1、1第三章 植物组织与器官培养2本章内容第一节 植物组织培养第二节 植物胚胎培养第三节 毛状根培养第四节 人工种子第五节 植物脱毒3A Glimpse of Plant Tissue Culture第一节 植物组织培养5主要内容：一、植物组织培养的基本概念及意义二、植物组织培养的发展历史三、植物组织培养的理论基础四、植物组织培养再生植株的途径五、植物组织培养的培养基六、植物组织培养问题分析6一、植物组织培养的基本概念及意义植物组织培养：是指在离体、无菌条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。（离体培养或试管培养）1、植物组织培养、植物组织培养器官（or
2、gan）：根、茎、叶、花、果实、种子组织（tissue）：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等。切取接种愈伤组织的形成试管苗的形成培养室移栽植物组织培养的操作过程8v培养条件可以人为控制。v生长周期短，繁殖率高。v管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。2、植物组织培养特点9（1）快速繁殖技术：不受季节限制、用材少、速度快等特点。（2）植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒，茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径。（3）新品种选育：组织培养技术进行新品种选育具有效率高、周期短、纯度高等优点。3、植物组织培养的意义10（4）在遗传、生理生化和病理等研究上的应用：组织培养能快速、大量地获得性状一致的实验材料
3、。（5）种植资源的保存：具有独特遗传性状的生物物种的灭绝是一种不可挽回的损失。11 “余蝴蝶”“绿云”121、萌芽阶段：(从20世纪初到30年代中）1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。二、植物组织培养的发展历史13Haberlandt：1902年，提出了 植物细胞全能性学说观点：观点：贡献：贡献：提出细胞全能性提出细胞全能性首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青
4、属表皮细胞无分裂无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素Knop+蔗糖蔗糖141934年，美国植物生理学家White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。1937年，White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用。创立了White培养基。1943年White发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。2、奠基阶段（从20世纪30年代末到50年代中期）P.R.White153、快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末至今） 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整
5、的小植株。这是第一次获得植株再生成功，首次通过实验证实了细胞全能性，是植物组织培养的第一个突破。 1960年英国学者Cocking用酶法从番茄幼根中分离得原生质体成功。这是植物组织培养的第二个突破。Edward C. Cocking161962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株17我国学者在组培研究工作中的贡献：1933年，李继侗等关于
6、银杏胚胎的培养。1935到1942年，罗宗洛，玉米等植物的离体根尖培养。1951年，崔澂等确定嘌呤和生长素的比例是控制芽与根的形成条件之一。后来罗士韦，李正理，王伏雄等关于幼胚和茎尖的培养工作都很有价值。我国还先后研制出N6，C17等培养基。18三、植物组织培养的理论基础 植物组培技术的理论基础是：植物细胞的全能性191、植物细胞的全能性 一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会带有一套发育成一个完整植株的遗传基础，并具备发育成完整植物体的潜在能力。 20思考题：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？21细胞全能性的实现条件和差异全能性实现的条件：受精卵受
7、精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞离体状态有一定营养物质、激素和其他外界条件细胞再生的潜力与细胞分化程度成负相关植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞22植物细胞全能性的实现：(1).植物的生活史（生命周期）受受精精卵卵合合子子胚胚组组织织器器官官植植物物体体早期胚胎发育早期胚胎发育分化分化形成形成构成构成已已分分化化细细胞胞(2).植物组培过程（组培周期）愈愈伤伤组组织织组组织织器器官官植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化形成形成构成构成外外植植体体23 外植体（explant)：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。（一
