1、兽医微生物学兽医微生物学第一节第一节 病毒概述病毒概述第二节第二节 病毒的形态与结构病毒的形态与结构第三节第三节 病毒的增殖病毒的增殖第四节第四节 病毒的致病机理病毒的致病机理第五节第五节 病毒的鉴定病毒的鉴定第六节第六节 噬菌体和亚病毒噬菌体和亚病毒第二章 病毒学基础第一节第一节 病毒概述病毒概述一一. 人们对病毒的认识过程人们对病毒的认识过程二二. 病毒的概念和特点病毒的概念和特点三三. 病毒与其他微生物的区别病毒与其他微生物的区别一、一、人们对病毒的认识过程人们对病毒的认识过程18921892：俄国：俄国 伊万诺夫斯基伊万诺夫斯基 首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过首次发现烟草花叶病毒
2、的感染因子能通过 细菌过滤器。细菌过滤器。18981898：荷兰：荷兰 贝哲林克贝哲林克 证实该致病因子可以被乙醇从悬液中证实该致病因子可以被乙醇从悬液中沉淀沉淀 下来而不失去其感染性但用培养细菌的方法培养下来而不失去其感染性但用培养细菌的方法培养 不出来；给这样的病原体起名叫不出来；给这样的病原体起名叫virusvirus。19351935：美国：美国 斯坛莱斯坛莱 从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，又证实又证实 了结晶中含核酸和蛋白质两种成分，而只有核了结晶中含核酸和蛋白质两种成分，而只有核酸具酸具 感染和复制能力，并因此而获得诺贝尔奖。感染和复制能力
3、，并因此而获得诺贝尔奖。19521952：HersheyHershey和和ChaseChase证实噬菌体的遗传物质仅仅是证实噬菌体的遗传物质仅仅是DNA,DNA, 开创了病毒分子生物学。开创了病毒分子生物学。19711971后：后： 陆续发现了各种亚病毒陆续发现了各种亚病毒类病毒、朊病毒和拟病毒类病毒、朊病毒和拟病毒。二、病毒的概念和特点二、病毒的概念和特点(一)病毒的概念： 是指一类体积极小、结构简单、只有一种核酸类型、只能在活的敏感细胞内进行复制方式增殖的非细胞型微生物。(二二) 病毒的特点病毒的特点：1. 体积微小，能通过细菌滤器，需用EM才能观察到；2. 结构简单，不具有细胞形态，属非
4、细胞型微生物；3. 主要成分为蛋白质和核酸，且只有一种核酸：RNA或DNA；4. 专性寄生，依靠宿主细胞的合成系统进行增殖；5. 离体时能以无生命状态存在，可保持其感染性；6. 对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感。三、病毒与其他微生物的比较 敏感性微生物种类 结构在无活细胞的培养基中生长二等分裂繁殖核酸类型 核糖体抗生素 干扰素细菌原核细胞型+D N A ， R N A+-支原体原核细胞型+D N A ， R N A+-立克次体 原核细胞型-+D N A ， R N A+-衣原体原核细胞型-+D N A ， R N A+-螺旋体原核细胞型-（ +）+D N A ， R N A+-真菌真核细胞型+
5、出 芽 、 产 生 孢 子 D N A ， R N A+-病毒非细胞型-D N A或R N A-+本节学习要点： 1. 病毒的概念。 2. 病毒的特点。 3. 病毒与其他微生物的区别。一一. . 病毒的大小病毒的大小二二. . 病毒的形态病毒的形态三三. . 病毒的结构病毒的结构四四. . 病毒的组分病毒的组分第二节第二节 病毒的形态与结构病毒的形态与结构第二节第二节 病毒的形态与结构病毒的形态与结构测定大小的单位是纳米（109)多数病毒的直径在100nm以下；绝大多数病毒是能通过细菌滤器；须用电镜才能观察到其具体形态和大小。一、病毒的大小一、病毒的大小 150nm 大型病毒（最大300 nm
6、） 如疱疹病毒、痘病毒等二、病毒的形态二、病毒的形态 病毒粒子的形态多种多样，其中以球形或近球形多见，也有杆状、丝状、弹状、砖形及蝌蚪形等。Sizes and Shapes of Viruses (Animal RNA Viruses)小RNA病毒 呼肠孤病毒 披膜病毒 正粘病毒冠状病毒 副粘病毒 逆转录病毒 弹状病毒Sizes and Shapes of Viruses (Animal DNA Viruses) 乳多空病毒 腺病毒 疱疹病毒HIVHSVTMV病毒大小与形态的研究方法(1)电子显微镜法 超薄切片或直接负染，电镜下观察其形态并测量其大小；(2)超滤膜过滤法 通过不同孔径的滤膜过滤
