1、第十章第十章 流式细胞分析流式细胞分析 流式细胞术的定义：流式细胞术的定义：是一种对处在快速直是一种对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的快速定量分析和分选的技术。数的快速定量分析和分选的技术。 流式细胞仪的定义：流式细胞仪的定义：是以激光为光源，集是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的细胞分析仪器。单克隆抗体技术为一体的细胞分析仪器。 什么是流式细胞仪流式细胞仪实物BD FACSVantageB
2、D-Calibur 关键是制备：单细胞悬液。关键是制备：单细胞悬液。流式细胞的样本制备技术流式细胞的样本制备技术流式细胞的检测步骤 1、单细胞悬液、单细胞悬液 2、对测量细胞进行荧光标记染色、对测量细胞进行荧光标记染色 3、流式细胞测量、流式细胞测量 4、对测量结果进行定量分析、对测量结果进行定量分析 5、对测量结果进行生物医学意义解释、对测量结果进行生物医学意义解释可测量的参数 分为：结构参数和功能参数分为：结构参数和功能参数 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态，细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态，DNA，RNA，蛋白
3、质含量，细胞表面抗原，蛋白质含量，细胞表面抗原，碱性蛋白，染色体结构。碱性蛋白，染色体结构。 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷，、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷，pH值，膜电位，酶活性，值，膜电位，酶活性，DNA合成能力，合成能力，膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位，膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位，细胞浆和膜的钙离子活性。细胞浆和膜的钙离子活性。影响因素影响因素 1、荧光染色、荧光染色 2、激光光源的稳定性、激光光源的稳定性 3、细胞流速的稳定性、细胞流速的稳定性 4、细胞悬液样品的影响、细胞悬液样品的影响 分类：分类： 流式细胞仪根据功能不同可分为流式细胞仪根据功能不同可分为临
4、床型和临床型和科研型科研型。 临床型只有分析功能，没有分选功能，操临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。作简便，易学易掌握。 科研型既有分析功能又有分选功能，可快科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。速将所感兴趣的细胞分选出来。 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细提供细胞内某种生物化学成分的参数胞内某种生物化学成分的参数。 狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑狭缝扫
5、描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。的定量资料。 流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类狭缝扫描流式细胞仪狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直径被检细胞直径大于激光光斑直径，大于激光光斑直径，细胞通过光束时各细胞通过光束时各部分被依次扫描。部分被依次扫描。 流式细胞仪的结构可分为流式细胞仪的结构可分为流动室及液流流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测与存贮、显示、分析系统；系统；信号检测与存贮、显
6、示、分析系统；细胞分选系统细胞分选系统等五个部分。等五个部分。 一、流动室与液流驱动系统一、流动室与液流驱动系统 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液流动室内充满了鞘液, ,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液的作用是将样品流环包。 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。胞荧光信息。 由样本和鞘液组成由样本和鞘液
7、组成 待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光荧光染料标记的单抗对其染色染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压受清洁气体压力力 从样品管进入流动室形成样本流从样品管进入流动室形成样本流鞘液作用：辅助样本流被正常检测鞘液作用：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。塞喷孔。喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambea
8、m鞘液鞘液液流系统示意图液流系统示意图FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管（二）激光光源与光束成形系统（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为仅为1s1s左右，且细胞所携带荧光物质被左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到和激发光的强度有
9、关，因此细胞必须达到足够的光照强度。足够的光照强度。 激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/ /短波长，通过短短波长，通过短/ /长长波长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光（三）光学系统（三）光学系统FCMFCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。小孔组成。滤光片主要分为：滤光片主要分为：1.1.长通滤光片长通滤光片 长通滤光片使特定波长以长通滤光片使特定波长以 上的光通过。上的光通过。2.2.短通
10、滤光片短通滤光片 特定波长以下的光通过。特定波长以下的光通过。3.3.带通滤光片带通滤光片 带通滤光片允许一定波长带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过。范围内的光通过。长通滤片短通滤片带通滤片FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图 （四）细胞分选系统（四）细胞分选系统 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。时进行的。细胞悬液形成液
