）（例如最丰富的离子，并不一定是所要研究的分析物）被称为基峰（base peak），其高度规定为100单位，谱中的其他峰的相对高度都根据这个峰进行规一化，一次它们的相对高度就介于0100单位之间。两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。 最简单的串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器（MS1）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（MS2）分析结果。 MS1MS2MS/MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系。根据MS1和MS2的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可
22、以查明不同质量数离子间的关系。最常用的就是将一级质谱的分子离子(图谱称MS1)和惰性原子再一次轰击低能碰撞诱导断裂，low-energy collision-induced dissociation，CID或称碰撞辅助断裂，col1isionally assisted dissociation，CAD)，从而获得一张碎片图谱(MS2)。 三级四级质谱仪四种MS/MS工作方式色谱可作为质谱的样品导入装置，并对样品进行初步分离纯化，因此色谱/质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间，质谱可给出化合物的分子量和结构信息，故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。
23、气相色谱的流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级，开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用，现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。液相色谱/质谱联用的接口前已论及，主要用于分析GC/MS不能分析，或热稳定性差，强极性和高分子量的物质，如生物样品（药物与其代谢产物）和生物大分子（肽、蛋白、核酸和多糖）。 在蛋白测序方面，LC-MS/MS得到了广泛的应用。 毛细管电泳/质谱联用（CE/MS） 芯片/质谱联用（Chip/MS） 超临界流体色谱/质谱联用（SFC/MS）等离子体发射光谱/质谱联用（I
24、CP/MS） 用于蛋白质、核酸和糖类药物用于蛋白质、核酸和糖类药物的结构分析及相关定量分析。的结构分析及相关定量分析。一分子量的测定二蛋白质、多肽纯度的鉴定三肽质量指纹谱四肽序列测定技术 五蛋白质的翻译后修饰鉴定六其他蛋白质鉴定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达0.10.01，这远比其它方法(如SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）精确。正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋
25、白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。 测定方法分子量非还原 SDS - PAGE26. 2kDa (二硫键未打开) 还原 SDS - PAGE29kDa (二硫键被还原) HPGFC24. 5kDa ESI - MS30298Da 天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da 。90年，发现结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉的分子量。 -苦瓜子蛋
26、白的一级结构计算(包括糖部分)的分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定的分子量为29074Da，二者相差82Da。这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误。-苦瓜子蛋白其C 端用羧肽酶的方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定。苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分离，得到含有C 端的一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442.9非常相符，因此也就证明了C 端59个氨基酸残基的顺序是正确的。 根据质谱测定分子量
27、的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处。 实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即有二个C末端，一个多一个Ala (即247个氨基酸残基)，一个少一个Ala(即246个氨基酸残基)，用ESI-MS完全能够分辨出来 实例2： 猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在猪胰岛素B链的第30位为Ala(89.09Da)，而人胰岛素相应的位置为Thr(119.12Da)，两者相差30Da（如图）。这些差异用其他方法是很难检出的。 肽质量指纹谱+基于串联质
28、谱多肽测序 蛋白质鉴定 由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构) 不同， 蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异， 肽混合物质量数亦具特征性， 称为肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint, PMF) ， 可用于蛋白质的鉴定。 PMF 流程 MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的质谱仪，肽混合物不需分离可直接分析，基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐，仪器灵敏度高，标准样品1 pmol 的量就足够，质量数准确度可达0.1 0.01 ，且操作简单，分析速度快，依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。蓖麻毒素(ricin) 利用MALDI-TOF生物质谱技术结合肽质