8、）重要概念四、植物组织培养再生植株的途径24接种材料修整方法 外植体类型修整方法根及地下部器官剪除老根、烂根；切除损伤及污染严重部位；用软毛刷刷洗，去除泥土、虫卵等附属物；幼根剪或切成1至几厘米长的根段。茎尖、茎段 剪或切除枝条上的叶片、叶柄及刺、卷须等附属物；软质枝条用软毛刷蘸肥皂水刷洗、硬质枝条用刀刮除枝条表面的蜡质、油质、茸毛等；枝条剪成带2-3个茎节的茎段，长约4-5cm。外植体处理25接种材料修整方法 外植体类型修整方法叶片叶片带油脂、蜡质、茸毛，可用毛笔蘸肥皂水刷洗；较大叶片可剪成若干带叶脉的叶块，大小以能放入冲洗用容器即可。 花器一般不用修整，直接冲洗消毒。果实、种子、胚、胚乳一
9、般不用修整，直接冲洗消毒。种子、胚或胚乳培养时，对于种皮较硬的种子，可去除种皮或预先用低浓度的盐酸浸泡或机械磨损。26 接种材料修整与冲洗27愈伤组织（callus）：原指植物受伤后在伤口表面形成的一团薄壁细胞；在组织培养中，是指在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的具有旺盛分裂能力的薄壁细胞。28黑暗培养下烟草愈伤组织 水稻愈伤组织29愈伤组织特点v植物细胞脱分化而不断增殖形成的愈伤组织，主要由薄壁细胞构成的非器官化组织或不定组织。v愈伤组织的颜色、质地不同。v愈伤组织具有结构的不均一性和生理和遗传上的不稳定性。30细胞分化、脱分化和再分化分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，
10、包括时间上和空间上的分化。脱分化：是已有特定结构和功能的植物组织的细胞，在一定的条件下被诱导改变原来的发育途径，逐步失去原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞的过程。 脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织外植体外植体31再分化：指在离体条件下，脱分化的细胞再次分裂、分化并形成不同组织，进而构成器官和植株的过程。再分化32 1、器官发生途径： 器官发生（organogenesis）： 指离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。百合鳞叶培养（二）、再生植株的途径33器官发生途径器官发生途径外植体外植体愈伤组织愈伤组织不定芽不定芽不定根不定根再生植株再生植株脱分化脱分化再
11、分化再分化342、器官发生途径的四个步骤 启动期：诱导外植体细胞脱分化和分裂。u通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使细胞合成代谢活化，细胞内物质代谢旺盛，但是细胞大小和形态没有多大变化，所以外观无明显特征。35 愈伤组织诱导：激素种类、浓度及组合对愈伤组织诱导有着重要作用。 光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。温度：一般采用2428的恒温条件进行。湿度：较大，以免引起培养基干缩。36 拟分生组织的形成：分化出形态和功能不同的细胞，若干部位出现形成层的细胞群，是器官发生的转变时期。 37 器官形成（3种基本方式）：先分化芽再分化根：待
12、芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株，这种方式在木本植物组织培养中较为普遍，因此芽和根的诱导要分两步完成。先分化根再分化芽：先分化根再在根上产生不定芽而形成完整植株。愈伤组织的不同部位分别形成芽和根：然后二者的维管组织互相连接，成为具有统一的轴状结构的小植株38外植体高生长素（2，4-D）脱分化形成愈伤组织再分化分化成芽分化成根形成完整植株高（细胞分裂素/生长素）低（细胞分裂素/生长素）生长物质控制器官分化的模式图39愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗胚状体胚状体小小麦麦愈伤组织器官发生途径愈伤组织器官发生途径40魔芋胚状体2、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径） ：是指在愈伤组织
13、中产生出一些与种子中的胚相似的结构，即同时形成一个有苗端和根端的双极性结构，而发育成再生植株的途径。41（1）体细胞胚(somatic embryo)或胚状体(embryoid)： 指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 42 定义表明:它不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合的产物；它不同于孤雌胚或孤雄胚，因为它不是无融合生殖的产物；它不同于组织培养中通过器官发生途径形成的茎芽和根，因为它的形成经历与合子胚相似的发育过程，而且成熟的胚状体是一个双极性结构。 43图3.1 胡萝卜合子胚和体细胞胚发生过程 (A) 伸长期合子；(B) 合子经过第一次分裂, 产生1 个顶细胞(绿色)和一
14、个基细胞(粉红色)；(C) 四分体胚: 顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D) 16 细胞球形胚: 8 细胞胚的所有细胞经过1 次平周分裂, 产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子叶和胚根原基已经出现；(G) 成熟胚胎。1: 顶细胞; 2 : 基细胞; 3: 胚根原细胞, 形成未来的ROC 和根冠中央区; RM: 根尖生长点; SM: 茎尖生长点图图3.2 为双子叶植物拟南芥的胚胎发育过程为双子叶植物拟南芥的胚胎发育过程45花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子