7、，可估计病毒的大小；(3)超速离心法 通过超速离心，测得其沉降系数，可计算病毒大小；(4)电离辐射与X线衍射法 主要用于研究病毒粒子的亚单位结构等。三、病毒的结构三、病毒的结构基本结构辅助结构病毒核芯(core)衣壳(capsid)核衣壳(nucleocapsid)囊膜或包膜(membrane or envelope)其他辅助结构，如腺病毒衣壳上触 须样纤维( (一一) )病毒的基本结构病毒的基本结构Enveloped Viruscapsidcapsid corecoreenvelopespikespikeNaked VirusNaked VirusCapsomere or capsomerT
8、ransmission Electron Micrograph of HIV-1 The nucleocapsid (arrows) can be seen within the envelope. ( (二二) )病毒的对称性病毒的对称性三类典型形态的三类典型形态的病毒：病毒： 廿面体对称廿面体对称的的结构结构( (球状球状) ) 螺旋对称螺旋对称的结构的结构( (杆状杆状) ) 复合对称复合对称的结构的结构( (蝌蚪状蝌蚪状) ) 五邻体六邻体二十面体对称型病毒(1)二十面体对称型病毒(2)Tobacco Mosaic Virus螺旋对称型病毒(1)DNA或RNA壳粒螺旋对称型病毒(2)T
9、4 Bacteriophage复合对称型病毒四、病毒的组分四、病毒的组分 病毒的主要成分为核酸病毒的主要成分为核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)和蛋白质；有的病毒还和蛋白质；有的病毒还含有脂质、糖类等其他组分。含有脂质、糖类等其他组分。1. 病毒的核酸一种病毒只含有一种核酸（一种病毒只含有一种核酸（DNA或或RNA）。）。 植物病毒绝大多数含植物病毒绝大多数含DNA;少数含少数含RNA； 动物病毒一部分含动物病毒一部分含DNA，一部分含，一部分含RNA； 细菌病毒普遍含细菌病毒普遍含DNA，含，含RNA的极少。的极少。病毒的核酸类型极为多样化：病毒的核酸类型极为多样化： 病毒的病毒的DN
10、A与与RNA均有单链和双链：均有单链和双链： dsDNA或或ssDNA dsRNA或或ssRNA 病毒病毒DNA分子有线装和环状之分。分子有线装和环状之分。病毒核酸还有正链（）和负链（病毒核酸还有正链（）和负链（）的区分：）的区分： 规定：将碱基序列与规定：将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定位正链，将一致的核酸单链定位正链，将碱基序列与碱基序列与mRNA互补的核酸单链定位负链。因此，病毒核酸互补的核酸单链定位负链。因此，病毒核酸有以下有以下6 种类型：种类型： () DNA大部分大部分DNA病毒病毒 () RNA动物呼肠孤病毒动物呼肠孤病毒 （）（）DNA 大肠杆菌大肠杆菌 X174噬菌体噬
11、菌体 （）（）RNA所有单链所有单链RNA病毒病毒大部分植物病毒大部分植物病毒 （）DNA腺病毒腺病毒 （）RNA 流感病毒流感病毒 有的病毒只有一种蛋白质，多数含有几种蛋白质。有的病毒只有一种蛋白质，多数含有几种蛋白质。 病毒蛋白质的氨基酸组成与其他生物一样，但不同病毒蛋白质的氨基病毒蛋白质的氨基酸组成与其他生物一样，但不同病毒蛋白质的氨基酸组成和含量各不相同。酸组成和含量各不相同。 病毒蛋白质主要在构成病毒的结构、侵染与增殖过程中发挥作用。病毒蛋白质主要在构成病毒的结构、侵染与增殖过程中发挥作用。2. 病毒的蛋白质病毒衣壳的功能：病毒衣壳的功能：A. 保护核酸免受核酸酶及理化因素的破坏；B
12、. 具有与宿主细胞表面受体结合的结构； 无囊膜病毒的衣壳蛋白，能参与病毒的吸附、进入，决定病毒 的宿主嗜性。C. 衣壳蛋白具有良好的抗原性，能诱发宿主机体产生细胞免疫和体 液免疫。 病毒的衣壳：病毒的衣壳：是由大量的同一的衣壳蛋白单体分子即蛋白亚基(protein subunit)以次级键结合构成。3. 病毒的脂质与糖类 主要构成病毒的囊膜囊膜(membrane or envelope) 某些病毒在宿主细胞内成熟过程中，以出芽方式穿过核膜和或胞质膜、空泡膜等释放到宿主细胞外时，获得的一种宿主细胞脂质成分。 病毒的囊膜与其他生物膜相似，也是一种脂质双层膜；在囊膜形成时，宿主细胞的膜蛋白被病毒的囊
13、膜蛋白取代。 在病毒囊膜的表面，常有一些向外凸出的突起，成为刺突(spike)。囊膜的功能： A. 病毒囊膜与宿主细胞膜具有一定的同源性，易于亲和与融合，辅助病毒的感染作用； B. 病毒囊膜为脂质双层膜，对脂溶剂敏感，可作为鉴定病毒的一个指标； C. 病毒囊膜蛋白能与宿主细胞表面受体结合，介导病毒的吸附与穿入； D. 病毒囊膜蛋白具有良好的抗原性，可刺激宿主机体产生免疫应答； E. 病毒囊膜蛋白还具有凝集动物红细胞、促进细胞融合等特性。本节学习要点： 1. 病毒的大小与形态。 2. 研究病毒大小与形态的方法。 3. 病毒的基本结构与对称性。 4. 病毒核酸的特点与类型 5. 病毒衣壳的功能。