29、量指纹谱方法，经过数据库检索，建立了鉴定检测Ricin的新方法 。MALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为62925 DaRicin的肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰 将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索，检索参数如表1所示。返回前5个检索结果，如表2所示。其中符合要求的结果(置信区间为得分大于66分)只有一种蛋白即蓖麻毒素: Ricin precursor ( P02879， RICI_RICCO) ，得分107，匹配肽段13条，肽谱的实验值与理论值的对比见表3，其余未检出的肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属。 两种经典测
30、序方法： DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题； Edman 降解不能解决N端封闭的测序的问题。 使用少量链终止剂，进行快速分步降解，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基 ； 用MALDI-TOF-MS读出肽段信息。 用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基。研究N-端封闭的肽和蛋白，必须了解其C-端序列的信息。使用串联质谱，利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂。 用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的肽段送入一级质谱，产生前体
31、离子，经过一定选择的前体离子在碰撞室发生CID。结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y 型和b 型等离子。获得CID二级质谱图后可算出肽序列。经过经过MS/MS分析的多肽片段分析的多肽片段 胸腺肽1中文名：胸腺肽1英文名：Thymosin 1结构式：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH(HOAc)n 仪器：4700 ABI Proteomics Analyze
32、r测试条件：离子化方式：MALDITOFTOF 检测方式：正离子 质量扫描范围：m/z 50-5000 MATRIX：CHCA COCH3NCHHCH2OHCONCHHCH2CO2HCONCHHCH3CONCHHCH3CONCHHCHH3CCH3CONCHHCH2CO2HCHNCOHCH2OHCHNCOHCHHOCH3CHNCOHCH2CH2CO2HCHNCOHCH2OHCHNCOHCHCH3HOCHNCOHCHCH2CH3CH3CONCHHCHOHCH3CONCHHCH2CH2CH2CH2NH2CONCHHCH2CH2CH2CH2NH2CONCHHCH2CH2CO2HCONCHHCH2CO2
33、HCONCHHCH2CHH3CCH3CHNCOHCH2CH2CH2CH2NH2CHNCOHCH2CH2CO2HCHNCOHCHH3CCH3CHNCOHCHH3CCH3CHNCOHHOCNCHCH2CH2CH2CH2NH2CH2CH2CO2HCONCHHCH2CH2CO2HCONCHHCH3CONCHHCH2CH2CO2HCONCHHCH2CO2NH2CO2Hn(CH3COOH).249927022905310833113514Mass (m /z)2000.40102030405060708090100% Intensity4700 Reflector Sp ec #1 MCBP = 3108
34、.3, 20003107.353090.913086.03092.83099.63106.43113.23120.0Mass (m /z)2000.40102030405060708090100% Intensity4700 Reflector Spec #1 MCBP = 3108.3, 20003108.353109.353107.353110.363111.363091.913092.893090.913112.353093.913113.363094.873089.9571.0714.81358.62002.42646.23290.0Mass (m /z)1409.4010203040
35、5060708090100% Intensity4700 MS/MS Precursor 3107.5 Spec #1 MCBP = 102.3, 1409102.34387.121544.653107.201563.54129.10316.102507.03486.171527.631659.672490.032318.9584.082061.831989.832418.001431.581888.801642.663090.221804.68702.222102.892390.973093.111174.471972.822646.061770.751414.581552.76771.23
36、601.182847.852085.88230.132500.33446.191571.69954.501915.73742.362171.92586.282862.851083.522304.891283.582474.6072.081535.72357.161954.83756.381809.64240.123103.96871.391668.08520.131069.512311.002146.972758.921455.612629.031289.422444.961994.70672.263057.721619.59926.44298.14800.401091.15413.15185
37、.08541.192673.7388.03657.223130.0571.0714.81358.62002.42646.23290.0Mass (m/z)549.30102030405060708090100% Intensity4700 MS/MS Precursor 3107.5 Spec #1 MC=SM11BP = 387.1, 549Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN-OHb4(+1),KEK(+1),EKK(+1),KKE(+1),AVDT(+1),TSSE(+1) - 18y13(+1),AAVDTSSEITTKDLK(+1) - 173107.17b
38、15(+1)2507.01E,a1(+1)b3(+1),VDT(+1),EIT(+1) - 28,ITT(+1)b1(+1)y22 - 17(+1),DTSSEITTKDLKEKKEVVEEAE(+1)b16 - 18(+1),b16 - 17(+1),y14(+1),VDTSSEITTKDLKEK(+1) - 17,DAAVDTSSEITTKDLK(+1) - 172318.932189.8884.07m - Ay17(+1)2417.97b17 - 18(+1),VDTSSEITTKDLKEKK(+1) - 17,DAAVDTSSEITTKDLKE(+1) - 18a22(+1)2102.