11、流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电分选基本原理分选基本原理二、散射光信号和荧光信号的检测二、散射光信号和荧光信号的检测 散射光信号不依赖任何样品的制备技术散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（如染色），因此称为细胞的物理参数。 前向散射角前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞与细胞的大小有关，在的大小有关，在FCM应用中，常取应用中，常取FSC作阈值，作阈值，来排除样品
12、中的各种碎片。来排除样品中的各种碎片。 侧向散射角侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正与激光束正交交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。正相关。 散射光信号波长与激光相同散射光信号波长与激光相同。2.2.荧光信号荧光信号 当激光光束与细胞正交当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为称为细胞自发荧光细胞自发荧光；另一种是经过特异荧；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光光素标记细胞
13、后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。分析能了解所研究细胞的性质和数量。前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激光束照射细胞时，光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度以相对轴较小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的讯号用于检测细向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图侧向散射光（侧向
14、散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射细激光束照射细胞时，光以胞时，光以9090角散射的讯号，用于检测细胞内部角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。结构属性。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。 此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析
15、表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号 激光的作用原理激光的作用原理 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管，光电倍增管将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 常用荧光染料 目前台式机目前台式机FCM配置配置 488nm激光管常用染料有激光管常用染料有 PI (Propidium Iodide)碘化丙啶碘化丙啶 PE (Phycorey- thrin)藻红蛋
16、白藻红蛋白 FITC (Fluorescein Isothiocyanate)异硫氰酸异硫氰酸荧光素荧光素 PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)叶绿叶绿素蛋白素蛋白 PE-CY5化青素化青素FCMFCM测量数据的存贮、显示和分析 目前目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。列表排队方式，可节省存贮空间。 数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式：据的显示常用以下几种方式：
17、直方图直方图 散点图散点图 等高线图等高线图 密度图密度图 三维图三维图直方图 直方图直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。单位是道数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。纵坐标一般是细胞数。散点图 散点图散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。第三节第三节 流式细胞分析应用流式细胞分析应用一、淋巴细胞亚群分析一、淋
18、巴细胞亚群分析二、二、DNA分析分析三、白血病免疫分型和残余白血病检测三、白血病免疫分型和残余白血病检测四、网织红细胞分析四、网织红细胞分析五、造血干细胞检测五、造血干细胞检测六、器官移植的配型和免疫状态的监控六、器官移植的配型和免疫状态的监控 七、染色体核型分析七、染色体核型分析淋巴细胞亚群分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 各淋巴细胞亚群的各淋巴细胞亚群的百分含量百分含量 淋巴细胞亚群的淋巴细胞亚群的绝对
19、计数绝对计数临床意义 了解在不同情况下体内免疫功能状态了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病免疫系统疾病 免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测肿瘤病人化疗后免疫力检测淋巴细胞亚群分析 根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关 T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+），与细
20、胞免疫有关），与细胞免疫有关 总总T和总和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病性疾病 NK细胞细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。染细胞的细胞毒性作用。FCMFCM的应用血液病学 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病残留白血病 造血干细胞计数造血干细胞计数 PNHPNH诊断诊断 网织红细胞分析网织红细胞分析 血小板分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化血小板活化网织血小板分析网织血小板分析第四节第四节 流式细胞分析仪的流式细胞分析仪的常见故障及维护常见故障及维护 仪器的维护仪器的维护 1.1.激光电源的波动范围应小于激光电源的波动范围应小于10%10%。 2.2.室温在室温在18182424，相对湿度小于，相对湿度小于85%85%。 3.3.安装单独的可靠的地线。安装单独的可靠的地线。 4.4.仪器操作必须有经过培训的人员操作。仪器操作必须有经过培训的人员操作。 5.5.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。