14、6. 病毒囊膜的本质与功能。第三节第三节 病毒的增殖病毒的增殖一. 病毒增殖的特点与方式二. 病毒的增殖过程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脱壳(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 装配与释放(assembly and release)三. 病毒的异常增殖现象四. 病毒增殖的干扰现象与干扰素一、病毒增殖的特点及方式一、病毒增殖的特点及方式 1. 1. 病毒增殖的特点病毒增殖的特点 隐蔽期隐蔽期 增殖期增殖期 无囊膜病毒：抑制宿主细胞的增殖，裂解释放 有囊膜病毒：和宿主细胞共同增殖，“出牙”释放 肿瘤病
15、毒：整合到宿主细胞基因组，可传到下一代 2. 2. 病毒增殖的方式病毒增殖的方式 自我复制自我复制二. 病毒的增殖过程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脱壳(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 装配与释放(assembly and release)(一一) Adsorption and Penetration1. 病毒的吸附病毒的吸附(Adsorption) (1)静电吸附静电吸附: 可逆，非特异的。在可逆，非特异的。在pH7时，病毒与宿主时，病毒与宿主细胞均带负电荷，不易接触，但有细胞均带负电荷，不易
16、接触，但有Ca2+和和Mg2+等阳离子的等阳离子的存在时，可降低负电荷，促进静电吸附。存在时，可降低负电荷，促进静电吸附。 (2)特异性吸附：特异性吸附：病毒与易感细胞上特异性受体相结合。病毒与易感细胞上特异性受体相结合。HIV 2. 病毒的穿入病毒的穿入(Penetration) (1)膜融合：病毒囊膜与宿主细胞膜融合,将其内部组分释放到细胞质中,如新城疫病毒等副粘病毒; (2)胞吞作用：多数病毒按此方式侵入; (3)完整病毒穿过细胞膜的移位方式，如腺病毒.艾滋病病毒的膜融合现象流感病毒的胞吞现象（二）（二）uncoating（三）（三） Biosynthesis病毒核酸复制病毒核酸复制病毒
17、核酸的复制病毒核酸链接入寄主核酸链病毒核酸链接入寄主核酸链 噬菌体噬菌体-大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程毒，新一代病毒开始新的生命旅程（四）（四） assembly and release 病病毒毒的的增增殖殖过过程程脊脊髓髓灰灰质质炎炎病病毒毒的的增增殖殖过过程程疱疹病毒的复制过程三. 病毒的异常增殖现象 缺陷病毒（缺陷病毒（ defective virus ）：）： 基因组不完整的病毒体 缺陷干扰颗粒（缺陷干扰颗粒（defective interfering particles, DIP)： 指缺陷病毒不能复制，但却能干扰
18、同种成熟病毒 进入细胞。 天然缺陷病毒：天然缺陷病毒： 腺病毒伴随病毒 顿挫感染顿挫感染（abortive infection）： 细胞条件不合适，病毒进入细胞但不能复制。四四. 病毒增殖的干扰现象与干扰素病毒增殖的干扰现象与干扰素 1. 病毒增殖的干扰现象病毒增殖的干扰现象 当两种病毒同时感染同一细胞时，可发生一种病毒的增殖抑制了另一种病毒增殖的现象。 产生原因： (1) 有干扰素(interferon，IFN)的存在； (2) 第一种病毒改变了细胞表面共用受体结构； (3) 第一种病毒改变了细胞代谢途径； (4) 第一种病毒抑制第二种病毒mRNA的转译(interferon，IFN)本节学
19、习要点：本节学习要点： 1. 病毒增殖的特点。 2. 病毒增殖的基本过程。 3. 病毒的异常增殖现象。 4. 干扰素的概念和作用。第四节第四节 病毒的致病机理病毒的致病机理一一. 病毒的细胞培养病毒的细胞培养二二. 病毒与细胞的相互作用病毒与细胞的相互作用三三. 病毒的致病机制病毒的致病机制 一、一、病毒的细胞培养病毒的细胞培养 常见的病毒培养方法有：常见的病毒培养方法有：细胞（包括组织器官）培养法；细胞（包括组织器官）培养法；鸡胚培养法；实验动物培养法。鸡胚培养法；实验动物培养法。 SPF动物或动物或SPF鸡胚，仍常用鸡胚，仍常用于培养病毒，但病毒的细胞培养发展最快，重点介绍。于培养病毒，但