15、胚无融合生殖胚46（2）体细胞胚发生途径 直接途径：直接从外植体不经愈伤组织阶段发育而成。 诱导期 胚胎发育期47 间接途径： 愈伤组织发生途径愈伤组织发生途径悬浮培养细胞发生途径悬浮培养细胞发生途径单细胞发生途径单细胞发生途径原生质体发生途径原生质体发生途径48 悬浮培养系统悬浮培养系统（cell suspension culture） 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。 适于悬浮培养适于悬浮培养适于再生植株适于再生植株适于悬浮培养适于悬浮培养49愈伤
16、组织发生愈伤组织发生外植体外植体脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株再分化再分化v单细胞单细胞v单细胞培养胚状体的突破有着重要得意义。 i、可给植物基因工程提供最有效得受体材料与表达载体； ii、可有效服务与物种改良及稀有物种的种质资源保藏工作。成胚成胚原生质体发生途径52再分化过程的两种途径：分化、分化、成熟细胞成熟细胞分生状分生状态细胞态细胞茎芽、根的分化茎芽、根的分化再生植株再生植株胚状体胚状体器官发生器官发生胚状体发生胚状体发生脱分化再分化53胚状体苗与器官发生苗的区别胚状体苗器官发生苗1.最初形成多来自单个细胞，双向极性，两个分生中心，较早分化出茎端和根端(方向相
17、反)1.最初形成多来自多细胞，单向极性，单个分生中心2.胚状体维管组织与外植体维管组织不相连2.不定芽和不定根与愈伤组织的维管组织相连3.具有典型的胚胎形态发生过程3.无胚胎形态，分生中心直接分化器官4.形成的幼苗具有子叶4.不定芽的苗无子叶5.胚状体发育的苗，根和芽齐全，不经历诱导生根阶段5.一般先长芽后诱导生根，或先长根后长芽541.培养基成分 培养基的成分直接影响到植物离体材料的培养。五、植物组织培养的培养基55（1）无机盐类）无机盐类Inorganic salts 大量元素大量元素Macronutrients：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素微量元素Micronutrients ：
18、 Fe、Cu、Zn、Bo、 Mn、 Mo、Co and Cl 56 当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：v氮某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色；不能形成导管。v氮、钾和磷细胞过度生长，形成层组织减退；v硫非常明显地褪绿。v铁细胞分裂停止。v硼细胞分裂停滞，细胞伸长。v锰或钼影响细胞伸长。57（2）有机化合物）有机化合物organic compound糖类：糖类：C源，又可维持培养基的渗透压源，又可维持培养基的渗透压 包括：包括： 二糖二糖蔗糖蔗糖、麦芽糖、麦芽糖 单糖单糖葡萄糖葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、半乳糖、甘露糖、果糖 最适的糖浓度随培养阶
19、段的不同而变化。最适的糖浓度随培养阶段的不同而变化。（20-40 g/L）58维生素 直接参与酶的合成，还参与蛋白质和脂肪的代谢。 VitB1、VitB6、烟酸、生物素、叶酸等肌醇环己六醇 能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响。59腺嘌呤 腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。氨基酸 常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。60（3）生长调节物质植物激素（phytohormone ） 是自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的 微量有机物。包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯等。 在个体发育中，不论是种子发
20、芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。 植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。61生长素类生长素类 Auxins：诱导植物生长的一类化合物。诱导植物生长的一类化合物。IAAindole acetic acid（吲哆乙酸）（吲哆乙酸）NAA- Napthyl acetic acid（萘乙酸（萘乙酸 ）2,4-D-2,4-dichlorophenoxy acetic acisd（二氯苯氧乙酸）（二氯苯氧乙酸）IBA-Indole-3-butyric acid（吲哆丁酸）等。
21、（吲哆丁酸）等。组培中，生长素用于促进细胞分裂和诱导根的分化。组培中，生长素用于促进细胞分裂和诱导根的分化。62细胞分裂素类（细胞分裂素类（cytokinins） 促进细胞分裂，诱导芽的形成并促进其生长。促进细胞分裂，诱导芽的形成并促进其生长。KT-Kinetin（ 6-呋喃氨基嘌呤呋喃氨基嘌呤,激动素）激动素）BAP-benzylaminopurine（6-苄氨基嘌呤）苄氨基嘌呤）2-ip（异戊烯氨基嘌呤）（异戊烯氨基嘌呤）IPA-isopentenyl adenine（异戊烯腺嘌呤）（异戊烯腺嘌呤）ZT -Zeatin（玉米素）等。（玉米素）等。63其他植物激素其他植物激素GA19 - g