39、87b7(+1),TSSEITT(+1) - 18b21 - 18(+1),b21 - 17(+1),y20 - 17(+1)1552.741974.76b8 - 18(+1)2406.002774.952622.02TK(+1),KE(+1) - 28,EK(+1) - 28,KK(+1) - 28,EE(+1) - 28,DAA(+1) - 28TSSEITTKDLKEKK(+1) - 182171.912845.922304.872520.99KDL(+1),DLK(+1),KEV(+1),DAAV(+1),AAVD(+1)1645.552175.761938.28LKEKKEVVEE(
40、+1)1796.48y27(+1)V2387.922607.853118.84EIT(+1),TKD(+1)2213.921585.461979.92b7 - 18(+1)b25 - 17(+1)DTSSEITTKD(+1)1766.302358.881421.24m - V,y28(+1)2533.05b6 - 18(+1)2875.041260.381039.002735.71852.383011.88VD(+1) - 18,IT(+1) - 18D646.34 MS/MS质谱测序可对N 端封闭的肽进行测序; 并可以通过CID 得到部分至完全的序列信息后，做出MS 肽谱，这可对修饰的氨基酸
41、残基定性，并确证其位置，包括二硫键的分布。而且质谱技术与分离技术直接相连也可相互验证，同时还可对混合肽进行测序。另外它还有快速、灵敏的优点。获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质：肽序列标签鉴定方法（peptide sequence tag，PST：从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻 ；肽碎片离子搜索：直接用前体离子产生的未解析的CID 图谱与数据库中的CID 图谱比较，如Sequest、Mascot、Sonat 等算法；从头测序法（de novo sequence），通过直接解释MS/MS
42、数据识别肽序列，这类系统和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。 先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解， 胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜热菌蛋白酶( thermo lysin) SV8 酶( staphylococcusaureusV8)各种酶解片段用HPLC 等分离得到的纯肽或简单的混合肽， 可用MS/MS 测定其各组分的顺序，然后从不同蛋白水解酶酶解片段顺序，找到其重叠部分，即可得到整个蛋白质顺序。磷酸化修饰 糖基化修饰巯基和二硫键定位 氨基的乙酰化 泛素化修饰 已知的磷酰氨基酸的类型有四种： 1O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。 2
43、N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。 3乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。 4S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。 分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用。 常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC) ；抗体免疫沉淀；化学修饰 。 MALDI-TOF-MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理
44、相结合可以确定磷酸化位点。 原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。 串联质谱(MS/MS) 进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。 原理：磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”。 串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4 (98 u)的肽段。 LC-MS/MS分析磷酸化位点 傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 蛋白质糖基化可分为4类: N
45、-糖基化 O-糖基化 C-甘露糖化 聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor) 糖基化糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相对分子质量ESI串联质谱MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位点糖肽片段 先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在这个序列中必含有糖基化位点，由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点。用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较，就能直接表述
46、糖链的平均质量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示。 应用ESI，对PMF中的肽片段进行分析，可以得到蛋白某中间片段的序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白的氨基酸序列加以证实。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。 常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、消除麦克尔加成反应。 基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGase F 酶法、Endo H 酶法、-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法。原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱的准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定。这在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途。原理：由于泛素的C 末端是Arg-Gly-Gly 结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly 留在被修饰蛋白质的肽链上，使肽段质量增加114 ，起到质量标记泛素化位点的作用，进而通过串联质谱鉴定泛素化位点。 乙酰化甲基化脂基化谷胱甘肽化蛋白质的折叠抗原决定部位指认蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金属之间的作用细胞和病毒分析等 药物代谢鉴定