20、病毒的细胞培养发展最快，重点介绍。 1、病毒细胞培养、病毒细胞培养 概念概念：将适宜组织中的细胞分散，在培养液中进行细胞将适宜组织中的细胞分散，在培养液中进行细胞培养，再接种病毒，让病毒在细胞中繁殖来培养病毒的方法。培养，再接种病毒，让病毒在细胞中繁殖来培养病毒的方法。 用途用途：用于病毒学研究，如用于病毒学研究，如病毒病毒分离、病毒克隆纯化、病分离、病毒克隆纯化、病毒病诊断及疫苗制备等。毒病诊断及疫苗制备等。 特点特点：一致性好，材料易得，易标准化试验，可重复性好。：一致性好，材料易得，易标准化试验，可重复性好。 可通过细胞病变判定病毒感染，也可结合免疫学技术检测可通过细胞病变判定病毒感染，
21、也可结合免疫学技术检测细胞内的病毒。细胞内的病毒。2、细胞培养类型、细胞培养类型 (1) 原代细胞原代细胞 动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞悬液，动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞悬液，再生长于培养器皿中。制备原代细胞，肾和睾丸最为常用，以再生长于培养器皿中。制备原代细胞，肾和睾丸最为常用，以来源于来源于SPF胚胎或幼畜组织的细胞为好。胚胎或幼畜组织的细胞为好。 (2) 二倍体细胞株二倍体细胞株 将原代细胞单层消化分散成单个细胞，继续培养传代，仍将原代细胞单层消化分散成单个细胞，继续培养传代，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性无变化。从为二倍体。此种细胞数量可
22、扩大，对病毒的易感性无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。 (3)传代细胞系传代细胞系 在体外培养液中可无限制分裂传代的细胞。一般来源于肿在体外培养液中可无限制分裂传代的细胞。一般来源于肿瘤组织。有已建立的很多传代细胞系，如瘤组织。有已建立的很多传代细胞系，如Hel6(人子宫癌细胞人子宫癌细胞)、Vero(非洲绿猴肾细胞非洲绿猴肾细胞)、PK-15(猪肾细胞猪肾细胞)等。等。 优点：优点：传代及培养方便，使用广泛。传代及培养方便，使用广泛。 缺点：缺点：对有的病毒不敏感；传代日久易被霉形体污染或对有的病毒不敏感；传代日久易被霉形体污染或 病毒
23、隐性感染；有致肿瘤的潜在危险病毒隐性感染；有致肿瘤的潜在危险3、细胞培养的方法、细胞培养的方法 最常用的方法为最常用的方法为静置培养静置培养及及旋转培养旋转培养。还可用。还可用悬浮培养悬浮培养或或微载体培养微载体培养技术等。技术等。 (1) 静置培养静置培养：将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶(管管)或或培养板培养板(孔孔)，封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁，封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板，一般需培养在含的单层细胞。如用细胞培养板，一般需培养在含5的的CO2条条件下。哺乳动物及禽类的细胞培养温度一般为件下。哺乳动物及
24、禽类的细胞培养温度一般为37。 (2) 旋转培养：旋转培养：基本方法与静置培养相同，不同之处是要基本方法与静置培养相同，不同之处是要培养的细胞不断缓慢旋转培养的细胞不断缓慢旋转(5-10rpm)，经过一段时间，细胞可在，经过一段时间，细胞可在培养瓶培养瓶(管管)的四壁长满单层。此法的产量高，适用于疫苗生产。的四壁长满单层。此法的产量高，适用于疫苗生产。 (3) 悬浮培养悬浮培养：通过搅拌使细胞处于悬浮状态，井补充营养通过搅拌使细胞处于悬浮状态，井补充营养和校正和校正pH，使之生长或维持存活。适用某些不需贴壁生长的细，使之生长或维持存活。适用某些不需贴壁生长的细胞系，如胞系，如NS1(一种骨髓瘤
25、细胞系一种骨髓瘤细胞系) 。 (4) 微载体培养微载体培养：是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径胞培养技术。微载体是直径35-100um微小颗粒，对细胞无毒性，微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，用于规模化细胞或疫苗生产。胞数也比上述常规方法大为增加，用于规模化细胞或疫苗生产。微载体有若干型号、已商品化。微载体有若干型号、已商品化。二、病毒与细胞的相互作用二、病毒与细胞的相互作用 病毒与宿主细胞之间作用的表现形
26、式各异。病毒的基因病毒与宿主细胞之间作用的表现形式各异。病毒的基因往往能诱导、模拟或封闭宿主细胞的功能。反之，宿主细胞往往能诱导、模拟或封闭宿主细胞的功能。反之，宿主细胞具有的防御功能也能封闭病毒的功能。病毒可致细胞、亚细具有的防御功能也能封闭病毒的功能。病毒可致细胞、亚细胞及分子水平的变化。胞及分子水平的变化。 1、病毒与细胞相互作用的类型、病毒与细胞相互作用的类型 宿主细胞感染病毒发生的变化有杀细胞和非杀细胞两种。宿主细胞感染病毒发生的变化有杀细胞和非杀细胞两种。即细胞死亡即细胞死亡(杀细胞、细胞病变、细胞裂解杀细胞、细胞病变、细胞裂解)、生产性、生产性(细胞存细胞存活、允许病毒繁殖、分泌