22、ibberellins赤霉素类 促进茎延长和开花。ABA - absisic acid （脱落酸）Ethylene(乙烯)B9（丁酰肼）CCC（矮壮素）等64（4） 水：一切生命之源水：一切生命之源功能：培养基营养成分的溶剂、培养基的 组成成分比例：占培养基成分的95要求：根据培养目的和用途的不同，对水 质的要求也不一样。 （蒸馏水或高纯度去离子水）65（5）其他成分）其他成分琼脂 来自于红海藻 最常用的培养基凝固剂，0.6-1.0活性炭 吸附剂，可吸附培养过程中产生的一些有毒物质，0.5662.培养基pH 培养基的pH范围：5.5-6.0，大多数植物可调整为5.8。673.培养基类型按培养基
23、的组成分：富盐平衡培养基：无机盐含量高，元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强缓冲性，如：MS、LS、BL、BM和ER。高硝态氮培养基：硝态氮含量高、氨态氮含量低，如：B5、N6和SH68中盐培养基：大量元素无机盐含量为MS一半，微量元素含量提高种类减少，维生素种类比MS增多，增加生物素、叶酸等。 如：H、Nitsch、Miller等低盐培养基：无机盐和有机成分含量低，多用于作为生根培养基(RIM)。如：White、WS、HE等70（1）玻璃化问题 植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化（Vitrification）现象，又称过度水化
24、现象。 由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，移栽大田更难成活，已成为组培的一大问题。 组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是适应性的生理问题，是不能很好适应培养基和培养环境的结果。六、植物组织培养问题分析71防治措施u适当提高光照强度，有助于克服玻璃化。u注意通气，尽可能降低培养容器内的空气相对湿度和改善氧气供应状况。u适当降低培养基中NH4+浓度。u注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合使用。u控制温度，适当进行低温处理，避免过高的培养温度，利于消除玻璃化。72 （2）褐变问题 褐变（Browning）可分为酶促褐变和非酶促褐变，主
25、要是酶促褐变。 酶促褐变是由多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)引起的。当外值体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，酚酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质(羟醌与黑色素等)，引起褐变的发生。73防治措施u选择适宜的外植体u选择适宜的培养条件u细胞筛选和材料预处理u使用抑制剂u使用吸附剂74 （3）微生物污染 造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。 外部污染菌：主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。 内源菌：外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理及消毒方法等密
26、切相关。 应该严格按照无菌操作，取材时应选择嫩梢、新芽或胚作为外植体材料，对外植体进行彻底消毒。75防治措施u改进外植体消毒方法u反复检查培养物u使用适当种类和浓度的抗生素76一些植物很容易通过组织培养进行无性繁殖。目前被子植物组织培养成功的比较多。裸子植物组织培养成功的比较少。很难脱分化诱导成具有全能性的细胞。（4）品种限制77植物组织培养应用举例78例子：寒兰组织培养寒兰叶姿碧绿清秀、秀美、花色丰富、香气沁人，花色绚丽多彩，花香清雅久远，大多开花于112月，是寂寞的秋冬不可多得的名花，花期3550d，且有很高的欣赏价值。79培养技术注意在愈伤组织诱导、发芽、生根过程中激素等调节物质的选择。
27、总路线：以寒兰种子萌发后形成的根状茎为外植体，对类原球茎诱导、增殖、分化。材料：以寒兰种子萌发后形成的根状茎为外植体。80NAA（萘乙酸）：生长素6-BA（6-苄基腺嘌呤）：分裂素3-3307(优康唑)：生长调节剂（促进分蘖、抑制细胞伸长，矮化植物）surose（蔗糖）811）类原球茎诱导愈伤组织培养基：B5+TDZ（噻苯隆 ）0-0.80mg/L+NAA（萘乙酸）0.20-0.80mg/L;噻苯隆（Thidiazuron）：一种植物生长调节剂，具有极强的细胞分裂活性。NAA（萘乙酸）：生长素822) 继代增殖培养基：B5+优康唑0.50-1.50mg/L+NAA0.20-0.60mg/L+蔗
28、糖2-5%。（降低了NAA浓度，增加了调节物质）烯效唑属三唑类化合物，具有强烈生长调节功能。833）分化培养基：B5+烯效唑0.75-1.25mg/L+6-BA（6-苄基腺嘌呤）0.5-1.5 mg/L+NAA0.20-0.60mg/L;蔗糖浓度为3.5%（较高的分裂素比例）6-BA：细胞分裂素类原球茎芽。当类原球茎上分化出的幼苗长到3-5cm时，切割转到生根培养基中进行生根培养。844) 生根培养基：B5+AC（活性炭）0.05%，NAA0.20mg/L和琼脂粉0.68%。蔗糖浓度为3.5%。（去掉了分裂素，生长素利于生根）85重点：1、植物组织培养再生植物的原理、技术脱分化是细胞全能性表现的前提，再分化是细胞全能性的最终体现，是再生植株的基础。2、植物组织培养的培养基，主要是植物激素。难点：1.激素在细胞分化中的调节作用，生长素和细胞分裂素的比例控制植物细胞的分化。2.植物组织培养再生植株的途径：器官发生途径与体细胞胚发生途径的区别。
