1、DNA的测序方法、原理及其应用一、一、DNA序列测定概述及其发展序列测定概述及其发展 即即核酸核酸DNADNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术重要的技术。 1963年，年，Sanger和和Thompson等人第一次完成胰岛素等人第一次完成胰岛素51个个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，年代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序等人又建立了核酸序列测定的方法，列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和双脱氧末端终止法和Maxam-
2、Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读直读”阶段，阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。列。二、测序的常用方法二、测序的常用方法DNA序列测定常用方法有如下3种： 1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用
3、化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。 1）双脱氧链终止法测序双脱氧链终止法测序(the chain termination method) 基本原理： 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。用于终止
4、反应的双脱氧核苷酸： 将2 ，3 双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3 羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPHH12345H2O脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸?2）Maxam-Gilbert 化学降解法测序化学降解法测序基本原理：基本原理： 用放射性核素标记待测用放射性核素标记待测DNA一侧末端一侧末端 将标记将标记DNA分为分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系个反应体系 用不同的化学
5、试剂处理不同反应体系，随机断裂用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物片段的混合物 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出可读出DNA序列序列表表-特异断裂特异断裂4种脱氧核苷酸的方法种脱氧核苷酸的方法作用的碱基作用的碱基试剂与反应试剂与反应碱基释放碱基释放DNA断裂断裂强强G/弱弱A稀释稀释250倍硫酸二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（卡可酸（PH8
6、.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20060分钟，分钟，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化嘌呤不稳定，甲基化嘌呤不稳定，在中型在中型PH加热被破坏加热被破坏在在0.1M碱中，碱中，9015分钟，戊糖脱落，分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，链断裂，G断裂断裂比比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分分钟，碱基被破坏钟，碱基被破坏同上，同上，A断裂比断裂比G快快C+T15-18M联苯胺、联苯胺、2050分钟，嘧啶环被破坏释放分钟，嘧啶环被破坏释放0.5M哌啶处理，断哌啶处理，断裂裂DNA键，键，C与与T有有同样速率同样速率C2MNaCl，联氨处理方法同上，联氨处理方法同上
7、，100分钟，此时，分钟，此时，T的破坏被抑制，只有的破坏被抑制，只有C被破坏释放被破坏释放同上，只在同上，只在C处断裂处断裂DNA链链在在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：的机制是： G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，弱了嘌呤脱氧核糖核苷
8、酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。 碱基特异性修饰及裂解碱基特异性修饰及裂解反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰试剂碱基修饰反应碱基修饰反应主链断裂试剂主链断裂试剂断裂点断裂点G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化六氢吡啶六氢吡啶GG+A甲酸甲酸脱嘌呤作用脱嘌呤作用六氢吡啶六氢吡啶G和和AC+T肼肼嘧
9、啶开环嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶C和和TC肼（加盐）肼（加盐）胞嘧啶开环胞嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶C3） DNA自动化测序自动化测序特点特点原理同末端终止法原理同末端终止法标记物为荧光染料标记物为荧光染料激光扫描自动测序激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高测序速度快测序速度快 200bp/h三、三、3种方法的比较种方法的比较 化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法
10、可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究验来研究DNA二级结构及蛋白质与二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。的相互作用。Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。法只需简单化学试剂。所测序列来自原所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等化等DNA修饰的情况。修饰的情况。但所
11、能测定的长度要比但所能测定的长度要比Sanger法法短一些，它对放射性标记末端短一些，它对放射性标记末端 250个核苷酸以内的个核苷酸以内的DNA序序列效果最佳。列效果最佳。Sanger 法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大法虽需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌肠杆菌DNA 聚合酶聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而随片段的高质量酶制剂，而随着着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今引物容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终止法如今远比远比Maxam-Gilbert法
12、应用得广泛。法应用得广泛。由于由于Sanger法既简便又快速，目前大多数测序策略都是法既简便又快速，目前大多数测序策略都是为为Sanger法而设计的。法而设计的。 DNA自动测序与手工测序的不同点自动测序与手工测序的不同点1）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测）标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用序采用4种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物或标记引物2) 加样方式不同：手工测序，一个样品的加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳
13、3) 检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑四、四、DNA序列测定的应用序列测定的应用1) 测序测序 PCR克隆测序验证 突变体检测 新基因测序 全基因组测序 系统发育及物种鉴定2) 2) 片段分离片段分离 个体识别：亲缘鉴定 SNP关联分析 疾病诊断等26一、在线分析的核心网站一、在线分析的核心网站http:/www.ncbi.nlm.nih.govhttp:/
14、bip.weizmann.ac.ilhttp:/au.expasy.org/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要软件二、本地分析的重要软件Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。及以上的版本：综合分析、载体分析。DNA Star：综合分析：综合分析Primer Premier 5.0：引物设计：引物设计Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算：寡核苷酸分析，引物计算GCG：蛋白质、核酸序列：蛋白质、核酸序列2 2、核苷酸序列的生物信息分析、核苷酸序列的生
15、物信息分析西南大学生物技术专业 基因工程271) Genbank序列检索序列检索氨基酸序列同源性分析碱基序列同源性分子进化树分析亲缘性关系 HUN0801 JS0809 HUN0802 JS0822 HUN0804 JS0819 JS0821 NN0603 BLEN NN1165 Cu-1wt cef94 CU1M BH11 B87 CE Gt GLS YN1161 Harbin-1 NN1163 NN1172 HK46 OKYM UK661591001009510059636699506067675453880.01西南大学生物技术专业 基因工程312) 蛋白序列序列创建分子分析蛋白序列序列创建分子分析