27、释放活、允许病毒繁殖、分泌释放)、非生产性、非生产性(细胞存活、阻断病细胞存活、阻断病毒复制毒复制)和转化和转化(病毒基因与细胞基因整合、可致肿瘤、细胞形病毒基因与细胞基因整合、可致肿瘤、细胞形态变化态变化)。2、病毒引致的杀细胞变化、病毒引致的杀细胞变化 某些病毒接种培养的单层细胞后，第一轮感染产生的子某些病毒接种培养的单层细胞后，第一轮感染产生的子代病毒将蔓延感染邻近的细胞，最终感染所有细胞。感染导代病毒将蔓延感染邻近的细胞，最终感染所有细胞。感染导致的细胞损伤称之为致的细胞损伤称之为细胞病变细胞病变(CPE)。CPE可在光学显微镜可在光学显微镜下观察，是病毒学检测及研究的常规手段之一。病
28、毒产生下观察，是病毒学检测及研究的常规手段之一。病毒产生CPE的能力与其对动物的致病力正相关，因此通常用的能力与其对动物的致病力正相关，因此通常用CPE作作为指标，来判定病毒的毒力，即计算病毒的半数细胞感染量为指标，来判定病毒的毒力，即计算病毒的半数细胞感染量(TcID50)。 细胞病变细胞病变(CPE)包括包括涉及细胞膜的涉及细胞膜的CPE（细胞膜融合）、（细胞膜融合）、涉及细胞骨架的涉及细胞骨架的CPE、病毒引致的细胞凋亡与坏死病毒引致的细胞凋亡与坏死 。正常细胞正常细胞CPE3、空斑形成、空斑形成 将将10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单层细单层细胞胞，而后
29、在细胞上覆盖一层，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂含营养液的琼脂，以防以防止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色，原先感染病传递。经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态，称为形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态，称为空空斑或蚀斑斑或蚀斑（细胞病变）。（细胞病变）。 一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致，因一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再
30、作空此可将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，这就是这就是病毒克隆病毒克隆。借助空斑技术不仅可。借助空斑技术不仅可纯化病毒纯化病毒，还，还对病毒定量，定量单位称为对病毒定量，定量单位称为空斑形成单位空斑形成单位(PFU)。 通过通过PFUPFU的计数及的计数及PFUPFU减数试验，可滴定血清的效减数试验，可滴定血清的效价、测定干扰素的活性等。许多动物病毒如疱疹病毒、价、测定干扰素的活性等。许多动物病毒如疱疹病毒、披膜病毒、微披膜病毒、微RNARNA病毒及水泡性口炎病毒均可通过此法病毒及水泡性口炎病毒
31、均可通过此法作定量分析。作定量分析。4、包、包 涵涵 体体 包涵体包涵体是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，可是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，可通过固定染色后在光学显微镜下检测。包涵体通过固定染色后在光学显微镜下检测。包涵体位置位置(核内或胞浆核内或胞浆)、数量数量(单个或多个单个或多个)、大小大小(较大或较小较大或较小)、形态形态(圆形或无规律形态圆形或无规律形态)和和染色性染色性嗜酸嗜酸(伊染成粉红色染成粉红色)或或嗜碱嗜碱(苏木精染成蓝色苏木精染成蓝色)，因病，因病毒的种类而异，可用于诊断。毒的种类而异，可用于诊断。巨细胞病毒包涵体狂犬病毒包涵体 5、病毒引致的非杀细胞变
32、化、病毒引致的非杀细胞变化 非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代谢并无大碍，但同时还生产并释放子代病毒颗粒。除少数例外，谢并无大碍，但同时还生产并释放子代病毒颗粒。除少数例外，大多持续感染的细胞发生慢性渐进性变化，最终死亡大多持续感染的细胞发生慢性渐进性变化，最终死亡。 6、病毒的干扰现象、病毒的干扰现象 主要是由干扰素介导。主要是由干扰素介导。 干扰素并无病毒特异性干扰素并无病毒特异性，例如副粘病毒感染诱导的干扰素，例如副粘病毒感染诱导的干扰素对披膜病毒感染完全有效。干扰素在分泌部位或经循环至全身。对披膜病毒感染完全有效。干扰素
33、在分泌部位或经循环至全身。通常在病毒感染早期即在第一批子代病毒释放之时产生于从而通常在病毒感染早期即在第一批子代病毒释放之时产生于从而对相邻细胞及机体产生保护作用。对相邻细胞及机体产生保护作用。 病毒与宿主细胞相互作用的结果可引致宿主的临床和病病毒与宿主细胞相互作用的结果可引致宿主的临床和病理变化。病毒对动物的致病机制包括：病毒对组织器官包括理变化。病毒对动物的致病机制包括：病毒对组织器官包括免疫器官等的损伤，以及宿主的相应变化。免疫器官等的损伤，以及宿主的相应变化。 1. 病毒感染对寄主组织器官的损伤病毒感染对寄主组织器官的损伤 病毒致病的严重程度与该病毒在组织细胞引致的病变程病毒致病的严重
34、程度与该病毒在组织细胞引致的病变程度并无直接关系。度并无直接关系。病毒引起的细胞和组织损伤是否会产生临病毒引起的细胞和组织损伤是否会产生临床疾病因器官而异。床疾病因器官而异。 (1)对宿主组织和器官的直接损伤对宿主组织和器官的直接损伤 某些杀细胞性病毒对细胞直接损伤引致机体的临床症状某些杀细胞性病毒对细胞直接损伤引致机体的临床症状和病理变化。和病理变化。三三. 病毒的致病机制病毒的致病机制 对呼吸道上皮的损伤对呼吸道上皮的损伤：呼吸道病毒最初入侵并损：呼吸道病毒最初入侵并损伤上皮细胞，逐步损坏呼吸道粘膜的保护层，暴露出伤上皮细胞，逐步损坏呼吸道粘膜的保护层，暴露出越来越多的上皮细胞。感染后期当
35、上皮细胞损坏时，越来越多的上皮细胞。感染后期当上皮细胞损坏时，纤毛停止摆动。呼吸道表面上皮的退化性变化非常迅纤毛停止摆动。呼吸道表面上皮的退化性变化非常迅速，但能迅速再生。速，但能迅速再生。 对消化道上皮的损伤对消化道上皮的损伤：病毒对消化道的感染多数：病毒对消化道的感染多数呈潜伏期短，没有任何前驱症状。轮状病毒等感染后呈潜伏期短，没有任何前驱症状。轮状病毒等感染后相邻肠绒毛有时发生融合，肠道吸收面积减少，导致相邻肠绒毛有时发生融合，肠道吸收面积减少，导致肠腔中粘液积累并腹泻。细小病毒感染损伤分化中的肠腔中粘液积累并腹泻。细小病毒感染损伤分化中的肠腺上皮。肠腺上皮。 (2) 无组织器官损伤时所
36、致的病理变化无组织器官损伤时所致的病理变化 某些病毒感染引起的某些病毒感染引起的损伤不明显损伤不明显，感染细胞仍能，感染细胞仍能低效地执行正常或低于正常细胞功能，不表现临床症低效地执行正常或低于正常细胞功能，不表现临床症状，但此时丧失了系统自身平衡必需的特定功能。导状，但此时丧失了系统自身平衡必需的特定功能。导致机体致机体功能紊乱功能紊乱。 (3) 易致细胞继发感染的组织和器官损伤易致细胞继发感染的组织和器官损伤 某些病毒感染，还易使动物发生继发感染。如马某些病毒感染，还易使动物发生继发感染。如马发生流感时，使链球菌和其他细菌侵入肺，引发肺炎，发生流感时，使链球菌和其他细菌侵入肺，引发肺炎，而
37、细菌分泌的蛋白酶又能裂解病毒的血凝素，激活病而细菌分泌的蛋白酶又能裂解病毒的血凝素，激活病毒的感染；轮状病毒和冠状病毒感染易使肠道发生大毒的感染；轮状病毒和冠状病毒感染易使肠道发生大肠杆菌的继发感染，导致严重的腹泻。肠杆菌的继发感染，导致严重的腹泻。 2. 病毒的持续性感染病毒的持续性感染 多数病毒感染都有程度不等的慢性表现，如犬瘟多数病毒感染都有程度不等的慢性表现，如犬瘟热病毒感染的某些犬在急性疾病阶段结束后，病毒在热病毒感染的某些犬在急性疾病阶段结束后，病毒在他内能数月或数年持续存在，引起某些器官的迟发性他内能数月或数年持续存在，引起某些器官的迟发性病理变化。病毒的持续感染在急性症状转轻或
38、转化为病理变化。病毒的持续感染在急性症状转轻或转化为亚临床后，还可引起轻微的慢性疾病。亚临床后，还可引起轻微的慢性疾病。 (1) 持续性感染的类型持续性感染的类型 持续性感染引起宿主的疾病复发，并能引致免疫持续性感染引起宿主的疾病复发，并能引致免疫病理疾病，还与肿瘤的形成有关。病毒能在经免疫的病理疾病，还与肿瘤的形成有关。病毒能在经免疫的动物体内以持续性感染的方式存活，成为传染源，具动物体内以持续性感染的方式存活，成为传染源，具有流行病学上的重要性。有流行病学上的重要性。 病毒持续性感染可分为以下四种类型：病毒持续性感染可分为以下四种类型： 持续性感染持续性感染：发病或不发病，：发病或不发病，
39、感染后持续排毒感染后持续排毒。很迟才发生免疫病理病或肿瘤病。很迟才发生免疫病理病或肿瘤病。 潜伏感染潜伏感染：又名隐性感染，除非激活，一般：又名隐性感染，除非激活，一般并不并不能发现感染性病毒能发现感染性病毒。 如奶牛传染性鼻气管炎。如奶牛传染性鼻气管炎。 慢性感染慢性感染：传染性病毒在一个很长的临床前阶段：传染性病毒在一个很长的临床前阶段逐渐增多逐渐增多，最终导致缓慢、，最终导致缓慢、渐进性致死疾病渐进性致死疾病。如绵羊。如绵羊痒病（阮病毒），在感染神经组织若干年后才能检出，痒病（阮病毒），在感染神经组织若干年后才能检出，直至动物死亡时，在脑部才达到较高滴度。直至动物死亡时，在脑部才达到较高
40、滴度。 迟发性临床症状的急性感染迟发性临床症状的急性感染：此类病毒的持续性：此类病毒的持续性复制与疾病的进程无关，如猫全白细胞减少症病毒，复制与疾病的进程无关，如猫全白细胞减少症病毒，在胎猫时已受感染，但直至青年猫才表现小脑综合征，在胎猫时已受感染，但直至青年猫才表现小脑综合征，出现出现神经损伤时，并不能分离出病毒。神经损伤时，并不能分离出病毒。 3. 病毒感染对免疫系统的损伤病毒感染对免疫系统的损伤 病毒可感染免疫系统的细胞，感染细胞的类型因病毒可感染免疫系统的细胞，感染细胞的类型因病毒的种类而异。病毒感染免疫细胞导致免疫系统的病毒的种类而异。病毒感染免疫细胞导致免疫系统的损伤，从而加重疾病
41、，或使宿主易于再感染另一种病损伤，从而加重疾病，或使宿主易于再感染另一种病毒，后者称为双重感染。毒，后者称为双重感染。 免疫系统损伤的表现免疫系统损伤的表现 如如传染性囊病（传染性囊病（IBD）病毒感染鸡的法氏囊，导病毒感染鸡的法氏囊，导致囊萎缩和严重的致囊萎缩和严重的B细胞缺失，宿主因此对沙门氏菌细胞缺失，宿主因此对沙门氏菌和大肠杆菌等细菌的易感性增，并常发生马立克病毒、和大肠杆菌等细菌的易感性增，并常发生马立克病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或传染性喉气管炎新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或传染性喉气管炎病毒的双重感染。病毒的双重感染。 如如猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、人类获得性猫白血
42、病病毒、猫免疫缺陷病毒、人类获得性免疫缺陷综合征免疫缺陷综合征(AIDS）病毒等感染病毒等感染T细胞后，也能细胞后，也能引发多种继发感染，导致宿主死于机会感染。引发多种继发感染，导致宿主死于机会感染。本节学习要点：本节学习要点： 1. 细胞培养的概念、类型和方法； 2. 病毒与细胞相互作用的类型； 3. 细胞病变效应、空斑与包涵体的概念； 4. 病毒的致病机制。第五节第五节 病毒的鉴定病毒的鉴定一一. 病料的采集与运送病料的采集与运送二二. 病毒的培养病毒的培养三三. 病毒的纯化病毒的纯化四四. 病毒的鉴定病毒的鉴定一一. 病料的采集与运送病料的采集与运送v从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采
43、取病料。从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。v注意采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。注意采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。v检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以了解抗体滴度的变化。了解抗体滴度的变化。v保存与运送，由于病毒对外界因素特别是很敏感，因此，保存与运送，由于病毒对外界因素特别是很敏感，因此，必须放在保护液中，并在低温下保存或寄送。必须放在保护液中，并在低温下保存或寄送。v收集病料必须无菌操作，如有污染，可用通过滤器、加抗收集病料必须无菌操作，如有污染，可用通过滤器、加抗生素或高速离心法除去细菌，方可使用。生素
44、或高速离心法除去细菌，方可使用。动物接种动物接种鸡胚接种鸡胚接种组织培养组织培养原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养三大培养方法三大培养方法器官培养移植培养 细胞培养 二二. 病毒的培养病毒的培养 1010日龄鸡胚结构日龄鸡胚结构鸡胚接种鸡胚接种传染性支气管炎病毒引起鸡胚的变化传染性支气管炎病毒引起鸡胚的变化 细胞培养 原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞培养三、病毒的纯化 是从病毒感染的宿主机体组织、体液、分泌物或病毒感染的细胞培养物中提取病毒粒子、除去非病毒成分的过程。 纯化病毒的方法较多，主要有以下几种： 沉淀法 层析法 红细胞吸附法 电泳法 超速离心法 超滤法二、病毒的鉴定1. 1.
45、病毒的鉴定方法病毒的鉴定方法 可通过以下方法确证病毒的存在： 形态学观察 检查包涵体 细胞病变 检测某病毒抗原或确证特异性抗体的存在2. 病毒的鉴定过程病毒的鉴定过程(1) 对病毒宿主范围及感染表现进行鉴定 病毒一般都有自己相当专一的宿主范围和感染表现。(2) 对病毒的理化性质进行鉴定 病毒大小与形态、核酸类型、对理化因子的敏感性。(3) 对病毒的血细胞凝集性质进行鉴定 病毒血凝谱及温度、酸碱度对血凝特性的影响。(4) 对抗病毒血清或病毒抗原进行鉴定 沉淀试验、凝集试验、ELISA、中和试验等。(5) 对病毒的核酸或基因进行分子生物学鉴定 PCR鉴定、PAGE电泳、核酸酶切分析与序列测定等。(
46、1) 病毒感染单位病毒感染单位(IU) 能够引起宿主或宿主细胞发生一定特异性能够引起宿主或宿主细胞发生一定特异性反应的病毒最小剂量反应的病毒最小剂量(2) 病毒的效价或毒力病毒的效价或毒力 指单位体积病毒悬液的感染单位数目指单位体积病毒悬液的感染单位数目(3) 半数致死剂量半数致死剂量(LD50)(4) 半数感染剂量半数感染剂量(ID50)(5) 半数组织培养感染剂量半数组织培养感染剂量(TCID50)3. 病毒的定量指标病毒的定量指标本节学习要点：本节学习要点： 1. 病毒感染病料的采集与送检； 2. 病毒的培养方法； 3. 病毒的纯化方法； 4. 病毒的鉴定方法、鉴定过程与定量指标。第六节
47、第六节 噬菌体和亚病毒噬菌体和亚病毒一、噬菌体一、噬菌体(bacteriophage, phage) 病毒种类很多，根据病毒寄生的对象可分：病毒种类很多，根据病毒寄生的对象可分： 植物病毒植物病毒 动物病毒动物病毒 微生物病毒微生物病毒 噬菌体：噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌的是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌的病毒叫噬菌体病毒叫噬菌体(把侵染真菌的病毒叫噬真菌体把侵染真菌的病毒叫噬真菌体)。 噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体在自然界广泛存在，1995年共报道了年共报道了4000余种，余种，分别划归为分别划归为49个病毒科个病毒科. ( (一一) )噬菌体的结构噬菌体的结构以
48、以大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体为例为例头部：头部：廿面体对称结构，由蛋白廿面体对称结构，由蛋白 质衣壳构成，内含一条质衣壳构成，内含一条DNADNA。颈部：颈部：薄盘状，附颈须。薄盘状，附颈须。尾鞘尾鞘：长长95nm, 95nm, 衣壳粒螺旋对衣壳粒螺旋对 称；可伸缩。称；可伸缩。 尾髓尾髓: :中空，中空，DNADNA可由此进入细胞。可由此进入细胞。基板基板: : 六角形盘状物，其上有刺六角形盘状物，其上有刺 突、尾丝。突、尾丝。刺突刺突: : 有吸附功能。有吸附功能。尾丝尾丝: : 有识别吸附功能。有识别吸附功能。大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体构造噬菌体构造( (二二) )噬菌体的类型
49、噬菌体的类型根据噬菌体与宿主的关系根据噬菌体与宿主的关系, ,可分为：可分为： 烈性噬菌体烈性噬菌体(virulent phase)： 指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体. 温和噬菌体温和噬菌体(temperate phase)： 噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主核噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主核DNA上，上， 并随宿主并随宿主DNA的复制而进行复制，在一般情况下，不的复制而进行复制，在一般情况下，不 引起寄主细胞裂解的噬菌体。引起寄主细胞裂解的噬菌体。1. 烈性噬菌体烈性噬菌体(virulent phase)烈性噬菌体的繁殖过程
50、一般分为五个阶段：烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段： 即即吸附、侵入、复制、装配和释放吸附、侵入、复制、装配和释放。 将少量烈性噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与将少量烈性噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与4545左右的琼脂培养基左右的琼脂培养基(1%)(1%)在培养皿中充分混匀，然后倒入在培养皿中充分混匀，然后倒入含底层琼脂培养基含底层琼脂培养基(2%)(2%)的平板培养，经数小时至的平板培养，经数小时至1010余小时后，余小时后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到一个个在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到一个个透亮不长菌的小圆斑透亮不长菌的小圆斑, ,
